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文檔簡介

1、 簡并引物：簡并引物：是克隆未知基因的一種引物設(shè)計(jì)方案。簡并引物的出現(xiàn)是出于遺傳密碼的簡并性。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸的保守序列反推到DNA 水平設(shè)計(jì)引物。由于大多數(shù)氨基酸的遺傳密碼不止一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時(shí)，就遇到部分堿基的不確定性。這種不確定性因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，這樣設(shè)計(jì)出來的引物實(shí)際上是多種序列的混和物，在某些位點(diǎn)有所變化，但大部分還是相同的，稱之為簡并引物。 利用利用NCBI搜索不同物種中同一目的基搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列編碼的氨基酸序列。 因?yàn)椴煌锓N的密碼子偏好問題，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，

2、所以氨基酸序列才是真正保守的。 對所找到的序列進(jìn)行多序列比對對所找到的序列進(jìn)行多序列比對 將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對 確定合適的保守區(qū)域確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計(jì)簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50400個氨基酸為宜，使得PCR產(chǎn)物在1501200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個氨基酸。 利用軟件設(shè)計(jì)引物利用軟件設(shè)計(jì)引物Primer 5.0 支持簡并引物的設(shè)計(jì)在線設(shè)計(jì)：CODEHOP GeneFisher2 對引物的修飾對引物的修飾降低簡并度的方法：通過用次黃嘌呤代替簡并度高的堿基通過密碼子偏好選擇合適的堿基 利用軟件設(shè)計(jì)引物利用軟件設(shè)計(jì)引物Primer 5.0 支持簡并引物的設(shè)計(jì)在線設(shè)計(jì)：CODEHOP GeneFisher2 對引物的修飾對引物的修飾降低簡并度的方法：通過密碼子偏好選擇合適的堿基通過用次黃嘌呤代替簡并度高的堿基 盡量選擇簡并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)。如甲硫氨酸和色氨酸均只有一個密碼子。盡可能不用含有亮氨酸、精氨酸、絲氨酸的肽段。 充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。 引物不要終止于簡并堿基，對于大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物3末端

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