凋亡相關(guān)基因在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達(dá)意義

1、凋亡相關(guān)基因在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達(dá)意義【摘要】 目的：分析凋亡相關(guān)基因p 53和bcl- 2在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達(dá)，分析其關(guān)系及臨床意義。 方法：免疫組化法檢測51例眼眶腺樣囊性癌臨床標(biāo)本和10例正常眼眶組織中P53和Bcl-2蛋白的表達(dá)狀況。 結(jié)果：P53和Bcl-2在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達(dá)陽性率分別為53%和 65%，顯著高于眼眶正常組織（53%,65%vs 10%，P0.01）。實(shí)性型腺樣囊性癌中P53的表達(dá)率顯著高于其在腺樣-管狀型中的表達(dá)率（86% vs 30%，P0.01）；P53和Bcl-2在復(fù)發(fā)組中的表達(dá)率顯著高于其在初發(fā)組中的表達(dá)率（85% vs 42%，P0

2、.01），（100% vs 53%，P0.01）；P53和Bcl-2二者在表達(dá)上具有相關(guān)性（ 21.461，P0.05）。結(jié)論：P53和Bcl-2蛋白的檢測對于判斷腫瘤對化療的敏感性和預(yù)后有參考價(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】 眼眶腺樣囊性癌 凋亡相關(guān)基因 耐藥0引言腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma, ACC）是一種高度惡性的上皮性腫瘤，可發(fā)生于全身各部位，如涎腺、頜下腺、氣管、肺、乳腺、皮膚等，于眼眶則好發(fā)于淚腺1。我們通過檢測眼眶腺樣囊性癌中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，了解并分析凋亡相關(guān)基因p 53和bcl- 2在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分型和預(yù)后的關(guān)系及臨床意義。我們采

3、用的基因檢測方法是蛋白質(zhì)水平的免疫組織化學(xué)法，它是把血清學(xué)方法和顯微示蹤技術(shù)結(jié)合起來的一類技術(shù)，簡便易行,容易掌握，具有較高的抗原抗體反應(yīng)的特異性和靈敏性，可以對組織細(xì)胞的成分準(zhǔn)確定位和定量分析。1材料和方法1.1材料 免疫組化染色試劑盒（HistostainTM-Plus Kits）（SP-9000），鼠抗人P53 mAb（DO-7）(ZM-0408)，鼠抗人Bcl-2 mAb（Bcl-2-100）(ZM-0010),濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）,磷酸鹽緩沖液（PBS）（配成0.01mol/L，1 000 mL，pH7.27.4）(ZLI-9061)。天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科病理室

4、1992/2003年手術(shù)或活檢后經(jīng)病理組織學(xué)確診的眼眶腺樣囊性癌標(biāo)本共51例，男22例，女29例，右眶20例，左眶31例。年齡1962歲，初發(fā)38例，術(shù)后復(fù)發(fā)13例。按組織學(xué)分型：腺樣-管狀型30例，實(shí)性型21例。全部標(biāo)本經(jīng)40g/L甲醛固定，石蠟包埋，5連續(xù)切片，作病理組織學(xué)及免疫組化使用。對照組10例，取自相同時(shí)期眼眶內(nèi)良性腫瘤手術(shù)中同時(shí)取出的眶內(nèi)正常組織（脂肪、結(jié)締組織、淚腺等），標(biāo)本處理方法同實(shí)驗(yàn)組。1.2方法 采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（streptavidin peroxidase, SP）染色試劑盒。以已知陽性的切片做陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照。Bcl-2的陽性產(chǎn)物

5、應(yīng)定位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，P53的陽性產(chǎn)物應(yīng)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色細(xì)小顆粒狀。以高倍鏡下（400）陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：0級：無著色；1級：陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞數(shù)10；2級：陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞數(shù)1050；3級：陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞數(shù)50。以01級為陰性（-），23級為陽性（ ）（本判斷標(biāo)準(zhǔn)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包（Ver10.0），方法采用 2檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為0.05。2結(jié)果2.1凋亡相關(guān)基因在眼眶腺樣囊性癌中的表達(dá) 研究結(jié)果顯示，P53和Bcl-2在眼眶腺樣囊性癌中均有不同程度的表達(dá)。P53的陽性染色為棕黃色，位于細(xì)胞質(zhì)和胞核，

6、胞核呈均勻明顯著色，且染色強(qiáng)度高于細(xì)胞質(zhì)。Bcl-2的陽性染色均勻分布于細(xì)胞膜和胞質(zhì)。眼眶腺樣囊性癌標(biāo)本中27例P53表達(dá)陽性，陽性率53%，正常組織標(biāo)本中1例表達(dá)陽性，陽性率10%，P53在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達(dá)率顯著高于眼眶正常組織(27.128，P0.01）。腺樣囊性癌標(biāo)本中33例Bcl-2表達(dá)陽性，陽性率64.7%，正常組織標(biāo)本中1例表達(dá)陽性，陽性率10%，Bcl-2在腺樣囊性癌組織中的表達(dá)率顯著高于眼眶正常組織(211.034，P0.01）。2.2 P53和Bcl-2的表達(dá)與癌組織學(xué)分型的關(guān)系 P53在實(shí)性型腺樣囊性癌中18例表達(dá)陽性，陽性率86%，在腺樣?管狀型中9例表達(dá)陽性，

7、陽性率30%，P53在實(shí)性型中的陽性表達(dá)率較腺樣管狀型明顯增高，二率比較有顯著性差異(216.648，P0.01）。Bcl-2在實(shí)性型中15例表達(dá)陽性，陽性率71%，在腺樣管狀型中18例表達(dá)陽性，陽性率60.0%，二率比較無顯著性差異( 20.715，P0.01)。2.3 P53和Bcl-2的表達(dá)與癌初發(fā)與復(fù)發(fā)的關(guān)系 P53在復(fù)發(fā)組病例中11例表達(dá)陽性，陽性率85%，在初發(fā)組病例中16例表達(dá)陽性，陽性率42%，在復(fù)發(fā)組中陽性率明顯增高，二率比較有顯著性差異(2=7.634，P 0.01)。Bcl-2在復(fù)發(fā)組病例中13例表達(dá)陽性，陽性率100%，在初發(fā)組病例中20例表達(dá)陽性，陽性率53%，在復(fù)發(fā)

8、組中陽性率明顯增高，二率比較有顯著性差異(2=13.649，P 0.05)。3討論原發(fā)于眼眶的淚腺腺樣囊性癌是淚腺惡性上皮性腫瘤中最常見的，也是惡性度最高的腫瘤1,2，其發(fā)生率在淚腺腫瘤中僅次于淚腺多形性腺瘤居第2位。根據(jù)我科對歷年診治眼眶腫瘤的統(tǒng)計(jì)情況，腺樣囊性癌占上皮性腫瘤的19.2%，占淚腺惡性上皮性腫瘤的41.7%3,4。其發(fā)病年齡小于其他淚腺惡性腫瘤，30歲以下患者占一定比例，這在其他淚腺惡性腫瘤中是非常少見的。腺樣囊性癌病程較短，多在6mo以內(nèi)，主要臨床表現(xiàn)為眼球突出、移位和眶部腫塊。與其他淚腺腫瘤不同的是其疼痛的發(fā)生率可高達(dá)79%，自發(fā)痛和觸痛均存在，這是因?yàn)樵撃[瘤具有嗜神經(jīng)性，

9、腫瘤細(xì)胞易侵犯神經(jīng)，且沿神經(jīng)束蔓延，引起局部疼痛。影像學(xué)檢查除發(fā)現(xiàn)淚腺區(qū)不規(guī)則腫物外，常見臨近骨質(zhì)有蟲蝕樣破壞。腫瘤易向顱內(nèi)和鼻竇等部位擴(kuò)散，或侵入周圍血管內(nèi)，形成瘤栓并經(jīng)血行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腺樣囊性癌雖然生長較為緩慢，但侵襲性強(qiáng)，浸潤的范圍往往超出手術(shù)時(shí)肉眼看到的腫瘤范圍，因此復(fù)發(fā)率和病死率均較高，我科統(tǒng)計(jì)復(fù)發(fā)率為77.4%，陳耀真等報(bào)道病死率為44.4%。腺樣囊性癌的大體標(biāo)本為灰白色實(shí)體腫塊，表面有結(jié)節(jié)，無包膜或包膜不完整，常侵犯周圍組織，切面呈灰白或微黃色，可伴有出血或壞死，呈小囊樣改變，質(zhì)脆。鏡下腺樣囊性癌主要由導(dǎo)管上皮細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞構(gòu)成，群集成巢或條索狀，核深染而胞漿較少的小圓細(xì)胞構(gòu)成。

10、根據(jù)目前采用的Perzin分類法5，可分為3型：腺樣型，又稱篩狀型,癌巢中有許多大小不等呈篩孔狀的囊樣腔隙，囊樣間隙多由肌上皮細(xì)胞圍繞，其內(nèi)充滿嗜堿性粘蛋白；管狀型：癌細(xì)胞排列成細(xì)長管狀結(jié)構(gòu)，由二、三層上皮細(xì)胞圍繞而成，內(nèi)層為導(dǎo)管上皮，外層為肌上皮細(xì)胞，腔內(nèi)可有嗜伊紅分泌物；實(shí)性型：腫瘤細(xì)胞排列緊密呈團(tuán)塊樣，形成圓形或不規(guī)則形實(shí)性癌巢，中間有纖維間隔，其內(nèi)可有少量腔隙，較大的團(tuán)塊內(nèi)可出現(xiàn)壞死。由于腺樣型和管狀型結(jié)構(gòu)常在同一腫瘤中同時(shí)出現(xiàn)，故又將其合并成腺樣-管狀型。一般認(rèn)為腺樣-管狀型預(yù)后較好，實(shí)體型預(yù)后較差。目前對腺樣囊性癌的治療方法仍以手術(shù)為主。目前常用的手術(shù)方法是擴(kuò)大的局部切除術(shù)，即手術(shù)

11、切除可見的腫瘤組織連同周圍的一部分正常組織，盡可能清除腫瘤細(xì)胞，術(shù)后再輔以放療或化療。隨著綜合治療理念的逐漸深入，從術(shù)后的輔助化療消滅手術(shù)后的殘余腫瘤細(xì)胞和微小轉(zhuǎn)移灶，到術(shù)前新輔助化療的術(shù)前“減瘤作用”，化療在腺樣囊性癌的治療中占踞了愈來愈重要的地位6。國內(nèi)外目前有報(bào)道用于腺樣囊性癌化療的方案很多,關(guān)于療效的說法也多有不一致之處，其中腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。多數(shù)化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，即凋亡來達(dá)到治療目的的，反之，腫瘤細(xì)胞也可通過逃逸凋亡或拮抗凋亡獲得生存，即產(chǎn)生多藥耐藥7。細(xì)胞凋亡抑制可能是腫瘤細(xì)胞耐藥的一種標(biāo)記，而且與細(xì)胞凋亡有關(guān)的因子在多藥耐

12、藥形成中起一定作用。近年研究已發(fā)現(xiàn)了一些與細(xì)胞凋亡抑制有關(guān)的癌基因(如bcl-2，突變的p53，F(xiàn)as/Ap101，Cmyc，raf-1，bcl/abl，cerbB-2/neu，NF-KB)的表達(dá)產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。bcl-2是最重要的抑制細(xì)胞凋亡的基因，定位于18q21，但在多數(shù)腫瘤患者中，可發(fā)生染色體t（14；18）易位，使bcl-2基因位于14q32，接近Ig重鏈的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，導(dǎo)致bcl-2的高度表達(dá)。bcl-2基因的編碼產(chǎn)物為26ku的蛋白質(zhì)（P26-Bcl-2）,常位于核膜、線粒體膜和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，bcl-2基因的高水平表達(dá)與多種化療藥物誘導(dǎo)的

13、細(xì)胞凋亡受抑制顯著相關(guān)。bcl-2過度表達(dá)時(shí)，可能通過調(diào)節(jié)抗氧化途徑，作用于細(xì)胞凋亡過程，使細(xì)胞死亡率下降，對抗化療藥物的作用8。p53基因定位于17p13.1，在人類腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，而且最易發(fā)生改變。野生型P53對維持細(xì)胞正常生長，抑制惡性增殖過程中有著重要作用，其所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物半衰期較短，無法用免疫組化染色法檢測到。突變型p53基因的蛋白產(chǎn)物半衰期明顯延長，容易被檢測到。所以如果用免疫組化法在癌組織中檢測到P53蛋白的表達(dá)，則可以認(rèn)為有p53基因的突變9。p53基因狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞對于放療和化療的敏感性有關(guān)，目前研究認(rèn)為，野生型p53有DNA復(fù)制啟動功能，當(dāng)細(xì)胞在放、化療作用

14、下，DNA不能修復(fù)為正常狀態(tài)時(shí)，p53將誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這種機(jī)制可抑制細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其對放、化療的敏感性，突變型p53基因則失去了這種細(xì)胞調(diào)節(jié)功能。p53基因的異常和P53蛋白的過度表達(dá)在很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，Kopnin等10的研究表明，p53基因?qū)drl基因的啟動因子有調(diào)節(jié)作用，野生型p53能夠抑制mdrl轉(zhuǎn)錄，減少耐藥糖蛋白P170的生成，而突變型p53可增強(qiáng)mdrl基因的表達(dá)和P170的生成，P170具有藥泵作用，能夠逆濃度差將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排出細(xì)胞外，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受攻擊，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生多耐藥性，造成化療失敗，這是許多腫瘤對化療不敏感的重要原因之一。目前國

15、內(nèi)外均有關(guān)于涎腺腺樣囊性癌中突變型P53和Bcl-2蛋白表達(dá)情況的研究報(bào)道，Papadaki等11在對涎腺腺樣囊性癌P53的表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性ACC中突變型P53的表達(dá)高于初發(fā)人群，且與預(yù)后密切相關(guān)。其它對涎腺ACC中P53和Bcl-2表達(dá)情況的研究也表明12，二者在腫瘤中均存在過表達(dá)，且復(fù)發(fā)病例的表達(dá)率增高。目前尚未見對眼眶腺樣囊性癌中的P53和Bcl-2表達(dá)情況進(jìn)行研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變型P53和Bcl-2蛋白在眼眶腺樣囊性癌中的表達(dá)率均顯著高于眼眶正常組織，表明眼眶ACC組織中存在著較為廣泛的p53突變和較高的bcl -2表達(dá)，二者的共同作用使腫瘤細(xì)胞的凋亡過程受到抑制，

16、腫瘤對化療藥物的抗藥性增加。P53在實(shí)性型ACC中的表達(dá)率為86%，明顯高于在腺樣-管狀型ACC中的表達(dá)率30%，表明實(shí)性型ACC細(xì)胞有較強(qiáng)的拮抗凋亡作用，對化療藥物抗藥性更高，因而預(yù)后較差。復(fù)發(fā)組突變型P53和Bcl-2蛋白的表達(dá)率均顯著高于初發(fā)組，提示復(fù)發(fā)性ACC的細(xì)胞凋亡過程受到抑制，對化療藥物反應(yīng)性差，化療效果不佳。p 53和bcl- 2同屬凋亡相關(guān)基因，二者相互聯(lián)系，相互制約。眼眶ACC中P53和Bcl-2的表達(dá)具有正相關(guān)性，與它們共同在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮作用有關(guān)，其機(jī)制可能為13：野生型P53通過bcl-2家族調(diào)控凋亡，p 53激活bax靶基因，使其mRNA和蛋白的表達(dá)均升高，形成

17、Bax-Bax同源二聚體，使Bcl-2蛋白失活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p 53基因發(fā)生突變后，失去了對Bcl-2蛋白的抑制作用，使細(xì)胞凋亡受抑制，化療藥物的毒性作用降低。所以，p 53的基因狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞對于化療的敏感性密切相關(guān)。同時(shí)，bcl -2的高表達(dá)還可通過其抗凋亡機(jī)制，抑制野生型P53誘導(dǎo)的凋亡，bcl -2的過表達(dá)也是導(dǎo)致ACC耐藥的重要原因之一10。 【參考文獻(xiàn)】 1肖利華.眼眶淚腺上皮性腫瘤的影像學(xué)診斷.國際眼科雜志,2001;1(4):22-242劉琳,何彥津.淚腺腺樣囊性癌的放射治療.國際眼科雜志,2004;4(5):900-9043宋國祥,吳中耀.眼眶病學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出

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