皮膚血管瘤組織中細(xì)胞周期素E的陽(yáng)性面積率和平均光密度的表達(dá)

1、皮膚血管瘤組織中細(xì)胞周期素E的陽(yáng)性面積率和平均光密度的表達(dá)    作者：唐吉云 張端蓮 陜聲國(guó) 【關(guān)鍵詞】 皮膚血管瘤；,細(xì)胞周期素E；,陽(yáng)性面積率；,平均光密度, 摘要： 目的: 探討細(xì)胞周期素E(cyclin E)在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。方法：采用免疫組織化學(xué)（SP法），檢測(cè)人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的cyclin E表達(dá)水平，利用圖像分析技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期血管瘤和正常皮膚組織的陽(yáng)性面積率和平均光密度。結(jié)果： 增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞cyclin E表達(dá)水平明顯高于退化期及正常皮膚組織，差異有顯著性意義（P<0.

2、01）；退化期與正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞cyclin E表達(dá)水平差異無(wú)顯著性意義（P>0.05）。結(jié)論： 血管瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。 關(guān)鍵詞： 皮膚血管瘤； 細(xì)胞周期素E； 陽(yáng)性面積率； 平均光密度    血管瘤是嬰幼兒中發(fā)病率最高的一種以?xún)?nèi)皮細(xì)胞異常增殖為組織學(xué)特征的腫瘤。新生兒患病率為1.1%3.8%，至1歲時(shí)可高達(dá)10%。目前成人病歷也逐漸趨上升趨勢(shì)。雖然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持續(xù)發(fā)展或其生長(zhǎng)部位特殊而具有一定的危險(xiǎn)性，如果位于顏面、顱內(nèi)及口腔可引起明顯的畸形及功能障礙，如持續(xù)發(fā)展可產(chǎn)生潰瘍、出血

3、、感染等一系列并發(fā)癥；位于顏面及口腔的血管瘤可引起明顯的外觀畸形及功能障礙，嚴(yán)重影響患者的身心健康。臨床治療尤其對(duì)于大面積血管瘤的治療尚缺乏確切、迅速有效的方法。雖然血管瘤各期的組織形態(tài)學(xué)特征已經(jīng)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法鑒定出來(lái)，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此，也難以尋找到一種有效的治療手段。細(xì)胞周期素E (cyclin E)1是細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)因子, 細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞增殖、分化及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程均有密切的聯(lián)系。我們采用免疫組織化學(xué)（SP法），檢測(cè)人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的cyclin E表達(dá)水平，探討細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin E在血管瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用

4、。 1 材料 11 材料來(lái)源 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科20022005年皮膚血管瘤存檔蠟塊50例，其中男性26例，女性24例，年齡2月67歲，平均32.5歲。血管瘤位于頭皮、眼瞼、耳部、頸部、胸部、上臂、手部及大腿等部位?；颊咝g(shù)前均未做任何輔助性治療。 12 材料分組 蠟塊切片厚5um,常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)血管瘤組織中cyclin E的表達(dá)。按Mulliken2分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將切片分組，其中增生期血管瘤24例，退化期血管瘤26例。另取瘤組織周?chē)Ｆつw5例作為對(duì)照。 2 主要試劑 兔抗人cyclin E 單克隆抗體，通用型 SP免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色試劑盒及多聚賴(lài)氨酸，以上

5、試劑均購(gòu)于福建邁新生物科技開(kāi)發(fā)公司。 3 實(shí)驗(yàn)方法 31 常規(guī) HE染色 32 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)cyclin E相關(guān)抗原 主要步驟：5um組織切片常規(guī)脫蠟至水。cyclin E采用高壓修復(fù)抗原。3過(guò)氧化氫處理10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，正常羊血清封閉10min以減少非特異性著色。一抗37孵育3h后4過(guò)夜。生物素標(biāo)記的二抗處理15min,鏈霉抗生物蛋白過(guò)氧化物酶復(fù)合物處理15min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，人乳腺癌標(biāo)本作為cyclin E陽(yáng)性對(duì)照。 4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 cyclin E以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除

6、胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。 采用HPIAS2000型圖像分析軟件對(duì)cyclin E的表達(dá)進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下染色的陽(yáng)性面積率和平均光密度。以每例5個(gè)視野的陽(yáng)性面積率和平均光密度的平均值作為該例的測(cè)量值。 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)三組樣本陽(yáng)性顆粒的平均光密度和陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。 6 結(jié)果 61 HE染色 增生期血管瘤組織中可見(jiàn)大量增生活躍的內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞核肥大而淡染。退化期血管瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，形成大量的毛細(xì)血管腔，血管間結(jié)締組織增多，內(nèi)皮細(xì)

7、胞核扁平。 62 cyclin E的表達(dá) 增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核中有大量棕黃色顆粒，cyclin E表達(dá)強(qiáng)；退化期和正常皮膚組織中，血管內(nèi)皮細(xì)胞核僅有少量棕黃色顆粒，cyclin E表達(dá)弱。 三組樣本的陽(yáng)性面積率和平均光密度的圖像分析結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)單因素方差分析，三組樣本cyclin E的表達(dá)差異有顯著性意義（P<0.05）。經(jīng)SNK（q）檢驗(yàn)，增生期組與退化期組、增生期組與正常皮膚組的陽(yáng)性面積率和平均光密度的差異有顯著性意義（P<0.01）；退化期組與正常皮膚組上述兩指標(biāo)的差異無(wú)顯著性意義（P>0.05）。    表1 血管瘤不同時(shí)期

8、cyclin E表達(dá)的陽(yáng)性面積率和平均光密度 (略) 注：增生期組與正常皮膚組比較，P0.01；* 增生期組與退化期組比較，P0.01；退化期組與正常皮膚組比較，P0.05。 7 討論 目前較為公認(rèn)的觀點(diǎn)是：血管瘤是一種血管形成性疾病。血管瘤的自然病程包括增生期、退化期和退化完成期三個(gè)階段。病理表現(xiàn)主要為：在增生期，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增生，表現(xiàn)出胚胎性?xún)?nèi)皮細(xì)胞特征，瘤組織中發(fā)生稠密的新血管形成；在未知因素的控制下，血管瘤從增生期轉(zhuǎn)變?yōu)橥嘶谥敝镣嘶瓿善?，?nèi)皮細(xì)胞增生逐漸停止，大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞趨向于凋亡，而原先形成的新生血管逐漸成熟并隨后轉(zhuǎn)向退化。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)血管瘤增生和發(fā)展的臨床及細(xì)胞特征進(jìn)行了

9、大量研究，通過(guò)多種手段將血管瘤各期的組織形態(tài)學(xué)特征和分子標(biāo)記鑒定出來(lái)，并發(fā)現(xiàn)了許多影響血管形成的正性和負(fù)性因子均與血管瘤的病理發(fā)展有關(guān)，同時(shí)確定了一些促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖的生長(zhǎng)因子和激素。這些成分包括多種血管形成因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、蛋白酶及其抑制物、雌激素、自由基、NO等3，它們對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分化、血管樣結(jié)構(gòu)形成以及細(xì)胞間的相互作用等都起著重要作用。我們?cè)诮?年的研究中，對(duì)血管瘤的發(fā)生、發(fā)展的病理機(jī)制進(jìn)行了一系列研究，認(rèn)為在血管瘤病理發(fā)生過(guò)程中，從增生期轉(zhuǎn)變?yōu)橥嘶冢芰鰞?nèi)皮細(xì)胞從增生到趨向于凋亡，存在著血管內(nèi)皮細(xì)胞本身生理、生化和基因的異常；而血管瘤由增生向退化轉(zhuǎn)變的原因則是細(xì)胞

10、間的信號(hào)傳遞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的改變。因此，揭示血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞從增生期轉(zhuǎn)變?yōu)橥嘶诘姆肿由飳W(xué)機(jī)制，必將為血管瘤的防治提供一個(gè)重要的途徑。    細(xì)胞周期（cell cycle）也稱(chēng)細(xì)胞生活周期（cell life cycle）或細(xì)胞增殖周期（cell reproductive cycle）,是指正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期通?？梢詣澐譃?個(gè)連續(xù)的時(shí)相：G1期、S期、G2期和M期,其中G1期、S期、G2期合稱(chēng)為分裂間期（interphase）。一個(gè)親代細(xì)胞依次經(jīng)歷分裂間期和分裂期后，

11、最終形成兩個(gè)遺傳物質(zhì)完全相同的子代細(xì)胞，完成其增殖過(guò)程4。 細(xì)胞周期的順利進(jìn)行依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)外一系列活性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶(CyclindependentKinase,CDK)活性的調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶的依次激活是細(xì)胞周期進(jìn)行的關(guān)鍵，而細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶的活性又受細(xì)胞周期素（cyclins）和細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI）的調(diào)控。 細(xì)胞周期素E (cyclin E) 是細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)因子57,cyclin E 與特定的細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶( cyclin dependentkinases ,CDKs) 構(gòu)成復(fù)合體,可以使底物磷酸化,啟動(dòng)DNA

12、 的合成, CDK 抑制蛋白( cyclindependent kinase inhibitorproteins ,CKIs) 能夠抑制cyclin E 的活性。不同的物質(zhì)可以通過(guò)與CKIs 之間直接或間接的相互作用影響cyclin E 的表達(dá),這些相互作用對(duì)闡明腫瘤發(fā)生的機(jī)制是非常重要的,而且可以為大量常見(jiàn)的腫瘤提供預(yù)后的信息。 近年來(lái)研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成在血管瘤的病理演變過(guò)程中起著重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖、血管迅速生長(zhǎng)是血管瘤病理組織學(xué)的最大特點(diǎn)810。在我們前期對(duì)血管瘤的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)血管瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，在增生期血管瘤組織中cyclinD1、cyclin

13、B、p21的表達(dá)明顯高于在退化期血管瘤組織中的表達(dá)（差異有顯著性），而p15、p16在退化期血管瘤組織中的表達(dá)明顯高于其在增生期的表達(dá)（差異有顯著性）。 在我們的研究中發(fā)現(xiàn)增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞cyclin E呈高表達(dá)，而退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞cyclin E表達(dá)極低，正常皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。顯示cyclin E基因并未作為腫瘤抑制基因起作用，相反cyclin E陽(yáng)性表達(dá)主要為增生期的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，提示cyclin E可能有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的作用。cyclin E在血管瘤發(fā)生發(fā)展的作用分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究和探討。 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的機(jī)制成為血管瘤發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)重要方面。這

14、也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,即細(xì)胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻等一致。而腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，因此我們希望在細(xì)胞周期調(diào)控領(lǐng)域來(lái)對(duì)血管瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理進(jìn)行更深入的研究，找出合適的細(xì)胞周期抑制藥物來(lái)抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及減少血管的形成。 參考文獻(xiàn) 1 Ssoian PK. Anchoragedependent Cell Cycle Progression The Journal of Cell Biology, 1997,136(1):14. 2 Muliken JB, Glowacki J. Hemangiomas and vascular malformations i

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