板藍(lán)根顆粒開發(fā)方案

1、 板藍(lán)根顆粒 開發(fā)方案n姓名：張銳n學(xué)號(hào)：1522210550015前言前言1新藥申報(bào)與注冊(cè)新藥申報(bào)與注冊(cè)5臨床研究臨床研究4目目錄錄臨床前研究臨床前研究3新藥的尋找新藥的尋找2 新藥的發(fā)現(xiàn) 臨床前研究臨床研究 申報(bào)及后續(xù)工作基礎(chǔ)和應(yīng)用研究基礎(chǔ)和應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)并篩選藥物來源發(fā)現(xiàn)并篩選藥物來源藥學(xué)藥學(xué)藥理學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué)毒理學(xué)期臨床試驗(yàn)期臨床試驗(yàn)期臨床試驗(yàn)期臨床試驗(yàn)期臨床試驗(yàn)期臨床試驗(yàn)填寫新藥申請(qǐng)?zhí)顚懶滤幧暾?qǐng)后續(xù)登記活動(dòng)后續(xù)登記活動(dòng) 新藥研發(fā)項(xiàng)目IV期臨床試驗(yàn)期臨床試驗(yàn)分類及癥狀分類及癥狀中醫(yī)分類：中醫(yī)分類：風(fēng)寒型感冒風(fēng)寒型感冒（怕冷、發(fā)低熱、無汗、頭痛全身痛、痰稀、咳嗽痰為白粘怕冷、發(fā)低熱、無汗、

2、頭痛全身痛、痰稀、咳嗽痰為白粘痰，四肢酸痛、舌苔薄而潤，脈浮痰，四肢酸痛、舌苔薄而潤，脈?。?風(fēng)熱型感冒風(fēng)熱型感冒（高熱、咳嗽痰為黃稠膿性痰，不怕冷，頭痛，咽喉痛，舌高熱、咳嗽痰為黃稠膿性痰，不怕冷，頭痛，咽喉痛，舌苔微黃、口干、出汗多、舌苔白而干燥、脈浮數(shù)（較快）苔微黃、口干、出汗多、舌苔白而干燥、脈浮數(shù)（較快） 暑濕型感冒暑濕型感冒（高熱、頭暈?zāi)X漲、心中燥熱，容易感到疲倦，無汗、口干高熱、頭暈?zāi)X漲、心中燥熱，容易感到疲倦，無汗、口干，伴有嘔吐、惡心，尿量少而黃，舌苔黃膩，伴有嘔吐、惡心，尿量少而黃，舌苔黃膩）西醫(yī)分類：西醫(yī)分類：細(xì)菌性感冒、病毒性感冒細(xì)菌性感冒、病毒性感冒感感 冒冒定義：定

3、義：感冒是由于上呼吸道感染引起的感冒是由于上呼吸道感染引起的 一種自愈性疾病，是包括鼻腔、咽或喉部急一種自愈性疾病，是包括鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱，一般性炎癥的總稱，一般7 d 左右就會(huì)自行康復(fù)。左右就會(huì)自行康復(fù)。板藍(lán)根板藍(lán)根板藍(lán)根板藍(lán)根Radix Isatidis 為十字花科植物菘藍(lán)為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort. 的干燥根，始載于的干燥根，始載于神農(nóng)本草經(jīng)神農(nóng)本草經(jīng)，已有，已有2000多年的歷史。多年的歷史。中中國藥典國藥典1985 年版開始收載。具有年版開始收載。具有清熱解清熱解毒、涼血利咽毒、涼血利咽之功效，臨床上常用于病毒性之功效，臨床上常用于病毒

4、性疾病及細(xì)菌感染性疾病。疾病及細(xì)菌感染性疾病。作用：作用：抗病毒抗病毒（流感病毒、肝炎病毒、單純皰疹病毒、（流感病毒、肝炎病毒、單純皰疹病毒、其他種類病毒）其他種類病毒）抗菌（抗菌（金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、流感桿菌金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、流感桿菌、腦膜炎雙球菌等、腦膜炎雙球菌等） 抗內(nèi)毒素、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛以及增強(qiáng)免疫等抗內(nèi)毒素、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛以及增強(qiáng)免疫等板藍(lán)根板藍(lán)根板藍(lán)根板藍(lán)根化學(xué)成分化學(xué)成分1、有機(jī)酸類化合物、有機(jī)酸類化合物 吡啶三羧酸，順丁烯二酸，吡啶三羧酸，順丁烯二酸，2- 羥基羥基- 1, 4- 苯二甲酸和苯二甲酸和羥甲基糠酸羥甲基糠酸2、生物堿類化合物、生物堿類化合物2.1

5、吲哚類生物堿吲哚類生物堿 2, 5- 羥基吲哚，羥基吲哚，2, 3- 二氫二氫- 4- 羥基羥基- 2- 氧氧- 吲哚吲哚- 3- 乙腈乙腈，吲哚，吲哚- 3- 乙腈乙腈- 6- O- D- 葡萄糖苷，葡萄糖苷， (E)- 二氧羥芐吲哚酮二氧羥芐吲哚酮2.2 喹唑類生物堿喹唑類生物堿 3- ( 2- hydroxyphenyl)- 4- (3H) - quinazolinone和和isaindigotonet2.3 其他類型生物堿其他類型生物堿 依靛藍(lán)雙酮依靛藍(lán)雙酮3、微量元素、微量元素 K，Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Cu，Mn，Pb，Hg，Ce, Co,Ni, Cd 和和As 其中其中Ca,

6、Mn, Zn, Fe 含量較為豐富含量較為豐富4、其他化學(xué)成分、其他化學(xué)成分 告依春、表告依春、告依春、表告依春、1 硫氰基硫氰基-2-羥基羥基-3-丁烯、丁烯、(+)異落葉異落葉松樹脂醇，松樹脂醇，2- 羥基羥基- 3- 丁烯基丁烯基- 硫氰酸酯，硫氰酸酯，1- 硫氰酸硫氰酸- 2- 羥基羥基- 3- 丁烯，丁烯，5 羥甲基糖醛，正丁基羥甲基糖醛，正丁基- D - 吡喃型果糖吡喃型果糖板藍(lán)根板藍(lán)根板藍(lán)根板藍(lán)根新藥臨床前研究內(nèi)容新藥臨床前研究內(nèi)容藥學(xué)評(píng)價(jià)藥學(xué)評(píng)價(jià) 藥材產(chǎn)地、產(chǎn)量、提取路線和制劑工藝、物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案藥材產(chǎn)地、產(chǎn)量、提取路線和制劑工藝、物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案制訂等。制訂等。

7、藥理研究藥理研究 藥效學(xué)、一般藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及可能的作用機(jī)制研究。藥效學(xué)、一般藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及可能的作用機(jī)制研究。 毒理評(píng)價(jià)毒理評(píng)價(jià) 急性毒性、長期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突變）及其它毒急性毒性、長期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突變）及其它毒性（刺激性、溶血、過敏、藥物依賴性）研究性（刺激性、溶血、過敏、藥物依賴性）研究 。一、藥學(xué)評(píng)價(jià)一、藥學(xué)評(píng)價(jià)1板藍(lán)根配方顆粒制備工藝的研究板藍(lán)根配方顆粒制備工藝的研究1.1藥材種類藥材種類板藍(lán)根飲片。板藍(lán)根又稱北板藍(lán)根，氣微，味微甜而苦澀。板藍(lán)根飲片。板藍(lán)根又稱北板藍(lán)根，氣微，味微甜而苦澀。1.2 有效成分有效成分多數(shù)學(xué)者還是認(rèn)可板藍(lán)根中的

8、有效成分為多數(shù)學(xué)者還是認(rèn)可板藍(lán)根中的有效成分為核苷類成分核苷類成分和和表告依春表告依春。1.3提取工藝研究提取工藝研究1.3.1提取方法提取方法：水提醇沉法水提醇沉法 由于表告依春是脂溶性成分，而腺苷是水溶性由于表告依春是脂溶性成分，而腺苷是水溶性成分，所以為了最大限度的提高有效成分的含量，故采用先醇提再水提的提取工成分，所以為了最大限度的提高有效成分的含量，故采用先醇提再水提的提取工藝，增加了板藍(lán)根中有效成分的含量和提取率。提取方式選擇加熱提取方法，即藝，增加了板藍(lán)根中有效成分的含量和提取率。提取方式選擇加熱提取方法，即熱提取法熱提取法，且固液分離時(shí)應(yīng)注意趁熱濾過，使藥效物質(zhì)較少損失。，且固

9、液分離時(shí)應(yīng)注意趁熱濾過，使藥效物質(zhì)較少損失。1.3.2提取工藝路線確定提取工藝路線確定：第一步選擇乙醇作為提取溶劑，以：第一步選擇乙醇作為提取溶劑，以醇濃度、液料醇濃度、液料比、提取時(shí)間比、提取時(shí)間為主要影響因素，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)醇溶液提取最優(yōu)條件為主要影響因素，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)醇溶液提取最優(yōu)條件進(jìn)行優(yōu)化，以其有效成分進(jìn)行優(yōu)化，以其有效成分（表告依春）的含量（表告依春）的含量為考察指標(biāo)；第二步選擇水作為提為考察指標(biāo)；第二步選擇水作為提取溶劑，選擇藥材的取溶劑，選擇藥材的浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間及及次數(shù)次數(shù)等以其等以其核苷類核苷類（尿苷、（尿苷、鳥苷和

10、腺苷）鳥苷和腺苷）和表告依春的總含量和表告依春的總含量為考察指標(biāo)。為考察指標(biāo)。1.3.3 分析方法的建立分析方法的建立1.3.3.1色譜條件的確定色譜條件的確定1.3.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1.3.3.3精密度試驗(yàn)精密度試驗(yàn)1.3.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)穩(wěn)定性試驗(yàn)1.3.3.5重現(xiàn)性試驗(yàn)重現(xiàn)性試驗(yàn)1.3.3.6加樣回收率試驗(yàn)加樣回收率試驗(yàn)1.3.4 醇溶液提取工藝條件的研究醇溶液提取工藝條件的研究1.3.5 醇溶液提取最佳提取工藝的考察醇溶液提取最佳提取工藝的考察1.3.5.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.3.5.2提取工藝的驗(yàn)證性試驗(yàn)提取工藝的驗(yàn)證性試驗(yàn)1.3.6 水溶液提取工藝條件

11、的研究水溶液提取工藝條件的研究1.3.6.1藥材平均吸水量的考察藥材平均吸水量的考察1.3.6.2水提取工藝條件的考察水提取工藝條件的考察1.3.6.3提取工藝的驗(yàn)證性試驗(yàn)提取工藝的驗(yàn)證性試驗(yàn)一、藥學(xué)評(píng)價(jià)一、藥學(xué)評(píng)價(jià)1.4 濃縮、干燥方法的確定濃縮、干燥方法的確定藥材提取后，藥液與藥渣采用藥材提取后，藥液與藥渣采用 120 目濾布趁熱濾過分離；減壓濃縮法，濃目濾布趁熱濾過分離；減壓濃縮法，濃縮至相對(duì)密度縮至相對(duì)密度 1.051.15（80）；采用噴霧干燥法干燥。）；采用噴霧干燥法干燥。1.5 成型工藝條件的確定成型工藝條件的確定制粒方法、輔料、顆粒性質(zhì)進(jìn)行考察，最終確定最佳成型工藝。制粒方法、

12、輔料、顆粒性質(zhì)進(jìn)行考察，最終確定最佳成型工藝。取板藍(lán)根飲片，加入水取板藍(lán)根飲片，加入水 1.5 倍量，浸泡倍量，浸泡 1h 后，用后，用 70%乙醇（液料比乙醇（液料比=12：1），提取），提取 1 次，時(shí)間為次，時(shí)間為 1h，濾過，藥渣進(jìn)行水提，每次加水，濾過，藥渣進(jìn)行水提，每次加水 8 倍量，提取倍量，提取 2 次，每次次，每次1.5h，濾過，合并醇提水提的濾液，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度，濾過，合并醇提水提的濾液，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度1.051.1（580），噴霧干燥，加入糊精適量，干法制粒，干燥，整粒，即得。），噴霧干燥，加入糊精適量，干法制粒，干燥，整粒，即得。1.6 工藝流程圖工藝流

13、程圖1.7包裝材料選擇包裝材料選擇聚丙烯藥品包裝用復(fù)合膜袋聚丙烯藥品包裝用復(fù)合膜袋1.8 規(guī)格的確定規(guī)格的確定1.5g/袋袋1.9 七批小試樣品試驗(yàn)研究七批小試樣品試驗(yàn)研究板藍(lán)根配方顆粒的制備工藝、成品質(zhì)量板藍(lán)根配方顆粒的制備工藝、成品質(zhì)量穩(wěn)定穩(wěn)定1.10 三批中試樣品試驗(yàn)研究三批中試樣品試驗(yàn)研究板藍(lán)根配方顆粒的制備工藝具有可行性板藍(lán)根配方顆粒的制備工藝具有可行性及合理性。及合理性。一、藥學(xué)評(píng)價(jià)一、藥學(xué)評(píng)價(jià)2 板藍(lán)根配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究板藍(lán)根配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究采用薄層色譜（采用薄層色譜（TLC）法對(duì)板藍(lán)根配方顆粒有效成分表告伊春和腺）法對(duì)板藍(lán)根配方顆粒有效成分表告伊春和腺苷進(jìn)行了鑒別，采

14、用高效液相色譜法（苷進(jìn)行了鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)腺苷、鳥苷、尿苷、）對(duì)腺苷、鳥苷、尿苷、表告依春進(jìn)行了含量測定，對(duì)板藍(lán)根配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步的表告依春進(jìn)行了含量測定，對(duì)板藍(lán)根配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步的提高及完善。提高及完善。2.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明2.1.1藥品名稱藥品名稱2.1.2藥材來源藥材來源2.1.3性狀性狀本品為淺黃棕色至棕褐色的顆粒；稍有清香氣，味微苦。本品為淺黃棕色至棕褐色的顆粒；稍有清香氣，味微苦。2.1.4鑒別鑒別表告依春、腺苷的鑒別。表告依春、腺苷的鑒別。2.1.5檢查檢查粒度、水分、溶化性、裝量差異、重金屬、砷鹽、微生物限粒度、

15、水分、溶化性、裝量差異、重金屬、砷鹽、微生物限度度2.1.6浸出物的測定浸出物的測定2.1.7含量測定含量測定 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：板藍(lán)根配方顆粒每袋含板藍(lán)根分別以其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：板藍(lán)根配方顆粒每袋含板藍(lán)根分別以其 4 種成分計(jì)，種成分計(jì)，尿苷不少于尿苷不少于 0.1mg，鳥苷不少于，鳥苷不少于 0.1mg，表告依春不少于，表告依春不少于 0.2mg，腺，腺苷不少于苷不少于 0.1mg。一、藥學(xué)評(píng)價(jià)一、藥學(xué)評(píng)價(jià)3 板藍(lán)根配方顆粒初步穩(wěn)定性的研究板藍(lán)根配方顆粒初步穩(wěn)定性的研究3.1考察內(nèi)容考察內(nèi)容 樣品的性狀、鑒別、含量測定、水分、粒度、溶化性及微生物限度檢查。樣品的性狀、鑒別、含量測定、水分、粒度、溶化性及

16、微生物限度檢查。3.2考察方法考察方法 本藥品為顆粒劑，試驗(yàn)方法采用本藥品為顆粒劑，試驗(yàn)方法采用加速試驗(yàn)加速試驗(yàn)和和長期試驗(yàn)長期試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行同時(shí)進(jìn)行。3.3考察時(shí)間考察時(shí)間 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)：長期穩(wěn)定性試驗(yàn)：0 月、月、3 月、月、6 月，共月，共 3 次。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)：次。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)：0 月、月、1 月月、2 月、月、3 月、月、6 月，共月，共 5 次。次。“板藍(lán)根配方顆粒板藍(lán)根配方顆?！辟A存條件為：貯存條件為：密封密封“板藍(lán)根配方顆粒板藍(lán)根配方顆?！庇行跒椋河行跒椋?8 個(gè)月個(gè)月一、藥學(xué)評(píng)價(jià)一、藥學(xué)評(píng)價(jià)1 板藍(lán)根顆粒的藥效學(xué)研究板藍(lán)根顆粒的藥效學(xué)研究對(duì)甲型流感病毒小鼠的作用對(duì)甲型

17、流感病毒小鼠的作用1.1 動(dòng)物：動(dòng)物：SPF 級(jí)雌性級(jí)雌性BALB / c小鼠，小鼠，80只，只，4 6 周齡周齡(體重體重18 20 g)1.2 分組：分組：小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、達(dá)菲組（陽性對(duì)照組小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、達(dá)菲組（陽性對(duì)照組）、板藍(lán)根組）、板藍(lán)根組4 組。組。1.3 劑量：劑量：板藍(lán)根組的給藥量為板藍(lán)根組的給藥量為4. 67 g / ( kgd)( 參照臨床劑量參照臨床劑量) ，達(dá)菲組，達(dá)菲組的給藥量為的給藥量為0. 03 g / ( kgd)。1.4 方法方法1.4.1鼠的感染性鼠的感染性: 將小鼠乙醚吸入麻醉后，將小鼠乙醚吸入麻醉后，106 TC

18、ID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）病毒液通過滴鼻途徑感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為病毒液通過滴鼻途徑感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為50 L，建立甲型流感病毒，建立甲型流感病毒小鼠模型，對(duì)照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。通過小鼠肺組織的小鼠模型，對(duì)照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。通過小鼠肺組織的PCR、肺、肺組織病理結(jié)果可證實(shí)甲型組織病理結(jié)果可證實(shí)甲型H1N1 病毒小鼠模型的成功建立。病毒小鼠模型的成功建立。1. 4.2 給藥給藥:板藍(lán)根組攻毒板藍(lán)根組攻毒2 h 后灌胃給藥后灌胃給藥200 L、達(dá)菲組攻毒、達(dá)菲組攻毒2 h 后灌胃給藥后灌胃給藥200 L，正常對(duì)照組及模

19、型組灌胃給予生理鹽水，正常對(duì)照組及模型組灌胃給予生理鹽水200 L，每日，每日1 次，連續(xù)用藥次，連續(xù)用藥5 d。二、藥理研究二、藥理研究1.5 觀察與檢查觀察與檢查1.5.1 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo):用于觀察板藍(lán)根對(duì)感染小鼠肺組織的保護(hù)作用的小鼠共觀察用于觀察板藍(lán)根對(duì)感染小鼠肺組織的保護(hù)作用的小鼠共觀察14 d，記錄小鼠的死亡數(shù)及生存天數(shù)，并計(jì)算存活率及延長生命率。用于觀察板藍(lán)根，記錄小鼠的死亡數(shù)及生存天數(shù)，并計(jì)算存活率及延長生命率。用于觀察板藍(lán)根對(duì)甲型對(duì)甲型H1N1 流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用的小鼠在第流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用的小鼠在第5 天安樂，取肺組織留天安樂，取肺組織留做病理檢查

20、。做病理檢查。1.5.2病理學(xué)檢查病理學(xué)檢查:無菌取小鼠的肺，福爾馬林溶液中固定無菌取小鼠的肺，福爾馬林溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，脫水，石蠟包埋、切片，常規(guī)、切片，常規(guī)HE 染色，顯微鏡下下觀察其病理變化。染色，顯微鏡下下觀察其病理變化。1.6 結(jié)果結(jié)果1.6.1板藍(lán)根顆粒對(duì)甲型板藍(lán)根顆粒對(duì)甲型H1N1 流感病毒感染小鼠存活率的影響流感病毒感染小鼠存活率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，板藍(lán)根可明顯降低甲型板藍(lán)根可明顯降低甲型H1N1 流感病毒感染小鼠的死亡率流感病毒感染小鼠的死亡率，與模型組比較差異顯著與模型組比較差異顯著( P 0. 05 ) ，提示板藍(lán)根對(duì)甲型，提示板藍(lán)根對(duì)甲

21、型H1N1 流感病毒感染的小流感病毒感染的小鼠有保護(hù)作用（表鼠有保護(hù)作用（表1）。）。1.6.2板藍(lán)根顆粒對(duì)甲型板藍(lán)根顆粒對(duì)甲型H1N1 流感病毒感染小鼠平均生存天數(shù)及延長生命流感病毒感染小鼠平均生存天數(shù)及延長生命率的影響率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，板藍(lán)根可明顯可延長小鼠的存活天數(shù)板藍(lán)根可明顯可延長小鼠的存活天數(shù)，與模型組比較差異顯，與模型組比較差異顯著，提示板藍(lán)根甲型著，提示板藍(lán)根甲型H1N1 流感病毒感染的小鼠有保護(hù)作用流感病毒感染的小鼠有保護(hù)作用( 表表2)二、藥理研究二、藥理研究1.6.3 病理學(xué)檢查病理學(xué)檢查 空白對(duì)照組動(dòng)物肺臟均未見明顯病理改變。陽性對(duì)照空白對(duì)照組動(dòng)物肺臟

22、均未見明顯病理改變。陽性對(duì)照( 模型模型) 組動(dòng)物感染甲型組動(dòng)物感染甲型H1N1 病毒第病毒第5 天后肺臟呈彌漫性肺炎改變；陽性藥天后肺臟呈彌漫性肺炎改變；陽性藥( 達(dá)菲達(dá)菲) 組部分動(dòng)物組部分動(dòng)物(4 例例/10 例例) 肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致，其余動(dòng)物肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致，其余動(dòng)物(6 例例/10 例例)與模與模型組病變范圍與程度基本一致；型組病變范圍與程度基本一致；板藍(lán)根顆粒組部分動(dòng)物板藍(lán)根顆粒組部分動(dòng)物( 2 例例/10 例例) 肺臟病變范圍肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致，但其數(shù)量較陽性藥較模型組小，病變程度與模型

23、組基本一致，但其數(shù)量較陽性藥( 達(dá)菲達(dá)菲) 組少，其余動(dòng)組少，其余動(dòng)物物(8 例例/10例例) 與模型組病變范圍與程度基本一致。與模型組病變范圍與程度基本一致。具體病變范圍結(jié)果見表具體病變范圍結(jié)果見表3二、藥理研究二、藥理研究1.7 討論討論 板藍(lán)根組可明顯延長甲型板藍(lán)根組可明顯延長甲型H1N1 病毒感染小鼠的存活天數(shù)，提高病毒感染小鼠的存活天數(shù)，提高存活率，與模型組比較差異顯著存活率，與模型組比較差異顯著(P 0. 05) ，提示板藍(lán)根顆粒對(duì)甲型，提示板藍(lán)根顆粒對(duì)甲型H1N1 病毒感染致肺部病變具有減輕作用。病毒感染致肺部病變具有減輕作用。二、藥理研究二、藥理研究2 板藍(lán)根抗病毒成分表告依春

24、在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)板藍(lán)根抗病毒成分表告依春在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)2.1 動(dòng)物：動(dòng)物：SD 大鼠大鼠, 雌雄各半雌雄各半, 體重體重250 300 g2.2 分組：分組：板藍(lán)根溶液組板藍(lán)根溶液組2.3 劑量：劑量：表告依春表告依春6.8 mg/kg 2.4 方法方法2.4.1血漿中表告依春的測定血漿中表告依春的測定2.4.1.1 色譜條件色譜條件2.4.1.2 血漿樣品處理血漿樣品處理2.4.1.3 血漿中表告依春的工作曲線制備血漿中表告依春的工作曲線制備2.4.1.4 回收率和精密度試驗(yàn)回收率和精密度試驗(yàn)2.4.2動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn) SD 大鼠大鼠6只只, 禁食禁食12 h , 可自由飲水可

25、自由飲水, 給藥劑量按表告依春給藥劑量按表告依春6.8 mg/kg 進(jìn)行給藥。灌胃體積進(jìn)行給藥。灌胃體積1 mL/100 g 體重。給藥前及給藥后體重。給藥前及給藥后0.083 , 0.25 , 0.5 , 0.75 , 1 , 2 , 3 , 4 , 6 ,8 , 10 , 12 , 15 h 經(jīng)眼球后靜脈叢取血經(jīng)眼球后靜脈叢取血0.3 mL, 置肝素化試管中置肝素化試管中, 離心取血漿離心取血漿0.1 mL 進(jìn)行分析。給藥進(jìn)行分析。給藥4 h后腹腔補(bǔ)充生理鹽水后腹腔補(bǔ)充生理鹽水1 mL/100 g 體重。體重。二、藥理研究二、藥理研究二、藥理研究二、藥理研究2.4.2數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 用矩

26、量法求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)用矩量法求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), 即即AUC 用梯形面積法計(jì)算用梯形面積法計(jì)算, tmax和和cmax用實(shí)測用實(shí)測值進(jìn)行計(jì)算值進(jìn)行計(jì)算, 用末端相濃度用末端相濃度(3 個(gè)點(diǎn)個(gè)點(diǎn))對(duì)時(shí)間直線回歸后求得末端消除速率常數(shù)對(duì)時(shí)間直線回歸后求得末端消除速率常數(shù)Z , 從從而計(jì)算而計(jì)算t1/2 。并用。并用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。3 毛細(xì)管電泳法研究板藍(lán)根水提物抗流感病毒的作用機(jī)制毛細(xì)管電泳法研究板藍(lán)根水提物抗流感病毒的作用機(jī)制 顯微鏡檢判定板藍(lán)根不同處理方式下的紅細(xì)胞經(jīng)流感病毒侵染后的形態(tài)學(xué)差顯微鏡檢判定板藍(lán)根不同處理方式下的紅細(xì)胞經(jīng)流感病毒侵染后的形態(tài)學(xué)差異異, 通過毛細(xì)管電

27、泳結(jié)合顯微鏡鏡檢、血凝滴度指標(biāo)進(jìn)一步闡述板藍(lán)根抗流感病毒通過毛細(xì)管電泳結(jié)合顯微鏡鏡檢、血凝滴度指標(biāo)進(jìn)一步闡述板藍(lán)根抗流感病毒的生化機(jī)制。的生化機(jī)制。結(jié)果結(jié)果:經(jīng)過板藍(lán)根保護(hù)過的細(xì)胞經(jīng)過板藍(lán)根保護(hù)過的細(xì)胞, 能阻止病毒對(duì)細(xì)胞的吸附能阻止病毒對(duì)細(xì)胞的吸附, 推測其可能是通過與細(xì)推測其可能是通過與細(xì)胞膜的作用來保護(hù)細(xì)胞。胞膜的作用來保護(hù)細(xì)胞。結(jié)論結(jié)論:板藍(lán)根通過結(jié)合到細(xì)胞膜上而起到保護(hù)細(xì)胞的作用板藍(lán)根通過結(jié)合到細(xì)胞膜上而起到保護(hù)細(xì)胞的作用, 有效抑制了流感病毒對(duì)細(xì)有效抑制了流感病毒對(duì)細(xì)胞的結(jié)合胞的結(jié)合, 從而達(dá)到抗病毒的目的。從而達(dá)到抗病毒的目的。二、藥理研究二、藥理研究結(jié)論：板藍(lán)根顆粒對(duì)感冒有一定

28、的治療效果。結(jié)論：板藍(lán)根顆粒對(duì)感冒有一定的治療效果。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)急性毒性、長期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突變）、局部用藥毒性、過敏試驗(yàn)、刺激性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)藥物依賴性試驗(yàn)三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)1板藍(lán)根多糖的毒性試驗(yàn)板藍(lán)根多糖的毒性試驗(yàn)1. 1 材料材料1.1. 1 板藍(lán)根多糖的提取板藍(lán)根多糖的提取 按照常規(guī)水煮醇沉法進(jìn)行提取按照常規(guī)水煮醇沉法進(jìn)行提取,使用前用雙重蒸餾水配制成使用前用雙重蒸餾水配制成1 ml 含多糖含多糖0 067 g，高壓滅菌，高壓滅菌，4冰箱保存?zhèn)溆?。冰箱保存?zhèn)溆谩?. 1. 2 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小白鼠。體重清潔級(jí)昆明小白鼠。體重18 22 g

29、，鼠齡為，鼠齡為6 8 周。雌雄各半。周。雌雄各半。1.2 方法方法1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)及免疫器官指數(shù)的測定急性毒性實(shí)驗(yàn)及免疫器官指數(shù)的測定 將板藍(lán)根多糖用雙蒸水配制成將板藍(lán)根多糖用雙蒸水配制成5 個(gè)濃度，選取個(gè)濃度，選取30 只小白鼠只小白鼠( 體重為體重為20 2 g) 分成分成6組，每組五只，組，每組五只，第六組為空白對(duì)照組，注射生理鹽水，其余五組分別用上述不同濃度的板藍(lán)根多糖腹腔注射，每第六組為空白對(duì)照組，注射生理鹽水，其余五組分別用上述不同濃度的板藍(lán)根多糖腹腔注射，每只各只各2 ml，相同飼養(yǎng)生活條件，飼養(yǎng)兩周時(shí)間，觀察小白鼠的活動(dòng)情況，對(duì)參試小白鼠進(jìn)行稱重，相同飼養(yǎng)生活條件，飼

30、養(yǎng)兩周時(shí)間，觀察小白鼠的活動(dòng)情況，對(duì)參試小白鼠進(jìn)行稱重，采血檢測紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)。采血完畢后，即進(jìn)行第一頸椎脫臼致死，打開腹腔，觀察肝、肺，采血檢測紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)。采血完畢后，即進(jìn)行第一頸椎脫臼致死，打開腹腔，觀察肝、肺、脾的形態(tài)學(xué)變化，并取出其免疫器官脾臟，用濾紙吸干血液后稱重，計(jì)算出脾臟和體重之間的、脾的形態(tài)學(xué)變化，并取出其免疫器官脾臟，用濾紙吸干血液后稱重，計(jì)算出脾臟和體重之間的比值比值( 即為脾臟指數(shù)即為脾臟指數(shù)) 。通常用脾臟指數(shù)來反映機(jī)體的免疫功能，脾臟指數(shù)低則表示機(jī)體的免疫能。通常用脾臟指數(shù)來反映機(jī)體的免疫功能，脾臟指數(shù)低則表示機(jī)體的免疫能力低下，反之則表示免疫功能增強(qiáng)。同時(shí)，

31、采集肝臟、肺臟和脾臟制作組織切片，觀察這些內(nèi)臟力低下，反之則表示免疫功能增強(qiáng)。同時(shí)，采集肝臟、肺臟和脾臟制作組織切片，觀察這些內(nèi)臟器官的組織學(xué)變化。器官的組織學(xué)變化。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)所有小白鼠全部存活，且均未出現(xiàn)異常。所有小白鼠全部存活，且均未出現(xiàn)異常。紅細(xì)胞數(shù)無明顯變化紅細(xì)胞數(shù)無明顯變化白細(xì)胞數(shù)雖有所變化，但差異不顯著白細(xì)胞數(shù)雖有所變化，但差異不顯著三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)板藍(lán)根多糖對(duì)機(jī)體臟器的影響板藍(lán)根多糖對(duì)機(jī)體臟器的影響各組的小白鼠均未出現(xiàn)出血、充血等病理現(xiàn)象，隨機(jī)抽各組的小白鼠均未出現(xiàn)出血、充血等病理現(xiàn)象，隨機(jī)抽取肺臟、肝臟、脾臟等樣本制作切片均無病理變化，說取肺臟、肝臟、脾臟

32、等樣本制作切片均無病理變化，說明明該濃度范圍內(nèi)板藍(lán)根多糖對(duì)機(jī)體無明顯毒副作用。該濃度范圍內(nèi)板藍(lán)根多糖對(duì)機(jī)體無明顯毒副作用。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià) 板藍(lán)根多糖能夠有效地提高小鼠脾指數(shù)，說明板藍(lán)根多糖可以明板藍(lán)根多糖能夠有效地提高小鼠脾指數(shù)，說明板藍(lán)根多糖可以明顯提高小白鼠機(jī)體的免疫功能。顯提高小白鼠機(jī)體的免疫功能。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)小白鼠接受板藍(lán)根多糖注射后，在此濃度范圍內(nèi)，濃度越高，小白鼠接受板藍(lán)根多糖注射后，在此濃度范圍內(nèi)，濃度越高，E 玫玫瑰花環(huán)形成率也越高。血液中瑰花環(huán)形成率也越高。血液中T 淋巴細(xì)胞的比率也就越高，免疫功能淋巴細(xì)胞的比率也就越高，免疫功能越強(qiáng)。越強(qiáng)。三、毒理評(píng)價(jià)

33、三、毒理評(píng)價(jià)1.2.1玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)淋巴細(xì)胞懸液的制備淋巴細(xì)胞懸液的制備: 抓取小白鼠取血，每毫升加抓取小白鼠取血，每毫升加20 IU 肝素肝素( 200 IU/mL 肝素生理鹽水溶液肝素生理鹽水溶液) 抗凝。取抗凝血抗凝。取抗凝血1 mL，加入，加入Hanks液液1 mL，混勻后加在，混勻后加在1 mL 淋巴細(xì)胞分離液上，淋巴細(xì)胞分離液上，2500 r /min，離心，離心10 min，吸出細(xì)胞懸液，用，吸出細(xì)胞懸液，用Hanks液洗滌液洗滌2 次，棄上清，將沉積次，棄上清，將沉積細(xì)胞用細(xì)胞用pH7 4 含含10%小牛血清和小牛血清和HanKs 液配成液配成1 106 2

34、106 個(gè)的細(xì)胞懸液。個(gè)的細(xì)胞懸液。紅細(xì)胞懸液的制備紅細(xì)胞懸液的制備: 新鮮采集的綿羊血液用生理鹽水洗滌、配成新鮮采集的綿羊血液用生理鹽水洗滌、配成1%的綿羊紅細(xì)胞懸液。的綿羊紅細(xì)胞懸液。淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞的作用淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞的作用: 取取0 1 mL 淋巴細(xì)胞懸液與淋巴細(xì)胞懸液與0 1 L 綿羊紅細(xì)胞懸液，置綿羊紅細(xì)胞懸液，置37 水水浴浴5 min，500 r /min，離心，離心5 min，置，置4冰箱冰箱1 2 h。制片觀察制片觀察: 取淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞作用后的細(xì)胞懸液取淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞作用后的細(xì)胞懸液1 滴放置玻片上，瑞姬染色滴放置玻片上，瑞姬染色3 min，顯微，顯微鏡觀察。凡一個(gè)

35、鏡觀察。凡一個(gè)T 淋巴細(xì)胞吸附淋巴細(xì)胞吸附3 個(gè)或個(gè)或3 個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的花結(jié)即為一個(gè)個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的花結(jié)即為一個(gè)Et 玫瑰玫瑰花環(huán)，計(jì)花環(huán)，計(jì)200 個(gè)淋巴細(xì)胞數(shù)，求出個(gè)淋巴細(xì)胞數(shù)，求出Et 玫瑰花環(huán)結(jié)合率。玫瑰花環(huán)結(jié)合率。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)2 板藍(lán)根對(duì)試驗(yàn)性小鼠遺傳毒性的影響板藍(lán)根對(duì)試驗(yàn)性小鼠遺傳毒性的影響2.1 材料與方法材料與方法2.1.1 藥品藥品2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠雌雄各半昆明種小白鼠雌雄各半, 體重體重18 20g 。ICR 小鼠小鼠:雄性雄性, 體重體重18 22g 。2.1.3 板藍(lán)根水煎液的制備板藍(lán)根水煎液的制備取干燥板藍(lán)根取干燥板藍(lán)根10g

36、, 粉碎后放入粉碎后放入500ml去離子水去離子水, 浸泡浸泡30min ;燒杯中煮沸燒杯中煮沸30min , 收集藥液收集藥液;再反復(fù)煎煮再反復(fù)煎煮2 次次, 收集收集3 次藥液次藥液, 一起過濾去渣一起過濾去渣, 沸騰水浴濃縮至沸騰水浴濃縮至10ml , 使藥液每毫升使藥液每毫升相當(dāng)于生藥量相當(dāng)于生藥量1g 。4 冰箱保存待用。冰箱保存待用。2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法2.1.4.1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)方法小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)方法昆明種小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組昆明種小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(生理鹽水生理鹽水, 腹腔注射腹腔注射);陽性對(duì)照組陽性對(duì)照組(30mg kg 環(huán)磷酰胺

37、環(huán)磷酰胺, 腹腔腹腔注射注射);中草藥水煎液誘變組中草藥水煎液誘變組(分成人臨床常用劑量的分成人臨床常用劑量的5 、10 、20 倍組倍組, 灌胃給藥灌胃給藥)。每。每組組4 只動(dòng)物只動(dòng)物, 雌雄各半。雌雄各半。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)將中草藥水煎液按所需劑量稀釋成將中草藥水煎液按所需劑量稀釋成0.1ml 只小鼠只小鼠, 各中草藥水煎液誘變組灌胃給藥各中草藥水煎液誘變組灌胃給藥, 灌灌胃后胃后36h 頸椎脫臼法處死小鼠。陰、陽對(duì)照組分別腹腔注射生理鹽水、環(huán)磷酰胺頸椎脫臼法處死小鼠。陰、陽對(duì)照組分別腹腔注射生理鹽水、環(huán)磷酰胺(0.1ml 只只小鼠小鼠), 注射后注射后24h 頸椎脫臼法處死小鼠。

38、各組動(dòng)物參照改良頸椎脫臼法處死小鼠。各組動(dòng)物參照改良Jagetia 方法制片方法制片:常規(guī)方法取股常規(guī)方法取股骨骨髓腔細(xì)胞骨骨髓腔細(xì)胞, 制成小牛血清細(xì)胞懸液制成小牛血清細(xì)胞懸液, 常規(guī)涂片常規(guī)涂片, 空氣晾干。甲醇固定空氣晾干。甲醇固定, 10 %Giemsa 染色染色。蒸餾水沖洗。蒸餾水沖洗, 干后鏡檢。每只動(dòng)物觀察干后鏡檢。每只動(dòng)物觀察2000 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞個(gè)嗜多染紅細(xì)胞, 觀察含微核的嗜多染紅細(xì)胞觀察含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)數(shù), 計(jì)算其千分率。計(jì)算其千分率。2.1.4.2小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)方法小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)方法ICR 小鼠陰、陽對(duì)照組同微核試驗(yàn)小鼠陰、陽對(duì)照組同微核試驗(yàn);中草藥水煎液誘

39、變組取中草藥水煎液誘變組取10 、2.5 、0.5 倍人臨床常倍人臨床常用劑量。每組用劑量。每組6 只雄性動(dòng)物。只雄性動(dòng)物。將中草藥水煎液按所需劑量稀釋成將中草藥水煎液按所需劑量稀釋成0.1ml 只小鼠只小鼠, 各中草藥水煎液誘變組灌胃給藥各中草藥水煎液誘變組灌胃給藥;同時(shí)同時(shí)陰、陽對(duì)照組分別腹腔注射生理鹽水、環(huán)磷酰胺陰、陽對(duì)照組分別腹腔注射生理鹽水、環(huán)磷酰胺(0.1ml 只小鼠只小鼠)。隔日給藥。隔日給藥, 連續(xù)連續(xù)3 次。首次次。首次給藥給藥4 周后頸椎脫臼法處死小鼠。各組動(dòng)物參照周后頸椎脫臼法處死小鼠。各組動(dòng)物參照Wy robek方法制片方法制片:分離附睪分離附睪, 剪碎剪碎, 濾除組濾

40、除組織碎片織碎片, 制成生理鹽水懸液制成生理鹽水懸液, 常規(guī)涂片。氣干后甲醇固定常規(guī)涂片。氣干后甲醇固定5min , 2 %伊紅染色伊紅染色60min 。蒸餾。蒸餾水沖洗水沖洗, 干后鏡檢。高倍鏡下觀察精子形態(tài)干后鏡檢。高倍鏡下觀察精子形態(tài), 每只動(dòng)物檢查首尾完整的精子每只動(dòng)物檢查首尾完整的精子1000 個(gè)個(gè), 按無鉤按無鉤、無定型、香蕉形、胖頭和多頭多尾分別記數(shù)畸形精子數(shù)及總的精子畸形百分率。、無定型、香蕉形、胖頭和多頭多尾分別記數(shù)畸形精子數(shù)及總的精子畸形百分率。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1 板藍(lán)根的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果板藍(lán)根的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微

41、核試驗(yàn)結(jié)果從表從表1 可見可見, 板藍(lán)根各劑量組誘發(fā)的微核千分率與陰性對(duì)照板藍(lán)根各劑量組誘發(fā)的微核千分率與陰性對(duì)照(生理鹽水生理鹽水)組相比組相比, 均具非常顯著性差異均具非常顯著性差異(P 0.01)。各劑量組之間未見顯著性差異。各劑量組之間未見顯著性差異, , 未表現(xiàn)出明顯的劑量未表現(xiàn)出明顯的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。反應(yīng)效應(yīng)。三、毒理評(píng)價(jià)三、毒理評(píng)價(jià)2.2.2 板藍(lán)根的小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果板藍(lán)根的小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從表從表2 可見可見, 板藍(lán)根各劑量組誘發(fā)的精了畸形百分率與陰性對(duì)照板藍(lán)根各劑量組誘發(fā)的精了畸形百分率與陰性對(duì)照(生理生理鹽水鹽水)相比相比,均具非常顯著性差異均具非常顯著性差異(P 0.01), 且多頭多尾精子所占比例明顯增且多頭多尾精子所占比例明顯增高。各劑量組之間未見顯著性差異高。各劑量組之間未見顯著性差異, 未表現(xiàn)出明顯的劑量未表現(xiàn)出明顯的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。各劑反應(yīng)效應(yīng)。各劑量組誘發(fā)的精子畸形類別及百分率與陽性對(duì)照量組誘發(fā)的精子畸形類別及百分率與陽性對(duì)照(CP)組相比均無明顯差異。組相比均無明顯差異。三、臨床研究三、臨床研究1 臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用1.1 呼吸系統(tǒng)疾病的應(yīng)用。呼吸系統(tǒng)疾病的