乳酸鏈球菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的研究

1、32飼料資源開發(fā)與利用2006,No.5糧食與飲料工業(yè)CEREAL &FEED I N D USTRY收稿日期:2005-12-08;修回日期:2006-04-13作者簡介:季偉(1980-,男,碩士研究生,研究方向為飼料添加劑。乳酸鏈球菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的研究季偉,徐學明(江南大學食品學院,江蘇無錫214036摘要:利用產(chǎn)N isin 的乳酸鏈球菌WX506固態(tài)發(fā)酵豆粕,以N isin 的效價、生物量作為主要指標,考察了單因素條件對發(fā)酵的影響,并進行了正交優(yōu)化,確定了一個合適配方,發(fā)酵粕的生物量達到1.03g/kg,N isin 效價達到997I U /g 。關(guān)鍵詞:DC W;N isi

2、n;正交優(yōu)化;固態(tài)發(fā)酵;豆粕中圖分類號:S816.6文獻標識碼:A 文章編號:1003-6202(200605-0032-03N isin 是由一些乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種小分子多肽抗菌物質(zhì)或細菌素,分子式為C 143H 228N 42O 37S 7,由34個氨基酸殘基組成。N isin 能抑制大部分G +菌及其芽孢的生長和繁殖,如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿球菌屬以及梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的細菌,特別是對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯。能有效地延長食品、飼料貨架期,對人畜無毒無害,是高效無毒的天然防腐劑1、2。近來還發(fā)現(xiàn)N isin 可用于治療胃和十二指腸潰瘍、口腔潰瘍和皮膚病

3、,對奶牛乳腺炎有治療作用,因而具有醫(yī)藥價值,發(fā)展前景廣闊。乳酸鏈球菌是一種可以分解糖類產(chǎn)生乳酸、N isin 的益生菌,兼性厭氧生長,對胃中的酸性環(huán)境有一定的耐受性。在動物體內(nèi)通過生物拮抗、降低pH 值、阻止和抑制致病菌的侵入和定植,降低亞硝氨、氨、吲哚和糞臭素等有害物質(zhì),從而維持腸道的正常菌群平衡3。目前,利用乳酸菌發(fā)酵豆粕已有研究,但利用產(chǎn)N isin 的乳酸鏈球菌發(fā)酵豆粕尚未報道。豆粕經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后有酸甜芳香的氣味,pH 值下降,能有效改善豆粕的適口性,提高畜禽的免疫能力,促進畜禽生長、增加體重、提高飼料轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)性能。利用產(chǎn)N isin 的乳酸鏈球菌發(fā)酵豆粕,可以延長貨架期;作為乳豬

4、飼糧組成部分,還可以減少乳豬斷奶時的應(yīng)激反應(yīng),能夠增強機體的抗病能力,降低腹瀉發(fā)生率,提高仔豬的日增重。同時可以降低抗生素、酸化劑的添加量,降低飼料成本。筆者研究了利用產(chǎn)N isin 乳酸鏈球菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的條件。1材料和方法1.1實驗材料N isin 標準樣品:sig ma 產(chǎn)品;豆粕:江蘇無錫中盛飼料公司提供,粉碎過60目篩,粗蛋白含量為48.2%。1.2菌種乳酸鏈球菌WX506:N isin 產(chǎn)生菌,本實驗室篩選保藏。黃色微球菌(M icr ococcus luteus :購自中國微生物菌種保藏中心,N isin 效價檢測指示菌。1.3主要培養(yǎng)基C M 培養(yǎng)基L:蔗糖10g 、蛋白胨10

5、g 、酵母膏10g 、KH 2P O 410g 、NaCl 2g 、M gS O 40.2g 、pH 值6.8;MRS 培養(yǎng)基L:葡萄糖20g 、蛋白胨15g 、牛肉膏15g 、酵母膏7.5g 、乙酸鈉7.5g 、檸檬酸三胺2g 、K 2HP O 42g 、MgS O 40.3g 、pH 值6.9;LB 培養(yǎng)基L:蛋白胨10g 、牛肉膏5g 、酵母膏1g 、NaCl 5g 、pH 值7.2;M17培養(yǎng)基L:蛋白胨10g 、牛肉膏5g 、酵母膏2.5g 、VC 0.5g 、Na 2HP O 412H 2O 2g 、M gS O 40.3g 、pH 值6.9;M17GS 培養(yǎng)基L:蛋白胨10g 、

6、牛肉膏5g 、酵母膏2.5g 、VC 0.5g 、Na 2HP O 412H 2O 2g 、MgS O 40.3g 、蔗糖2g 、pH 值6.9;豆粕培養(yǎng)基:m (豆粕m (水=11,補加碳源、磷源、生長因子等(進行優(yōu)化篩選,pH 值6.9、115,滅菌20m in;檢測培養(yǎng)基L:蛋白胨8g 、酵母膏5g 、葡萄糖5g 、NaCl 5g 、Na 2HP O 412H 2O 2g 、吐溫8010m l 、瓊脂7.5g 、pH 值6.8。1.4實驗方法1.4.1菌株培養(yǎng)條件用接種環(huán)接一環(huán)WX506于50m l C M 培養(yǎng)基中,200r/m in,30培養(yǎng)24h,體積分數(shù)5%接種到豆粕培養(yǎng)基中,3

7、0靜止培養(yǎng)48h 。1.4.2發(fā)酵樣效價測定取1g 發(fā)酵豆粕加入到9m l 0.02mol/L 鹽酸稀溶液中,或用0.02mol/L 稀鹽酸將發(fā)酵豆粕適當稀釋(稀釋到其抑菌圈直徑在5100I U /m l 的乳鏈菌肽標準液的抑菌圈直徑之間,沸水浴加熱5m in 后,5000r/m in 離心10m in,取上清液,用瓊脂擴散法測定其生物效價4。1.4.3發(fā)酵樣中乳酸鏈球菌數(shù)測定稱取0.5g 樣品置于4.5m l 無菌水中(無菌操作,用無菌水稀釋810倍,涂布平板,30培養(yǎng)24h,數(shù)出菌落的個數(shù),換算成細胞生物干重(DC W 。2結(jié)果與討論2.1不同培養(yǎng)基對N isin 產(chǎn)生的影響分別接種乳酸鏈

8、球菌WX506種子液于MRS 、LB 、M17、C M 四種發(fā)酵培養(yǎng)基中,30,200r/m in 搖床培養(yǎng),24h 后測定發(fā)酵液效價、pH 值和生物量(OD 600n m ,結(jié)果見表1。從表1可知,MRS 培養(yǎng)基雖然有利于菌體生長,但N isin 效價遠不如C M 培養(yǎng)基,因此,我們選擇以C M 培養(yǎng)基作為對照,優(yōu)化豆粕培養(yǎng)基的組成。表1不同培養(yǎng)基對N isin 產(chǎn)生的影響培養(yǎng)基效價/I U m l-1pH 值OD 600MRS7644.94 1.21M17GS 1161 4.010.96M171017 4.050.98C M618594.19 1.042.2添加麩皮對豆粕發(fā)酵的影響由于乳酸

9、鏈球菌WX506為兼性厭氧微生物,添加麩皮能增加豆粕間隙,有利于菌體生長。由圖1可知,添加2g 麩皮的N isin 產(chǎn)量最高,4g 麩皮的菌體生長最好。 麩皮/g (100g 豆粕-1圖1添加麩皮對豆粕發(fā)酵的影響2.3碳源對豆粕發(fā)酵的影響豆粕中雖然含有少量糖分,但是遠不能滿足微生物生長需要。以豆粕為基礎(chǔ),添加不同的碳源進行發(fā)酵(每100g 豆粕添加1g ,以豆粕發(fā)酵作為對照,結(jié)果見表2。由表2可見,補加葡萄糖最有利于菌體生長,補加蔗糖產(chǎn)N isin 效果最好。其原因可能是菌株WX506和其它產(chǎn)生乳鏈菌肽的乳酸鏈球菌一樣,編碼乳鏈菌肽前體的結(jié)構(gòu)基因與蔗糖發(fā)酵基因緊密連鎖在一起,而且有一個有效的磷

10、酸烯醇式丙酮酸依賴型磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)作為蔗糖的吸收、運輸及代謝的途徑5。表2不同碳源對豆粕發(fā)酵的影響碳源DC W /g kg -1N isin /I U g -1葡萄糖0.713562甘露糖0.544490果糖0.403462半乳糖0.438454山梨糖0.179424木糖0.208412麥芽糖0.403528乳糖0.475512蔗糖0.649674纖維二糖0.416482玉米粉0.234427糊精0.209421可溶性淀粉0.192414對照0.1653942.4蔗糖對豆粕發(fā)酵的影響 從圖2可以看出,補加1.5g 的蔗糖效價較高,補加量再增時,效價降低,同時過高的蔗糖濃度對N isin 產(chǎn)生有

11、抑制作用,所以,100g 豆粕補加1.5g 的蔗糖比較合適。以后的實驗除特別說明外,均添加了1.5g 的蔗糖。蔗糖/g (100g 豆粕-1圖2蔗糖對豆粕發(fā)酵的影響2.5磷源對豆粕發(fā)酵的影響通常認為磷酸鹽的主要作用是由于它們具有較強的緩沖能力,能夠緩沖在發(fā)酵過程中由于乳酸的產(chǎn)生而造成的培養(yǎng)基pH 值下降,從而有利于N isin 的產(chǎn)生。以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在100g 豆粕中添加2g 麩皮、1.5g 蔗糖、1g 酵母膏的前提下,添加1g 的不同的磷源進行發(fā)酵,結(jié)果見表3。從表3可知,所選用的幾種磷酸鹽都較好的促進了N isin 的產(chǎn)生,其中以K 2HP O 4為最好。表3不同磷源對豆粕發(fā)酵的

12、影響磷源DC W /g kg -1效價/I U g -1KH 2P O 40.674521K 2HP O 40.632501(NH 4H 2P O 40.628489(NH 42HP O 40.619456Na 3HP O 40.629492Na 2HP O 40.6425082.6K 2HP O 4對豆粕發(fā)酵的影響以豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在100g 豆粕中添加2g 麩皮、1.5g 蔗糖、1g 酵母膏,添加不同濃度的K 2HP O 4進行發(fā)酵,結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,K 2HP O 4添加量在1.5g 以下時,對發(fā)酵液效價有較大的影響,對生長影響不大。K 2HP O 4為1.5g 時,發(fā)

13、酵液效價達到最高值;當K 2HP O 4添加量超過2g 或更高時,就會對N isin 合成產(chǎn)生一定的抑制作用,對菌體生長也有影響。K 2HP O 4/g (100g 豆粕-1圖3K 2HP O 4對豆粕發(fā)酵的影響2.7酵母膏對豆粕發(fā)酵的影響乳酸鏈球菌是一類對營養(yǎng)要求較高的菌種,氮源可被利用的難易程度必然影響該菌的初級代謝,從而影響N isin 的產(chǎn)量。另外,N isin 生產(chǎn)需要稀有氨基酸等生長因子,而酵母膏中含有這些生長因子,因此,在培養(yǎng)基中適量添加酵母膏有利于菌體生長,有利于N isin 生產(chǎn)6。如圖4所示,100g 豆粕中添加1g 酵母膏,N isin 產(chǎn)量最高。酵母膏/g (100g

14、豆粕-1圖4酵母膏對豆粕發(fā)酵的影響2.8NaCl 對豆粕發(fā)酵的影響在C M 培養(yǎng)基中,NaCl 也是一種主要的營養(yǎng)成分,NaCl 對豆粕發(fā)酵的影響見圖5。從圖5中可以看出,NaCl 添加量0.2g 為最佳,生長量與N isin 產(chǎn)量均為最高,添加量超過0.4g 時,效價明顯降低,生長量也降低。因此,選擇添加0.2g 的NaCl 。 NaC l/g (100g 豆粕-1圖5NaCl 添加量對豆粕發(fā)酵的影響2.9硫酸鎂對豆粕發(fā)酵的影響在以上優(yōu)化的基礎(chǔ)上,添加不同量的MgS O 4對豆粕發(fā)酵的影響,結(jié)果如圖6所示。由圖6可見,MgS O 4添加量改變對菌體的生長沒有明顯的影響,添加0.02g 的M

15、gS O 4對N isin 合成有一定的促進作用,但是添加量過高會降低N isin 的產(chǎn)量。這可能是由于Mg 2+可通過保護細胞質(zhì)膜的完整性來增強N isin 對主要肽酶N isP 的免疫力,或是降低了N isin 在細胞表面的吸附 。M gS O 4/g (100g 豆粕-1圖6添加MgS O 4對豆粕發(fā)酵的影響2.10吐溫80的添加對豆粕發(fā)酵的影響吐溫80作為一種表面活性劑,可降低細菌菌體與培養(yǎng)基表面之間的表面張力,能刺激多種胞外酶的產(chǎn)生,它也可以影響某些微生物細胞的膜通透性,促進營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞及代謝產(chǎn)物排出體外。吐溫80會促進包括N isin 在內(nèi)的一些細菌素的生產(chǎn),Huot 等研究表

16、明,吐溫80對乳酸乳球菌J46產(chǎn)生的細菌素有明顯的促進作用,并使發(fā)酵單位有了大幅度提高7。因此,在以上優(yōu)化的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加不同量的吐溫80對豆粕發(fā)酵的影響,結(jié)果見圖7。從結(jié)果可以看出,添加吐溫80并沒有顯示出明顯的促進作用,相反,當吐溫80添加量超過0.5m l 時,反而會使生長量降低,N isin 發(fā)酵效價降低。吐溫80/m l (100g 豆粕-1圖7吐溫80對豆粕發(fā)酵的影響3正交實驗在以上單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過L 18(37正交優(yōu)化設(shè)計考察各因素對豆粕發(fā)酵的整體影響,見表5。從極差分析結(jié)果可以看出,影響N isin 產(chǎn)生的各組分的主次順序依次為:蔗糖、K 2HP O 4、麩皮、酵

17、母膏、NaCl 、MgS O 4、吐溫80,影響菌體生物量各組分的主次順序依次為:蔗糖、麩皮、酵母膏、NaCl 、K 2HP O 4、M gS O 4、吐溫80。最優(yōu)水平組合為12組,生物量、N isin 產(chǎn)量均為最高。表5L 18(37正交優(yōu)化設(shè)計表與結(jié)果編號麩皮g 蔗糖g 酵母膏g KH 2PO 4g NaClg 吐溫80m l 100g -1MgS O 4gN isin I U g -1DC W g kg -112 1.20.8 1.20.10.00.01662.90.7322 1.5 1.0 1.50.20.50.02789.30.8132 1.8 1.2 1.80.3 1.00.03

18、914.30.8943 1.20.8 1.20.2 1.00.03625.70.7153 1.5 1.0 1.80.30.00.01817.90.8363 1.8 1.2 1.20.10.50.02907.10.8874 1.20.8 1.80.20.50.03561.40.6784 1.5 1.2 1.50.1 1.00.01704.30.7694 1.80.8 1.80.20.00.02780.00.80102 1.2 1.2 1.80.30.50.03895.70.87112 1.50.8 1.20.3 1.00.02694.30.75122 1.8 1.2 1.50.10.00.039

19、97.10.94133 1.2 1.2 1.00.1 1.00.02625.70.71143 1.50.8 1.00.20.00.03732.90.77153 1.80.8 1.50.30.50.01616.40.70164 1.2 1.0 1.50.30.00.02612.90.70174 1.50.8 2.00.10.50.03789.30.81184 1.8 1.0 1.00.2 1.00.01840.00.84R 665.711070.71598.57791.00446.43199.29211.43R 3.416.173.281.702.621.020.984結(jié)論蔗糖為乳酸鏈球菌發(fā)酵豆

20、粕的最佳碳源,K 2HP O 4對發(fā)酵也有促進作用。通過單因素實驗、正交實驗,優(yōu)化了豆粕發(fā)酵的培養(yǎng)基組成,其最優(yōu)配方為:每100g 豆粕添加麩皮2g 、蔗糖1.8g 、酵母膏1.2g 、K 2HP O 41.5g 、NaCl 0.1g 、M gS O 40.03g,水100g,其生物量達到0.94I U /g,N isin 最高效價達到997I U /g 。參考文獻1W inkowski K,B runo M E C,Montville T J.Correlati on of B i oen 2ergetic /para meters with Cell Death in L isteria

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