復(fù)黃片止血抗炎消腫抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、復(fù)黃片止血抗炎消腫抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究                       作者：韓向暉 陸金根 曹永清 安紅梅 花永強(qiáng) 尤圣富【摘要】  目的圍繞止血、抗炎消腫、抗菌等方面，進(jìn)行復(fù)黃片的主要藥效學(xué)研究。方法應(yīng)用小鼠斷尾止血和家兔凝血實(shí)驗(yàn)，建立大鼠角叉菜膠肛門(mén)腫脹和大鼠蛋清足跖腫脹模型，分別觀察復(fù)黃片止血及抗炎消腫作用；采用試管法和平皿法評(píng)價(jià)復(fù)黃片體外

2、抗菌作用。結(jié)果復(fù)黃片連續(xù)給藥7 d，能明顯縮短小鼠斷尾出血時(shí)間、家兔凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，減輕大鼠肛周組織腫脹和足跖腫脹，對(duì)多種致病菌尤其是腸道菌具有明顯的抑制作用。結(jié)論復(fù)黃片具有顯著的凝血止血、消腫抗炎和抗菌藥理作用。 【關(guān)鍵詞】  復(fù)黃片 痔瘡 止血作用 抗炎 抗菌Abstract:ObjectiveTo investigate the pharmacological actions of Fuhuang Tablet including hemostasis, anti-inflammation, anti-swelling, and antibacteria. Method

3、sThe hemostatic and thrombotic effects of Fuhuang Tablet were tested by severing tail and test-tube method, respectively; Carrageenan-induced perianal swelling in rats and albumen-induced hind paw edema in rats were prepared; the antibacterial activity in vitro was evaluated by tube two-fold dilutio

4、n and plate method. ResultsFuhuang Tablet significantly shortened bleeding time in mice and coagulation time, prothrombin time in rabbits in a dose-dependent manner, obviously eliminated perianal swelling, greatly prevented rat hind paw edema, and effectively inhibited all of the pathogenic bacteria

5、 tested (especially intestinal pathogenic bacteria).ConclusionFuhuang Tablet showed significantly hemostastic, antibacterial, anti?inflammatory, and anti?swelling effects.Key words:Fuhuang Tablet;  Hemorrhoid;  Hemostasis;  Anti-inflammatory;  Antibacteria    痔瘡是臨床

6、常見(jiàn)的肛腸疾病之一，隨著對(duì)痔瘡病因、病理及機(jī)制研究的進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到非手術(shù)治療是治療該疾病的首選方法。據(jù)統(tǒng)計(jì)約有80%的肛腸疾病患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的便血，因此便血已成為肛腸疾病的第一大癥狀。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院研制的復(fù)黃片系中醫(yī)外科權(quán)威顧伯華教授和陸金根教授幾十年治療便血為主痔瘡疾患之經(jīng)驗(yàn)處方，已在龍華醫(yī)院使用了二十多年，經(jīng)過(guò)上萬(wàn)例臨床研究證實(shí)其總有效率達(dá)97.12 %1，目前作為中藥六類新藥開(kāi)發(fā)并申報(bào)。本研究根據(jù)復(fù)黃片的功能主治和臨床應(yīng)用，并按照新藥審評(píng)辦法和中藥新藥研究指南要求2，從止血、抗炎消腫、抗菌等方面進(jìn)行了主要藥效學(xué)研究，為其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 

7、材料與儀器1.1  藥品與試劑復(fù)黃片干浸膏粉，深褐色粉末，批號(hào)：061106，上海交通大學(xué)藥學(xué)院上海聯(lián)合實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供，每克干膏粉相當(dāng)于11.03 g生藥；痔寧片，三九企業(yè)集團(tuán)湖南南開(kāi)制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)20060502；安絡(luò)血，上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，批號(hào)060801；阿司匹林腸溶片，上海信誼百路達(dá)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：0654007；凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒Lot：010703A， ISI<1.3，天津美德太平洋科技有限公司生產(chǎn)；角叉菜膠，Sigma 公司產(chǎn)品，批號(hào)046k01，臨用前生理鹽水配制成10 g/L的溶液；烏拉坦，中國(guó)醫(yī)藥 (集團(tuán))上海化學(xué)試

8、劑公司產(chǎn)品，批號(hào)：20030308，臨用前以生理鹽水配制成200 g/L的溶液；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20061116；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：F20061109。1.2  儀器PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；HH-W21-420型電熱恒溫水浴箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；游標(biāo)卡尺，上海量具刃具廠生產(chǎn)，測(cè)量范圍0155 mm，精確度為0.02 mm；800B型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2004B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。1.3  動(dòng)物昆明種小鼠， SPF級(jí)，體重1822

9、g；SD大鼠，SPF級(jí)，體重200250 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2003-0003號(hào)；新西蘭白兔，SPF級(jí)，體重22.5 kg, 購(gòu)于上海寶牧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2003-0007號(hào)；所有動(dòng)物雌雄各半，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.4  菌株金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003株、沙門(mén)氏菌CMCC(B)50094株、大腸桿菌CMCC(B)44102株、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501株、白色念珠菌CMCC(F)98001株購(gòu)于上海東標(biāo)藥檢器材有限公司，甲型溶血性鏈球菌、肺炎球菌、痢疾桿菌系臨床分離

10、株。2  方法2.1  止血實(shí)驗(yàn)2.1.1  出血時(shí)間的測(cè)定3昆明種小鼠60只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，給予0.9 % 生理鹽水；復(fù)黃片低、中、高劑量組，分別給予復(fù)黃片干膏粉0.24，0.48，0.96 g?kg-1?d-1；痔寧片對(duì)照組，給藥劑量為1.92 g?kg-1?d-1；安絡(luò)血對(duì)照組，給藥劑量為2.5 mg?kg-1?d-1；所有動(dòng)物均灌胃給藥（ig），給藥體積為0.1 ml/g，1次/d，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后1 h, 將小鼠置于特制的固定器中,于小鼠尾端1.5 cm處剪斷, 開(kāi)始計(jì)時(shí)，待血液自行流出, 用濾紙吸血, 吸時(shí)勿

11、用力擠壓斷面，直至出血自然停止，記錄出血時(shí)間。2.1.2  凝血時(shí)間的測(cè)定4取家兔40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)均分為5組：空白對(duì)照組，ig 0.9% 生理鹽水；復(fù)黃片低、中、高劑量組，ig復(fù)黃片干膏粉0.12，0.24，0.48 g?kg-1?d-1；痔寧片對(duì)照組，ig 痔寧片0.48 g?kg-1?d-1；給藥體積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后1 h, 自兔耳中央動(dòng)脈采血1 ml，輕輕沿管壁放入內(nèi)徑8 mm，長(zhǎng)10 mm的試管內(nèi)。當(dāng)血液吸進(jìn)注射器即開(kāi)始用秒表計(jì)時(shí)，每隔半分鐘輕輕傾斜試管1次，角度約30°，觀察血液是否流動(dòng)，直至試管血液不再流動(dòng)而完

12、全凝固為止，停止計(jì)時(shí)，所歷時(shí)間即為凝血時(shí)間，室內(nèi)溫度20。記錄凝血時(shí)間并計(jì)算凝血時(shí)間縮短百分率。    凝血時(shí)間縮短百分率（%）= (對(duì)照組平均凝血時(shí)間-給藥組平均凝血時(shí)間)對(duì)照組平均凝血時(shí)間×100 %2.1.3  血漿凝血酶原時(shí)間(PT)的測(cè)定4血漿制備：末次給藥后1 h, 用一次性真空采血針同時(shí)采血1.8 ml, 放入加有0.109 mol/L (3.2%)枸櫞酸鈉溶液0.2 ml的真空采血管中，顛倒混合8次，充分混勻后以3 000 r/min離心15 min，分離血漿。PT試劑復(fù)溶：PT試劑恢復(fù)至室溫后，按PT測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)確加入P

13、T復(fù)溶液混勻，置37預(yù)溫30 min。凝血酶原時(shí)間測(cè)定：采用手工法測(cè)定各組動(dòng)物PT值。取5個(gè)試管，每管分別加入兔血漿0.1 ml，37孵育3 min，加入已預(yù)溫置37的PT試劑，混均后立即放入37水浴中溫育，同時(shí)開(kāi)動(dòng)秒表，每隔23 s輕輕傾斜試管1次，至纖維蛋白凝固，液體停止流動(dòng)或出現(xiàn)顆粒為止，立即停止計(jì)時(shí)，記錄PT值（s）。取5管平均值作為凝血酶原時(shí)間最終測(cè)定結(jié)果。2.2  消腫抗炎實(shí)驗(yàn)2.2.1  角叉菜膠致大鼠肛周組織腫脹實(shí)驗(yàn)5取大鼠50只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為5組：模型組，ig 0.9 % 生理鹽水；復(fù)黃片低、中、高劑量組，ig復(fù)黃片干膏粉0.19，0.3

14、8，0.76 g?kg-1?d-1；痔寧片對(duì)照組，ig 痔寧片0.96 g?kg-1?d-1；給藥體積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d。其中在第3次給藥后1 h, 烏拉坦ip麻醉(1.0 g/kg)，肛門(mén)內(nèi)直腸粘膜下漿肌層注入1%角叉菜膠0.1 ml, 分別于6，24，48，72，96 h以游標(biāo)卡尺測(cè)整個(gè)肛門(mén)周圍組織腫脹的直徑，取其長(zhǎng)短兩直徑的均值，作為所測(cè)量腫脹程度的指標(biāo)。2.2.2  蛋清所致大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)4取大鼠60只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，ig 0.9 % 生理鹽水；復(fù)黃片低、中、高劑量組，ig復(fù)黃片干膏粉0.19，0.38，0.76

15、g?kg-1?d-1；痔寧片對(duì)照組，ig 痔寧片0.96 g?kg-1?d-1；阿司匹林對(duì)照組，ig阿司匹林100 mg?kg-1?d-1。給藥體積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d，注射蛋清當(dāng)日先用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只大鼠右后足跖正常厚度，然后給藥，末次給藥1 h后, 以注射器先自右后足跖中部皮下注射蛋清0.05 ml/只致炎，然后用游標(biāo)卡尺在相同部位分別測(cè)量各鼠致炎后0.5，1，2，4，6，24 h右足跖厚度，連續(xù)測(cè)兩次，取其平均值判斷足跖腫脹程度。比較給藥組和空白對(duì)照組的腫脹差異程度，計(jì)算足跖腫脹度及腫脹抑制率。    大鼠足跖腫脹度(mm)=致炎后足

16、跖厚度(mm)-致炎前足跖厚度(mm)    腫脹抑制率（%）=空白組足跖腫脹度均值-給藥組足跖腫脹度均值空白組足跖腫脹度均值×100 %2.3  體外抑菌試驗(yàn)22.3.1  試管法（肉湯稀釋法）用蒸餾水分別配制復(fù)黃片和痔寧片溶液，實(shí)驗(yàn)濃度為 300 g/L，pH 7.07.2。8種實(shí)驗(yàn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1618 h，并用營(yíng)養(yǎng)肉湯作1/1 000稀釋。取無(wú)菌試管若干支，用液體培養(yǎng)基(葡萄糖酚紅肉湯)等倍稀釋藥物后，各管加0.1 ml供試菌液，同時(shí)設(shè)藥物對(duì)照管、培養(yǎng)基對(duì)照管和菌液對(duì)照管，37培養(yǎng)24 h后取出觀察結(jié)果

17、，在對(duì)照管符合要求的情況下，逐一觀察各試驗(yàn)管，以仍然保持紅色的試管的藥物最高稀釋度濃度判定為最低抑菌濃度(MIC)的終點(diǎn)。2.3.2  平皿法（瓊脂稀釋法）用蒸餾水分別配制復(fù)黃片和痔寧片溶液，實(shí)驗(yàn)濃度為220 g/L，然后用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行等倍稀釋。取16個(gè)無(wú)菌平皿，分為復(fù)黃片組和痔寧片組，每組8個(gè)平皿，編號(hào)。1號(hào)平皿加入藥液3 ml；2號(hào)平皿加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂8 ml、藥液2 ml，濃度為44 g/L；3號(hào)平皿加入未稀釋的藥液1 ml；48號(hào)平皿分別加入等倍稀釋的藥液1 ml，備用。然后向1和2號(hào)平皿內(nèi)分別加入已熔化并冷卻至40左右的牛肉膏湯瓊脂培養(yǎng)基7 ml和8 ml，38號(hào)平皿內(nèi)加入

18、營(yíng)養(yǎng)瓊脂9 ml，立即搖動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與藥液充分混勻。待瓊脂凝固后，制成含藥平板培養(yǎng)基。用接種環(huán)（經(jīng)過(guò)標(biāo)定每環(huán)0.05 ml）分別蘸取各實(shí)驗(yàn)菌液以劃線接種于每個(gè)含藥平板的不同區(qū)域，每種藥物、每種細(xì)菌做6個(gè)劃線區(qū)域。接種好后放入37孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h取出，觀察不同細(xì)菌在不同濃度的藥物平板上的生長(zhǎng)情況。將含有3個(gè)菌落的瓊脂平板中藥物濃度定為最低抑菌濃度（MIC）。2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理除抗菌實(shí)驗(yàn)外，所有數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較均采用Student's t test檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。百事通3  結(jié)果3.1  復(fù)黃片的止血及促凝血作用3.1.1

19、60; 對(duì)小鼠斷尾止血時(shí)間的影響給藥7 d后，給藥各組小鼠的止血時(shí)間與空白對(duì)照組比較均明顯縮短，有顯著性差異。其中復(fù)黃片低、中、高劑量組動(dòng)物的止血時(shí)間較空白對(duì)照組分別降低21.0%，44.0%和52.3%（P<0.05或P<0.01），且復(fù)黃片隨著給藥劑量的增加，止血作用越強(qiáng)，具用明顯的劑量依賴關(guān)系，表明復(fù)黃片對(duì)小鼠斷尾出血具有明顯的止血作用；痔寧片組和安絡(luò)血組動(dòng)物的止血時(shí)間較空白對(duì)照組分別降低38.1%和54.9%（P<0.01）。見(jiàn)表1。表1  復(fù)黃片對(duì)昆明小鼠斷尾出血時(shí)間的影響（略）與空白組比較，*P0.05,*P0.01；n=103.1.2  對(duì)新

20、西蘭白兔凝血時(shí)間（CT）和血漿凝血酶原時(shí)間（PT）的影響給藥7 d后，中、高劑量復(fù)黃片能明顯縮短家兔的凝血時(shí)間，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），其凝血時(shí)間縮短百分率分別為28.63 %和33.99 %，表明復(fù)黃片有良好的促凝血作用；而復(fù)黃片低、中、高劑量組和痔寧片組家兔血漿PT測(cè)定值與對(duì)照組比較明顯縮短（P<0.05或P<0.01），表明受試藥能明顯縮短家兔血漿凝血酶原時(shí)間，顯示其止血作用還可能與影響外源性凝血系統(tǒng)有關(guān)，見(jiàn)表2。表2  復(fù)黃片對(duì)新西蘭白兔凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間的影響（略）與空白組比較，*P0.05,*P0.01；n=

21、83.2  復(fù)黃片的消腫抗炎作用3.2.1  對(duì)角叉菜膠致大鼠肛周組織腫脹的影響各組動(dòng)物肛門(mén)內(nèi)直腸粘膜下漿肌層注入1%角叉菜膠后發(fā)生明顯的肛周組織水腫，且均在注射后24 h時(shí)達(dá)到高峰，此時(shí)復(fù)黃片高劑量組動(dòng)物肛周組織腫脹度明顯低于模型對(duì)照組（P<0.01）；在注射角叉菜膠后48 h時(shí)，復(fù)黃片各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照藥痔寧片對(duì)動(dòng)物肛周組織水腫均有明顯消除作用 (P<0.05或P<0.01)；在注射角叉菜膠后72 h時(shí)，復(fù)黃片僅有高劑量組和痔寧片組動(dòng)物肛周組織水腫明顯減輕(P<0.01)，表明復(fù)黃片連續(xù)給藥7 d對(duì)角叉菜膠引起的大鼠實(shí)驗(yàn)性痔瘡有明顯的治療作用，且

22、作用可維持72 h以上。見(jiàn)表3。3.2.2  復(fù)黃片對(duì)蛋清所致大鼠足腫脹的影響各組動(dòng)物足跖皮下注射新鮮蛋清后均發(fā)生明顯的急性炎癥水腫，空白對(duì)照組在注射蛋清后2 h時(shí)達(dá)最高值，然后開(kāi)始下降。在致炎2 h時(shí)，復(fù)黃片低、中、高劑量組，痔寧片組和阿司匹林組動(dòng)物足腫脹度與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），腫脹抑制率分別為23.90%，23.11%，31.37%，18.55%和26.70%。在致炎6 h時(shí)，復(fù)黃片低、中、高劑量組動(dòng)物足腫脹抑制率分別為20.37%, 28.37%和57.44%，但僅高劑量組動(dòng)物足腫脹度與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.

23、01）；阿司匹林和痔寧片組動(dòng)物足腫脹度分別比空白對(duì)照組降低29.46%和30.67%(P<0.05)。在致炎24 h時(shí)各組動(dòng)物足跖炎癥水腫明顯消退，已降至正常值范圍內(nèi)。見(jiàn)表4。表3  復(fù)黃片對(duì)角叉菜膠所致大鼠肛周組織腫脹的影響（略）與模型組比較，*P0.05,*P0.01；n=10表4  復(fù)黃片對(duì)蛋清所致大鼠足腫脹的影響（略）與空白對(duì)照組比較，*P0.05,*P0.01；n=103.3  復(fù)黃片體外抗菌作用試管法結(jié)果顯示，復(fù)黃片和痔寧片在體外在一定濃度下對(duì)所試驗(yàn)的8種菌株都有不同程度的抗菌作用，其抗菌效果依次為：金黃色葡萄球菌沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、白色念珠菌痢

24、疾桿菌枯草芽孢桿菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎球菌。 復(fù)黃片MIC最低可達(dá)到0.59 mg/ml，而痔寧片的MIC最低為4.69 mg/ml，結(jié)果表明復(fù)黃片的抑菌效果優(yōu)于痔寧片。見(jiàn)表5。表5  復(fù)黃片和痔寧片的體外抗菌作用（試管法）（略）平皿法結(jié)果顯示，復(fù)黃片對(duì)所試驗(yàn)的8種菌株都有不同程度的抗菌作用，其抗菌效果依次為：甲型溶血性鏈球菌、肺炎球菌金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、白色念珠菌、痢疾桿菌枯草芽孢桿菌。其MIC最低可達(dá)到2.75 mg/ml；而痔寧片在最高濃度下僅對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌有一定的抑菌作用，在此方法下，復(fù)黃片的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于痔寧片。見(jiàn)表6。表6  復(fù)黃

25、片和痔寧片的體外抗菌作用（平皿法）（略）4  討論    痔瘡臨床表現(xiàn)為局部炎癥、腫痛、便血、脫出等癥狀。復(fù)黃片作為治療痔瘡便血的有效、安全的制劑，其主要成分為蒲黃、大黃、地榆、槐角等,具有涼血止血、消腫止痛等功效，主治各種肛腸疾病出血之證，尤其適用于治療各期內(nèi)痔、肛裂、直腸息肉等以出血為主要臨床癥狀之病證。方中蒲黃涼血止血，為君藥；地榆和槐角為臣藥；大黃為佐使藥，有瀉熱涼血通便之效，蕩滌腸胃，可收釜底抽薪之功。全方治以涼血止血，清熱通便之法，主治血熱妄行之便血，熱既除而血自安，諸證悉愈1。    止血包括血液凝固、血小板聚

26、集和血管收縮3個(gè)重要因素。當(dāng)外傷或疾病出血時(shí)可見(jiàn)受損局部血管收縮，血小板在血管破損處凝集，啟動(dòng)內(nèi)源性及外源性凝血途徑完成凝血過(guò)程，形成血塊而止血6。為評(píng)價(jià)復(fù)黃片的止血作用，本研究以小鼠和家兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察復(fù)黃片給藥7 d后對(duì)小鼠斷尾出血時(shí)間和家兔凝血時(shí)間及凝血酶原時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)黃片具有顯著的止血和促凝血作用，作用機(jī)制可能與方中幾種止血中藥抑制破損傷口毛細(xì)血管通透性，參與內(nèi)源性及外源性凝血途徑有關(guān)。    痔瘡在藥效學(xué)上沒(méi)有固定的動(dòng)物模型，根據(jù)中藥新藥研究指南的要求并參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們?cè)趧?dòng)物的肛門(mén)部位模擬人的痔瘡癥狀，采用角叉菜膠肛門(mén)內(nèi)直腸粘膜下漿肌層局部注射建立大鼠肛周組織腫脹模型，觀察復(fù)黃片的消腫作用。結(jié)果表明，復(fù)黃片對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性痔瘡模型有良好的治療作用。另外本研究又采用實(shí)驗(yàn)性炎癥模型（蛋清足腫脹模型）進(jìn)行復(fù)黃片抗炎作用的考察。結(jié)果表明，復(fù)黃片中、高