卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響

1、第40卷第4期2004年12月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATISVol.40,No.4December2004卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響李永喜1,陳興平2,鄧云華2,陳映玲2,周禮義2(1青島市市立醫(yī)院皮膚科,山東青島266011;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科)摘要目的探討卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響及其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。方法用流式細(xì)胞儀測(cè)量小鼠胸腺、脾臟、外周血單個(gè)核細(xì)胞中T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+細(xì)胞變化并計(jì)算CD4+/CD8+的比CD8+細(xì)胞的比例,值。結(jié)果與正常對(duì)照組比較

2、,卡介菌多糖核酸可提高正常小鼠上述3種不同組織中CD4+、并在第35天有明顯差異(F=5.6311.21,q=5.329.13,P0.05),而對(duì)CD4+/CD8+比值無(wú)明顯影響。結(jié)論卡介菌多糖核酸可以促進(jìn)T細(xì)胞的分化與成熟,并可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+、CD8+細(xì)胞兩亞群之間的平衡來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞卡介菌多糖核酸;T淋巴細(xì)胞;免疫測(cè)定;小鼠中圖分類(lèi)號(hào)R967文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)167224488(2004)0420328203EFFECTSOFBCG2POLYSACCHARIDESNUCLEICACIDONT2LYMPHOCYTESUBSETSINNORMALMICELIYong2xi,C

3、HENXing2ping,DENGYun2hua,etal(DepartmentofDermatology,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheeffectsofBCG2polysaccharidesnucleicacid(BCG2PSN)onT2lymphocytesubsetsofnormalmiceanditsroleinimmunoregulation.MethodsThechangesofCD4+andCD8+lymphocytesweremeasuredwithf

4、lowcytome2tryinthethymus,spleenandperipheralbloodofthemice,andtheCD4+/CD8+ratiowascalculated.ResultsComparedwiththecon2trolgroup,BCG2PSNcouldincreaseCD4+andCD8+lymphocytesintheabove2mentionedtissues,thedifferencebecamesignificantonthe35thday(F=5.63-11.21,q=5.32-9.13,P0.05),butithadnoeffectontheCD4+/

5、CD8+ratio.ConclusionBCG2PSNcanacceleratethedifferentiationandmaturityofT2lymphocytesandmayexertsitsimmunoregulativerolebyregulatingthebalancebetweenCD4+andCD8+.KEYWORDSBCG2polysaccharidesnucleicacid;T2lymphocytes;immunoassay;mice卡介菌多糖核酸是從卡介菌中經(jīng)熱酚法提取多糖、核酸,配以滅菌生理鹽水制成的一種注射劑,臨床上廣泛應(yīng)用于病毒感染性疾病、自身免疫性疾病等的輔助治療

6、,證明其有很好的療效。但其具體的作用機(jī)制尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)以流式細(xì)胞儀檢測(cè)了卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠的胸腺、脾臟、外周血中T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響,以探討卡介菌多糖核酸的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。1材料與方法1.1材料及其來(lái)源由BectonDikinson公司生產(chǎn)。1.2分組與處理健康昆明種小白鼠60只,隨機(jī)分為卡介菌多糖核酸組(BCG2PSN組)、胸腺肽組(Th組)、正常對(duì)照組(NS組)。BCG2PSN組每只小白鼠按卡介菌多糖核酸注射液6.25mg/kg體質(zhì)量,Th組每只以胸腺肽注射液50mg/kg體質(zhì)量,正常對(duì)照組每只按生理鹽水0.5mL給藥,前兩組用生理鹽水調(diào)整濃度后,每只均

7、以0.5mL經(jīng)腹腔注射給藥,隔日1次,并分別于用藥后第14、35天各組隨機(jī)取小鼠6只,經(jīng)眼球采集外周血后,脫椎處死小鼠,摘取小鼠胸腺、脾臟,制成單細(xì)胞懸液。1.3單細(xì)胞懸液的制備與檢測(cè)1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備用Ficoll2Hy2paque淋巴細(xì)胞分離液獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞,用PBS液洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為(1.01.5)109/L。1.3.2胸腺、脾臟組織單個(gè)核細(xì)胞的制備獲取小卡介菌多糖核酸注射液由長(zhǎng)沙九芝堂生物制藥有限公司提供,胸腺肽注射液由武漢梅山生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn),FITC2CD4+單抗、PE2CD8+單抗由美國(guó)PharMigen公司生產(chǎn),Ficoll2Hypaque淋巴細(xì)胞分離

8、液由上海試劑二廠生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康昆明種小白鼠,雌雄兼用,45周齡,體質(zhì)量(203)g,由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,流式細(xì)胞儀FACSort收稿日期2003211220;修訂日期2004203208作者簡(jiǎn)介李永喜(19702),男,碩士,主治醫(yī)師。鼠胸腺、脾臟,剝除表面結(jié)締組織被膜后在200目不銹鋼網(wǎng)中輕輕揉搓,以PBS液沖洗,然后加入Tris2NH4Cl液使紅細(xì)胞裂解,最后用PBS液洗滌,調(diào)整4期李永喜,陳興平,鄧云華,等1卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響329細(xì)胞濃度為(1.01.5)109/L。1.3.3單個(gè)核細(xì)胞的熒光染色與檢測(cè)取上述各組織單個(gè)核細(xì)胞溶液1mL加入FIT

9、C2CD4+單抗和PE2CD8+單抗1L,置4冰箱避光孵育1h后用于NS組及Th組(F=5.63、9.65,q=4.968.01,+P0.05);Th組CD4明顯低于NS組(q=7.62,P0.05)。見(jiàn)表2。2.3卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠外周血T淋巴細(xì)冷PBS液洗滌,10g/L多聚甲醛液固定后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。2結(jié)果2.1卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠胸腺中T淋巴細(xì)胞亞群的影響用藥后第14天BCG2PSN組CD4+、CD8+值明顯低于Th組(F=4.89、7.37,q=6.73、10.25,P0.05);Th組CD4+、CD8+值明顯高于NS組(q=7.23、8.59,P0.05),CD4+/

10、CD8+值明顯低于NS組與BCG2PSN組(F=6.57,q=7.81、8.20,P0.05)。胞亞群的影響用藥后第14天BCG2PSN組CD8+明顯低于NS組及Th組(F=8.79,q=4.76、5.62,P0.05);用藥后第35天BCG2PSN組CD4+、CD8+明顯高于NS組(F=8.39、10.41,q=6.17、9.13,P0.05);Th組CD4+明顯高于NS組(q=8.20,P0.05),CD8+明顯低于NS組及BCG2PSN組(q=6.54、7.89,P0.05),CD4+/CD8+明顯高于NS組與BCG2PSN組(F=9.25,q=6.39、7.15,P0.05)。見(jiàn)表3。

11、3討論T細(xì)胞根據(jù)其表面表達(dá)的CD分子的不同,分用藥后第35天,BCG2PSN組和Th組CD4+、CD8+明顯高于NS組(F=8.73、11.21,q=5.327.21,P0.05),BCG2PSN組CD4+、CD8+值明顯低于Th組(q=6.13、7.17,P0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。2.2卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞為CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞兩大亞群。正常的免疫應(yīng)答有賴于各免疫細(xì)胞,尤其是T細(xì)胞亞群之間的相互制約,以形成適度的免疫應(yīng)答,使機(jī)體在此過(guò)程既能清除抗原性物質(zhì),又不損傷自身組織。免疫功能的紊亂,常常是由于各T細(xì)胞亞群之間的不平衡造成的1,2?，F(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為,外周血中T細(xì)

12、胞亞群的影響用藥后第35天BCG2PSN組CD4+、CD8+明顯高表1卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠胸腺T細(xì)胞亞群的影響(%,xs)組別n實(shí)驗(yàn)前CD+CD+CD+/CD+CD+第14天CD+CD+/CD+CD+第35天CD+CD+/CD+2.140.121.850.242.100.25NS組612.131.256.022.01Th組613.011.786.873.42BCG2PSN組612.872.067.011.632.010.4713.221.746.430.752.100.50332.120.5318.104.9312.212.231.480.4031.980.3111.271.970.363

13、.205.791.4813.511.136.310.24321.031.5311.460.98317.391.7138.020.773注:CD4+/CD8+為比值。第14天與、比較,F=4.897.37,3q=7.238.59,P0.05;與比較,q=6.73、10.25,P0.05;第35天、與比較,F=8.73、11.21,3q=5.327.21,P0.05;與比較,q=6.13、7.17,P0.05表2卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠脾臟T細(xì)胞亞群的影響(%,xs)組別n實(shí)驗(yàn)前CD4+CD8+CD4+/CD8+CD4+第14天CD8+17.943.1018.405.5019.801.42CD4+

14、/CD8+CD4+第35天CD8+15.581.1313.623.5819.181.193CD4+/CD8+2.200.192.380.792.070.22NS組634.123.6718.032.89Th組632.094.0619.073.43BCG2PSN組631.064.7417.454.121.870.3535.044.631.760.4528.844.671.820.3933.523.761.990.391.650.411.700.1834.273.1329.973.0339.542.0233注:CD4+/CD8+為比值。第35天與、比較,F=5.63、9.65,q=4.968.01,

15、P0.05;與比較,q=7.62,P0.05表3卡介菌多糖核酸對(duì)正常小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響(%,xs)組別n實(shí)驗(yàn)前CD+CD+CD+/CD+CD+第14天CD+CD+/CD+CD+第35天CD+CD+/CD+NS組648.015.3719.042.01Th組647.634.3518.234.05BCG2PSN組648.896.0317.583.892.920.5349.045.412.870.4848.489.343.010.2947.886.0018.054.102.800.4916.312.173.060.810.8012.312.393.9846.292.7856.962.67#53

16、.244.78317.820.642.600.113313.382.644.501.443320.362.9032.700.623注:CD4+/CD8+為比值。第14天,與、比較,F=8.79,q=4.76、5.62,P0.05;第35天時(shí)與比較,F=8.39、10.41,q=6.17、9.13,P0.05;與比較,#q=8.20,P0.05;與、比較,F=8.39、9.25,33q=6.397.89,P0.05330青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)40卷亞群的數(shù)目和CD4+/CD8+比值是估計(jì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)最有意義的參數(shù)之一,也是疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要標(biāo)志之一3,4。本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)了卡介菌多糖核酸對(duì)C

17、D4+、CD8+的影響,結(jié)果顯示,卡介菌多糖核酸可以提高胸腺組織中CD4+、CD8+細(xì)胞的比例,并可以維持兩者間的平衡,使CD4+/CD8+值保持在正常水平,這種作用在用藥后的第35天非常明顯。T淋巴細(xì)胞在胸腺中由始祖T細(xì)胞(pro2T)經(jīng)過(guò)一系列的過(guò)程最后分化發(fā)育為成熟CD4+、CD8+細(xì)胞,并通過(guò)胸腺進(jìn)入外周血液及淋巴器官,發(fā)揮免疫作用。研究同時(shí)顯示,在脾臟和外周血中,CD4+、CD8+細(xì)胞在用藥后第35天亦明顯高于正常對(duì)照組,CD4+/CD8+Zlotta等6分離提取卡介苗的細(xì)胞壁、漿膜、多糖(葡聚糖、阿拉伯聚糖)等成分,并刺激結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(yàn)陽(yáng)性健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)這幾

18、種成分均可以促進(jìn)CD4+細(xì)胞的增殖與活化。而卡介菌多糖核酸作為卡介苗的提取物,其主要成分為多糖與核酸的混合物。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及既往研究說(shuō)明,卡介菌多糖核酸可能在外周血、外周免疫器官(脾臟)和中樞免疫器官(胸腺)中直接調(diào)節(jié)CD4+、CD8+細(xì)胞的成熟與分化而維持二者的平衡,使機(jī)體免疫功能得到維持和提高。但卡介菌多糖核酸對(duì)T淋巴細(xì)胞調(diào)控的信號(hào)途徑尚需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1234值一直維持在正常水平,CD4+、CD8+細(xì)胞在脾臟和外周血中的變化情況與在胸腺中的變化情況一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,胸腺肽雖然也可影響CD4+與CD8+細(xì)胞的比例,但同卡介菌多糖核酸比較,其在一定時(shí)間內(nèi)(胸腺中第14天,外周血中第3

19、5天)可使CD4+、CD8+兩亞群發(fā)生紊亂,從而導(dǎo)致值低于(胸腺組織中)或高于(外周血中)正常水平,而卡介菌多糖核酸對(duì)兩亞群的調(diào)節(jié)為均衡的,從而使免疫應(yīng)答能正常進(jìn)行。在以前的實(shí)驗(yàn)中還顯示,卡介菌多糖核酸可以調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠CD4+、CD8+CD4+/CD8+龍振洲主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)M.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1998.8289.畢愛(ài)華,龔非力主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)M.第2版.北京:人民軍醫(yī)出版社,1999.8587.McMichaelAJ,FabreJUS.MonoclonalantibodiesinclinicalmedicalM.London:AcademicPressIN

20、Cltd,1982.230.SyrijalaH,SurcelHM,IlonenJ.LowCD4+/CD8+lymphocytera2tioinacutemyocardialinfectionJ.83:326.ClinExpImmunol,1991,5陳興平,李永喜,鄧云華,等.卡介菌多糖核酸對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響J.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào),2002,31(3):336.兩亞群的比例,使兩亞群恢復(fù)至正常水平5,6ZlottaAR,VoorenJPV,DenisO,etal.Whataretheimmuno2logicallyactivecomponentsofbaciliecalmette

21、2guerinintherapyofsuperficialbladdercancerJ?IntJCancer,2000,87:844.從而說(shuō)明卡介菌多糖核酸可以維持正常機(jī)體的免疫功能。(上接第327頁(yè))2SpachMS,DolberPC.Relatingextracellularpotentialsandtheirderivativestoanisotropicpropagationatamicroscopiclevelinhu2mancardiacmuscle.Evidenceforelectricaluncouplingofside2to2sidefiberconnectionswithi

22、ncreasedageJ.366.3DilaverisPE,GialafosEJ,SiderisSL,etal.Simpleelectrocardio2graphicmarkersforthepredictionofparoxysmalidiopathicatrialfibrillationJ.4AmHeartJ,1998,135:733.CircRes,1986,58:(本文編輯厲建強(qiáng))SanDiego,Calif:Grune&Stratton,1985.265276.6BustonAE,JosephsonME.TheroleofthePwavedurationasapredictorofpostoperativeatrialarrhythmiasJ.80:68.7RobertV,VanThiemN,CheavSL,etal.IncreasedcardiactypesandcollagenmRNAsinaldosteron2salthypertensionJ.Hypertension,1994,24:30.Chest,1981,8DilaverisPE,GialafosEJ,AndrikopoulosGK,e