供體淋巴細(xì)胞在GVHD模型小鼠組織器官中遷移和分布的動(dòng)態(tài)觀察

1、供體淋巴細(xì)胞在GVHD模型小鼠組織器官中遷移和分布的動(dòng)態(tài)觀察              作者：溫宏升，王健民，周虹，夏榮，邱慧穎，高磊，胡曉霞【摘要】  本研究應(yīng)用小鼠GVHD模型探討異基因T淋巴細(xì)胞在移植受體體內(nèi)的遷移和分布。將C57BL/6 的骨髓細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因熒光C57BL/6 小鼠的脾淋巴細(xì)胞輸入經(jīng)8 Gy全身照射的BALB/c小鼠，建立eGFP 標(biāo)記供體淋巴細(xì)胞的GVHD小鼠模型；應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀測GVHD模型中eGFP+細(xì)胞的分布；ELISA法

2、檢測GVHD靶組織中趨化因子MIP-1水平的改變。結(jié)果表明：輸入脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞第8天后出現(xiàn)GVHD臨床及病理表現(xiàn);GVHD模型中，受體鼠肝、皮膚、腸、脾、肺、舌有eGFP+ 細(xì)胞浸潤;GVHD小鼠肝、脾eGFP+ 細(xì)胞中CD4+ 、CD8+ 細(xì)胞比例均逐漸升高;GVHD鼠脾、肝組織中MIP-1水平升高，脾中MIP-1水平高峰出現(xiàn)于移植后第3天，肝中MIP-1水平高峰出現(xiàn)于移植后第7天。結(jié)論：除肝、腸、皮膚外，肺、舌可能也是GVHD靶器官。肝、脾組織中供體淋巴細(xì)胞浸潤伴隨MIP-1水平的升高。 【關(guān)鍵詞】  小鼠GVHD模型; T淋巴細(xì)胞；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Migr

3、ation and Distribution of Allogeneic T Lymphocytes in  Organs of  Graft-Versus-Host Disease Mouse  ModelAbstractThis study was aimed to  investigate the migration and distribution processes of allogeneic donor T lymphocytes in the organs of recipient mice.  GVHD model was es

4、tablished by transfusion of the splenocytes of eGFP transgeneic C57BL/6 mice together with born marrow cells harvested from  C57BL/6 mice into BALB/c mice underwent 8.0 Gy total body irradiation. The migration and homing of eGFP+ cells were tracked by stereo-fluorescent microscopy or inverted f

5、luorescent microscopy and  flow cytometry. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was performed on supernatants from the tissue  homogenates to detect the amount of MIP-1. The results indicated that GVHD clinical manifestation and pathological changes of organs appeared on day 8 pos

6、t transplantation.  eGFP-positive donor T cells in recipient organs were  observed by inverted fluorescence microscope in frozen section, or by stereo-fluorescence microscopy in living organs, such as liver, spleen, skin, lungs, bowels, and tongue.  The highest expression of MIP-1

7、0; was on day 7 post transplantation in the liver (491.3±32.1 pg/ml), and day 3 post transplantation in the spleen (881.5± 45.2 pg/ml)，respectively (P0.05).  It is concluded that  GVHD was induced by splenocytes of eGFP transgeneic C57BL/6 mice. eGFP+ cells in the organs can be o

8、bserved by fluorescent microscopy. In this GVHD model, donor T cells proliferate and infiltrate in liver, skin, bowels, as well as lungs and tongue.  MIP-1  may be in  relation  with  the infiltration of T lymphocytes in  liver and spleen.Key wordsmurin GVHD model; 

9、; T lymphocytes; splenocytes;  enhanced green fluorescence protein;  macrophage inflammatory protein-1（MIP-1）移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease,GVHD）是異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）臨床應(yīng)用的主要并發(fā)癥之一。目前公認(rèn)GVHD是由供體T淋巴細(xì)胞在宿主體內(nèi)被激活,并攻擊靶組織所引起，但對異基因T淋巴細(xì)胞在受體體內(nèi)的遷移、組織分布及激活過程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范圍也存在一定爭議。我們建立了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enh

10、anced green fluorescence protein, eGFP) 標(biāo)記供體淋巴細(xì)胞的GVHD小鼠模型，觀察了GVHD模型中eGFP+ T淋巴細(xì)胞的分布與激活，為GVHD防治研究提供基礎(chǔ)資料。材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、 C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均為6-8周齡，購自上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。eGFP-Tg- C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周齡，由第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室提供。實(shí)驗(yàn)材料PE labeled anti-mouse CD4，PE-cy5 labeled anti-mouse CD8 為Biolegend 公司產(chǎn)品

11、。小鼠MIP-1 ELISA檢測試劑盒為R&D公司產(chǎn)品。供體小鼠骨髓、脾細(xì)胞懸液的制備與檢測頸椎脫位法處死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，無菌取其雙側(cè)的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制備骨髓細(xì)胞懸液及脾細(xì)胞懸液。以PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度至107/ml。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色提示骨髓細(xì)胞懸液及脾細(xì)胞懸液中活細(xì)胞在95以上。流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞中CD4+  T、CD8+ T淋巴細(xì)胞百分比。GVHD模型的建立用60Co-線 全身照射受體BALB/c 雌性小鼠(8.0 Gy,劑量率為0.5 Gy/min)，于6-12 小時(shí)內(nèi)每只鼠經(jīng)尾靜

12、脈輸入8×106骨髓細(xì)胞(BMC)+15×106脾細(xì)胞(SC)。分組 A組18只BALB/c鼠，輸C57BL/6鼠BMC + eGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B組5只BALB/c鼠，輸C57BL/6鼠BMC；C組BALB/c鼠5只，輸eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMC+ C57BL/6鼠SC。造血重建移植后第1、3、 5、11、13天，檢測外周血細(xì)胞數(shù)。移植后第13天，制備骨髓細(xì)胞懸液片，在Olympus70倒置熒光顯微鏡下觀察。骨髓細(xì)胞懸液染色體檢查采用短期培養(yǎng)法，顯微鏡下計(jì)數(shù)Y染色體的分裂相比例，共觀察10個(gè)分裂相。GVHD觀察死亡時(shí)WBC0.5×1

13、09/L為移植失敗，WBC1.0×109/L并具有以下癥狀者為GVHD 發(fā)生:倦怠、納差、體重減輕、弓背、亂毛、脫毛、腹瀉甚至死亡。以25天為觀察期限，觀察小鼠的GVHD發(fā)生情況和生存時(shí)間。取肝、腸、皮膚組織,用4%中性甲醛固定,石蠟包埋，常規(guī)切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。eGFP+ 淋巴細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布取A組小鼠，麻醉后，去毛，切開鼠胸腹部，暴露肝、脾、腸、肺、腎，皮膚、舌、腦、骨等。用Leica MZFL 立體熒光顯微鏡觀察，拍照，曝光時(shí)間0.4-1.9秒。取A組小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、單個(gè)腎臟、腸、皮膚、肺、腦實(shí)質(zhì)、舌、腎臟等，冰凍切片（厚10 m）

14、，在Olympus 70倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。以未輸入eGFP細(xì)胞小鼠的各組織及冰凍切片分別作對照，排除背景熒光。MIP-1水平和T細(xì)胞亞群檢測取肝、脾、單個(gè)腎臟，置于200目不銹鋼網(wǎng)中輕輕碾碎，以1 ml PBS分別收集細(xì)胞，   500×g 離心 6分種，取上清，行MIP-1  ELISA檢測，按試劑盒說明書操作，測450 nm OD值。采用Curve Expert1.3 軟件作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本OD值對應(yīng)的濃度值。流式細(xì)胞術(shù)檢測肝、脾、腎細(xì)胞懸液中eGFP+ 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及以eGFP+ 細(xì)胞設(shè)門的CD4+、CD8+ 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 &

15、#160;       統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理, 生存分析采用Kaplan-Meier分析方法；樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果小鼠骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞中CD4+ 、CD8+細(xì)胞百分比檢測結(jié)果見表1。由表1可見，eGFP-Tg-C57BL/6小鼠脾細(xì)胞（SC）懸液中CD4+  T或CD8+  T淋巴細(xì)胞含量與C57BL/6小鼠相似，CD4+  T均在20左右，CD8+ T均在13左右 。據(jù)此推測兩種小鼠在引發(fā)GVHD方面沒有區(qū)別。這兩種小鼠骨髓細(xì)胞中T 淋巴細(xì)胞含量均極少，約為2

16、。因此，單輸骨髓細(xì)胞可能不足以引發(fā)GVHD。移植后造血重建移植后第3天WBC降至最低值，第8天后WBC恢復(fù)至大于1.0×109  ，第13天WBC恢復(fù)至3.0×109 以上。移植后第13天后C組鼠的骨髓細(xì)胞大多為eGFP+細(xì)胞(圖1)，說明其來源于供體eGFP-Tg-C57BL/6鼠。染色體檢查顯示受者雌性小鼠骨髓細(xì)胞10個(gè)分裂相中，8/10-10/10可見Y染色體。Table 1. Percentages of CD4+,CD8+ cells in bone marrow cells (BMC)and splenocytes(SC) of the mice（略）

17、eGFP+ 淋巴細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布立體熒光顯微鏡、熒光倒置顯微鏡觀察顯示，A組小鼠肝、皮膚、腸、脾、肺、舌有eGFP+細(xì)胞浸潤(圖2)；腎、腦、骨、心肌、骨骼肌等組織中均未見eGFP+細(xì)胞浸潤。可見肝、皮膚、腸、肺、舌等組織第13天eGFP+細(xì)胞多于第3天。而脾組織第13天eGFP+細(xì)胞少于第3天(圖3)。GVHD表現(xiàn)及轉(zhuǎn)歸A組小鼠移植后第8天開始出現(xiàn)GVHD表現(xiàn),主要為消瘦、弓背、脫毛、亂毛、體重減輕和腹瀉,最后全部在25天內(nèi)死亡。出現(xiàn)GVHD表現(xiàn)小鼠的肝、腸符合急性GVHD的病理改變: 肝組織顯著水腫，細(xì)胞濁腫、變性,可見灶性壞死，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤； 腸組織學(xué)表現(xiàn)黏膜脫落，腺體及絨毛水

18、腫、壞死、糜爛，可見淋巴樣圓形細(xì)胞浸潤（圖4）。單輸骨髓細(xì)胞的B組小鼠無GVHD表現(xiàn)，肝、腸結(jié)構(gòu)基本正常。A組、B組小鼠生存曲線比較表明，A組小鼠生存率明顯小于B組小鼠(圖5) (P0.05)。第3、7、13天， eGFP+ 細(xì)胞比例，在肝細(xì)胞懸液中逐漸增多，從18.4±3.4%升高至70.8±5.3%；脾細(xì)胞懸液中逐漸減低，從60.7±8.3%降低至27.8±4.3%。肝、脾eGFP+ 細(xì)胞中CD4+ T、CD8+ T淋巴細(xì)胞比例均逐漸升高（表2）。Table 2. Percentages of eGFP+ cells in the cell susp

19、ensions and percentages of CD4+ ,CD8+ cells in eGFP+ cells (略)肝、腎及脾臟中MIP-1 的表達(dá)與腎臟中MIP-1水平相比，肝、脾中MIP-1水平顯著升高（P0.05）;移植后第3天脾MIP-1水平最高，為881.5± 45.2 pg/ml，肝中MIP-1高峰水平出現(xiàn)在第7天，達(dá)491.3±32.1 pg/ml (圖6)。討論本研究將C57BL/6鼠骨髓細(xì)胞與轉(zhuǎn)eGFP基因的C57BL/6鼠脾細(xì)胞一起植入經(jīng)8.0 Gy照射的BALB/c 鼠體內(nèi)，成功建立了GVHD模型。eGFP可作為標(biāo)記，用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可

20、以直接檢測供體T淋巴細(xì)胞在受體鼠體內(nèi)的浸潤、擴(kuò)增情況。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可用于觀察供體細(xì)胞的分布及動(dòng)態(tài)變化，為GVHD的發(fā)生機(jī)理及防治研究提供了方法平臺(tái)。 目前認(rèn)為，激活的CD4+ T淋巴細(xì)胞分泌免疫應(yīng)答發(fā)生必需的細(xì)胞因子，激活CD8+ T淋巴細(xì)胞，使其成為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，從而攻擊受者細(xì)胞引發(fā)GVHD1，2。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，由于供者小鼠骨髓中T淋巴細(xì)胞含量極少，單純輸注供者骨髓細(xì)胞，雖然也能實(shí)現(xiàn)植入和供者型造血重建，但無GVHD發(fā)生。同時(shí)輸注異基因脾細(xì)胞可使受者小鼠發(fā)生GVHD，在GVHD靶器官中出現(xiàn)受者T淋巴細(xì)胞的浸潤和增殖。我們觀察到受者脾與肝中eGFP細(xì)胞呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)變化：肝中eGFP細(xì)胞

21、逐漸增多，而脾中eGFP細(xì)胞逐漸減少。這一結(jié)果提示，供體T淋巴細(xì)胞在移植初期可能先進(jìn)入脾等淋巴器官，在異基因抗原作用下，激活、擴(kuò)增后，離開脾，進(jìn)入肝、腸等GHVD靶器官。但不能排除肝、皮膚、腸等GHVD靶器官中存在供體T淋巴細(xì)胞的激活與擴(kuò)增。例如最近有學(xué)者研究表明，供體T淋巴細(xì)胞可在肝、脾、肺中直接與抗原呈遞細(xì)胞相互作用而激活、擴(kuò)增3。經(jīng)典GVHD靶器官主要是肝、腸和皮膚組織，GVHD的臨床分級也主要根據(jù)這3個(gè)組織的損傷程度。臨床資料表明，GVHD與移植后的許多并發(fā)癥均有聯(lián)系，如間質(zhì)性肺炎、黏膜炎癥或潰瘍、出血性膀胱炎、味覺喪失等。有研究顯示，腦、腎、牙齦、結(jié)締組織、舌、鼻腔等組織中均可見供體

22、淋巴細(xì)胞浸潤，并將它們稱之為非經(jīng)典GVHD靶器官4-6。本研究采用熒光顯微鏡觀測eGFP+ 細(xì)胞的分布，在肝、腸、皮膚、肺、舌中發(fā)現(xiàn)eGFP+ 細(xì)胞浸潤，這提示除肝、腸和皮膚等傳統(tǒng)GVHD靶器外，肺、舌也是潛在GVHD靶器官。我們在腎、腦、肌肉等組織中未觀察到明顯的eGFP+ 細(xì)胞浸潤，可能與腎、腦中供體淋巴細(xì)胞浸潤較少或?qū)嶒?yàn)觀測方法的敏感性有關(guān)。MIP-1是一種重要的趨化因子，活化后的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞均可產(chǎn)生MIP-1。T淋巴細(xì)胞有MIP-1的受體CCR5、CCR7等的表達(dá)，MIP-1對T淋巴細(xì)胞有趨化作用7。有研究表明，異基因造血干細(xì)胞移植的動(dòng)物的肝、脾組織中MI

23、P-1, MIP-2 和 MIG水平升高；皮膚組織中可見 MIP-1, MIP-2, MCP-1 和 MCP-3 水平升高8，9。本研究發(fā)現(xiàn)，GVHD模型中肝、脾組織的MIP-1水平升高，表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在第7天和第3天。國外有研究也顯示，移植后第3天淋巴組織中趨化因子MIP-1表達(dá)上調(diào)，在脾中MIP-1由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。肝中MIP-1表達(dá)晚于淋巴組織 ，由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，并與供者T淋巴細(xì)胞浸潤一致，用MIP-1單克隆抗體或輸入MIP-1-/- 供體T淋巴細(xì)胞的方法,均可減少受體肝中CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤，而且血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT) 水平和肝GVHD特異性病理表現(xiàn)均較輕9-12。這說明可能存在一個(gè)反饋機(jī)制，肝浸潤T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生MIP-1，吸引CD8+T 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞進(jìn)入肝臟?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Ferrara JL. Pathogenesis of acute graft-versus-host disease: cytokines and c