牛病毒性腹瀉病毒SYBR,Green,Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

1、牛病毒性腹瀉病毒SYBR,GreenfI實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用?D。令Z'csibaskets/all-3-l.htmlHtarget=blank"class="keylink”公司;LightCycler480n熒光定量PCR儀,羅氏公司;2xEasyTaqPCRSuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pCIone007BluntVectorKit,購自北京擎科生物技術(shù)有限公司。13引物的設(shè)計與合成參考GenBank中牛病毒性腹瀉病毒的全基因組核酸序列，設(shè)計特異性擴增BVDV的SYBRGreenI熒光定量PCR引物，由北京擎科生物技術(shù)有限

2、公司合成，引物序列如表1所示。1.4 病毒RNA提取和cDNA合成取200pLBVDV病毒原液，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取BVDV病毒基因組RNA,然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA01.5 陽性標準品的制備以提取的BVDV病毒基因組cDNA為模板，BVDV-F/R為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,回收目的片段，連接至pCIone007載體，鑒定正確的重組質(zhì)粒作為陽性標準品，命名為pCIone007-E2o測定質(zhì)粒濃度,按照以下公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度x10-9x6.02x1023/（660x質(zhì)粒長度）,將pCI

3、one007-E2質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，放于-20冰箱備用。1.6 建立SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法以pCIone007-E2質(zhì)粒為模板，采用方陣法對引物濃度（520pmol/L）退火溫度（5562）進行摸索，最終選取Ct最小值、熒光最高值、熔解曲線特異性明顯的PCR反應條件。采用優(yōu)化完成的反應條件，以10倍梯度稀釋后的陽性標準品pCIone007-E2為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，根據(jù)Ct值繪制標準曲線。1.7 敏感性試驗以稀釋后的標準品為模板，陽性對照以ddH20為模板，進行BVDV的SYBRGreenI實時熒光定量PCR擴增,每個濃度的標準品做3個樣本檢測。同時

4、相同濃度下進行常規(guī)PCR試驗，分析對比兩種方法的敏感性。1.8 特異性獻用已建立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR反應體系，分別以BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV的基因組作為模板,并以ddH20為陰性對照，分析該方法的特異性。1.9 重復性試驗分別取等量的4份不同拷貝（4.87x103copies/pL,4.87x104copies/pL,4.87x105copies/pL,4.87x106copies/pL酌pCIone007-E2重組質(zhì)粒進行熒光定量PCR檢測（同時設(shè)置空白對照），每份拷貝樣品做3個重復，進行批內(nèi)重復性試驗，通過計算Ct值的標準差（S）和變異系數(shù)（CV

5、）驗證熒光定量PCR的批內(nèi)重復性。另外，取以上4份樣品，在同一反應條件下間隔7d重復一次獨立的熒光定量PCR檢測，共重復3次，然后計算Ct值的變異系數(shù)（CV）,驗證此方法的批間重復性。1.10 臨床樣品的檢測采用本試驗建立的IBRVSYBRGreenI實時熒光定量PCR方法檢測5個規(guī)模化奶牛場送檢的67份奶牛腹瀉樣品，同時利用普通PCR進行檢測，比較二者的檢出率,并計算二者的符合率。2結(jié)果與分析2.1質(zhì)粒標準品的鑒定以BVDV基因組cDNA為模板，利用特異性弓|物BVDV-F和BVDV-R進行PCR擴增，得到約185bp左右的目的片段，與預期片段大小相同，無其他非特異性條帶，陰性對照無條帶（圖

6、1%將目的基因進行回收，然后連接至pCIone007載體上。提取質(zhì)粒進行測序,測序結(jié)果與NCBI登錄的標準序列對比,片段插入位置正確，同源性為100%,表明標準質(zhì)粒pCIone007-E2構(gòu)建成功。pCIone007-E2的質(zhì)粒濃度為112ng/pL,總長度為2096bp,經(jīng)計算拷貝數(shù)為4.87x1010copies/pL.2.25 YBRGreenI實時熒光定量PCR方法的建立用優(yōu)化后的反應條件建立標準曲線，其斜率為-3.1389,截距為30.19,相關(guān)系數(shù)為0.9931（圖2）,說明Ct值與10倍梯度稀釋后的陽性標準品之間有良好的線性關(guān)系。SYBRGreenI熒光定量PCR檢測BVDV的熔

7、解曲線顯示，質(zhì)粒標準品均出現(xiàn)了單一波峰，而陰性對照未出現(xiàn)熔點峰（圖3）,表明試驗過程中沒有出現(xiàn)引物二聚體及污染現(xiàn)象，且該引物為特異性擴增。23特異性獻用建立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR方法對BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O進行檢測，發(fā)現(xiàn)只有BVDV檢測為陽性（圖4）,說明該方法有很強的特異性。2.26 感性試驗將標準質(zhì)粒pCIone007-E2作10倍梯度稀釋，用該方法對4.87x107copies/pL至4.87x100copies/瓜的標準質(zhì)粒樣品進行熒光定量PCR檢測。由圖5可知，該方法檢出核酸的最低模板拷貝數(shù)為4.87x101copies/pLo

8、常規(guī)PCR能檢出的核酸最低陽性質(zhì)?？截悢?shù)為4.87x102copies/pL（圖61結(jié)果表明，本源筵立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR方法的敏感性高于普通PCR檢測方法。2.27 復性試驗重復性試驗結(jié)果（表2）表明，批內(nèi)變異系數(shù)為0.07%0.33%，批間變異系數(shù)為0.54%0.71%,表明該方法具有良好的批內(nèi)、批間重復性。2.28 床樣本檢測采用建立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR方法檢測了5個規(guī)?；膛鏊蜋z的67份奶牛腹瀉樣品,BVDV陽性31份，陽性檢出率為46.27%(31/67),而普通PCR陽性檢出率為43.28%(29/67),符合率為106.90%。3討論與結(jié)

9、論牛病毒性腹瀉病毒可引起患病牛呈現(xiàn)發(fā)熱、流涎、下痢、結(jié)膜炎、口腔黏膜糜爛潰瘍，孕牛出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎和胎兒畸形，還會引起牛的免疫抑制以及持續(xù)性感染等問題13。牛病毒性腹瀉病毒在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展的最重要疫病之一14。由于持續(xù)感染，牛可以長期帶毒排毒，是非常危險的傳染源15。因此，關(guān)于牛群的檢測、監(jiān)測與淘汰對于牛病毒性腹瀉的控制非常重要。本研究建立的牛病毒性腹瀉病毒SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法不僅兼具特異性好、敏感性高W重復性好等優(yōu)點，而且操作簡單，易于進行大規(guī)模樣品檢測。此外，利用本方法檢測的樣品采樣方便，可直接檢測病原，為BVDV感染的早期診斷及病原流行病

10、學調(diào)查提供了有效可靠的技術(shù)手段。本研究通過對NCBI上收錄的多個BVDV序列進行比對，針對E2基因上的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，建立了SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法。用該方法檢測BVDV,最低檢測限為4.87x101copies/pL,敏感性比常規(guī)PCRB10倍;檢測IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O等均為陰性，只有檢測BVDV的結(jié)果為陽性，說明該方法的特異性強批內(nèi)變異系數(shù)為0.07%-0.33%,批間變異系數(shù)為0.54%-0.71%,表明該方法重復性高。用建立的熒光定量PCR方法對山東、江蘇和天津3個地區(qū)5個不同牛場的67份牛腹瀉樣品進行檢測，結(jié)果表明，建立的S

11、YBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法陽性樣本檢出準確率高于常規(guī)PCR方法。本試驗建立的牛病毒性腹瀉病毒E2基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法可以高效、準確地確定牛群中是否存在BVDV感染，為今后BVDV的防控和凈化提供了有效的技術(shù)手段，也為BVDV的實驗室研究提供了參考和理論支撐。參考文獻：lLiXP,ZhouWG,GuanPY,etal.ResearchprogressonpathogenesisofbovineviraldiarrhoeavirusJ.ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2018.2Moe

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13、接ELISA方法的建立及臨床應用C中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第二十四次學術(shù)研討會、中國病理生理學會動物病理生理學專業(yè)委員會第二十三次學術(shù)研討會、中國實驗動物學會實驗病理學專業(yè)委員會第三次學術(shù)研討會、中國獸醫(yī)病理學家第三次學術(shù)研討會論文集.2018.鐘發(fā)剛，王新華，沈敏，等.牛病毒性腹瀉病毒野毒株的分離鑒定切.中國預防獸醫(yī)學報，2000,22(6):463-464.7趙丹，王建華，王萬萼.牛病毒性腹瀉-粘膜病的檢測技術(shù)研究進展北檢驗檢疫學刊，2014,24(5):68-70.8王姝.牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及IPMA方法的建立與初步應用D.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2013.9栗

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