RT-PCR(包括引物設(shè)計)

1、實時熒光定量實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用技術(shù)的原理及應(yīng)用(Real time Quantitative PCR)中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院內(nèi)內(nèi) 容容 提提 綱綱q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實時熒光定量技術(shù)的應(yīng)用實時熒光定量技術(shù)的應(yīng)用PCR： 國王和象棋的故事N = 264 -1 = 18446744070309551615PCR：偉大的天才發(fā)明CYCLE NUMBERA

2、MOUNT OF DNA01122438416532664712882569512101,024112,048124,096138,1921416,3841532,7681665,53617131,07218262,14419524,288201,048,576212,097,152224,194,304238,388,6082416,777,2162533,554,4322667,108,86427134,217,72828268,435,45629536,870,912301,073,741,824311,400,000,000321,500,000,000331,550,000,0003

3、41,580,000,000PCR原理簡介PCR：理想與現(xiàn)實l 反應(yīng)效率差異的累積使終點定量幾乎不可能l 終點檢測，與看家基因?qū)φ?，所謂 半定量：不可接受。實時熒光定量實時熒光定量PCR定義定義 在在PCRPCR反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)，利用熒光，利用熒光信號累積信號累積實時監(jiān)測實時監(jiān)測整個整個PCRPCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理定量原理原理定量原理介紹三個概念：介紹三個概念： 擴增曲線、熒光閾值、擴增曲線、熒光閾值、CtCt值值如何對起始模板定量？如何對起

4、始模板定量？通過通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板起始模板進(jìn)行定量分析進(jìn)行定量分析通過通過看家基因看家基因和和目的基因目的基因的的Ct值進(jìn)行相對定量值進(jìn)行相對定量實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 擴增曲線擴增曲線擴增曲線圖：擴增曲線圖： 橫坐標(biāo)：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強度 每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)熒光檢測元件熒光檢測元件實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 原理原理 -熒光閾值熒光閾值熒光信號閾值熒光信號閾值 （threshold threshold ）：q 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的

5、熒光背景值和陰性對照的熒光值q 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍q 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99q 真正的信號:熒光信號超過域值實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定義值的定義： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t) value 實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重現(xiàn)性橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量縱軸：熒光信號量CtCt值的特點值的特點：相同

6、模板進(jìn)行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線q 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小q Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量Sample實時熒光定量PCR原理 絕對定量2

7、5以各自樣本中內(nèi)參（housekeeping）基因為標(biāo)桿，比較兩樣本中目的基因的相對豐度- Ct法法 成立條件：內(nèi)參基因成立條件：內(nèi)參基因 (houskeeping gene) 在相互比較的樣本在相互比較的樣本之間表達(dá)豐度相同之間表達(dá)豐度相同 滿足條件：內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴增效率接近滿足條件：內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴增效率接近 - 正負(fù)正負(fù)10%實時熒光定量PCR原理 相對定量講講 座座 提提 綱綱q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實驗設(shè)計及應(yīng)用q 實時熒光定

8、量實時熒光定量PCRPCR原理原理q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實驗設(shè)計及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記：非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記：特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 實時熒光定量實時熒光定量PCR - DNA PCR - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記產(chǎn)物的熒光標(biāo)記如如 何何 選選 擇？擇？實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 方法方法 1 -1 -SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作機理q SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部

9、位q SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光q 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光q 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation溫度溫度熒光強度熒光強度Tm-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲線分析融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確

10、非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物SYBR Green SYBR Green 法法 優(yōu)缺點優(yōu)缺點 q 對DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNAq 使用方便 -不必設(shè)計復(fù)雜探針q 非常靈敏q 便宜優(yōu) 點q 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件q 對引物特異性要求較高缺 點與目標(biāo)序列互補實時熒光定量實時熒光定量PCR PCR 方法方法2 -TaqMan2 -TaqMan法法TaqMan-水解型雜交探針v 5端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)v 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基

11、團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光TaqManTaqMan法法 優(yōu)缺點優(yōu)缺點q 對目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定q 設(shè)計相對簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補q重復(fù)性比較好優(yōu) 點q 只適合一個特定的目標(biāo)q 委托公司標(biāo)記，價格較高q 不易找到本底低的探針缺 點講講 座座 提提 綱綱q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPC

12、R實驗設(shè)計及應(yīng)用實驗設(shè)計及應(yīng)用q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹q 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR法法 染料法舉例染料法舉例實驗步驟實驗步驟流程示意圖流程示意圖TaqManTaqMan法舉例法舉例 材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備q從正常肺組織中提取的從正常肺組織中提取的總總 RNA RNA q從肺癌組織中提取的從肺癌組織中提取的 總總RNARNA-Trizol -Trizol - -裂解液裂解液 （氰酸胍，異硫氰酸呱，（氰酸胍，異硫氰酸呱， SDSSDS）-

13、 -液氮液氮-RNA-RNA保存液保存液 小心小心DNADNA污染！污染！- -使用使用DEPCDEPC處理相關(guān)器材處理相關(guān)器材 最常用最常用反應(yīng)體系反應(yīng)體系 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) DEPC H2O 下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？檢測何種剪接體？是否會有二級結(jié)構(gòu)干擾？ 檢測靈敏度是否足夠？ 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇逆轉(zhuǎn)錄引物選擇常用常用一步法一步法 or 兩步法？兩步法？兩步法：步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢 測多個基因。便于反應(yīng)優(yōu)化。推薦：工作的初期階段推薦：工作的初期階段 RealSYBR RealSYBR 二步法熒光定量二步法熒光定量PC

14、RPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX RealSYBR RealSYBR 一步法熒光定量一步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX RealSuper RealSuper 二步法熒光定量二步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX一步法：一步法：簡便、快捷但只做一個基因，一旦失敗 難以查找原因。 推薦：工作的成熟階段推薦：工作的成熟階段 （實際上：不推薦）（實際上：不推薦） RealSuper RealSuper 一步法熒光定量一步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROXPCR體系M

15、aster mix的選擇 DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs TemplateReal-time PCR cDNA關(guān)鍵關(guān)鍵Real-time PCR 總原則與普通PCR相同 避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu) 盡量小些 （70 - 300bp) 目標(biāo)區(qū)段位置：考慮目標(biāo)剪接體 推薦做跨intron設(shè)計EXON 1EXON 2INTRON 2DNADNAEXON 1EXON 2RNARNA引物設(shè)計引物設(shè)計PRIMER PREMIER 5.0上機操作上機操作點擊運行程序運行程序點擊點擊保存保存結(jié)果分析結(jié)果分析對照對照樣品樣品Trouble shootingHouseke

16、eping geneHousekeeping gene 無信號無信號RNARNA降解降解用新鮮組織提取用新鮮組織提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信號有信號而目標(biāo)基因無信號而目標(biāo)基因無信號1. 1. 目的基因表達(dá)低。目的基因表達(dá)低。 逆轉(zhuǎn)錄效率不高逆轉(zhuǎn)錄效率不高2. PCR2. PCR引物不良引物不良1. 1. 富集富集mRNA mRNA 2. 2. 在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。在逆轉(zhuǎn)錄中嘗試不同引物，如特異引物。3. 3. 嘗試不同嘗試不同PCRPCR引物。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)引物。減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo) 區(qū)段，考慮不同剪接體

17、。區(qū)段，考慮不同剪接體。4. 4. 嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。嘗試不同熱循程序，降低復(fù)性溫度。Housekeeping geneHousekeeping gene反應(yīng)效率正常反應(yīng)效率正常, ,但但目標(biāo)因放大效率不高目標(biāo)因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新設(shè)計引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段，重新設(shè)計引物，減小產(chǎn)物大小，改換目標(biāo)區(qū)段，考慮不同剪接體考慮不同剪接體目標(biāo)基因表達(dá)豐度在目標(biāo)基因表達(dá)豐度在樣本之間異常一致樣本之間異常一致RNARNA被基因組被基因組DNADNA污染污染使用跨使用跨intronintron 引物引物用用DNaseDNase處理處理RNARNA確保確保RNARNA陰性對照表現(xiàn)陰性陰性對照表現(xiàn)陰性溶解曲線出現(xiàn)雜峰溶解曲線出現(xiàn)雜峰出現(xiàn)非特異出現(xiàn)非特異PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物出現(xiàn)引物二聚體出現(xiàn)引物二聚體嘗試不同嘗試不同PCRPCR引物引物嘗試不同熱循程序，升