多重耐藥基因在睫狀體上皮細(xì)胞容積調(diào)節(jié)中的作用

1、    多重耐藥基因在睫狀體上皮細(xì)胞容積調(diào)節(jié)中的作用        摘要目的：研究多重耐藥(MDR1)基因與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的關(guān)系。方法：用反義寡核苷酸阻抑牛眼睫狀體非色素上皮細(xì)胞MDR1基因表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下檢測MDR1基因反義寡核苷酸(MDR-anti)的導(dǎo)入，用反射/散射技術(shù)測量由低滲液引起的細(xì)胞容積變化。結(jié)果：陽離子脂質(zhì)體促進(jìn)MDR-anti導(dǎo)入細(xì)胞，MDR-anti導(dǎo)入量與劑量呈依賴性增強(qiáng)關(guān)系(r0.97，P0.01)。人MDR-anti使低滲液引起的細(xì)胞調(diào)節(jié)性

2、容積減小反應(yīng)延遲、緩慢，容積恢復(fù)不完全(60%)，而鼠DMR-anti沒有此作用。結(jié)論：人MDR-anti抑制細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減小，提示MDR1基因參與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)。主題詞寡核苷酸類， 反義；抗藥性；上皮樣細(xì)胞 The role of the multiple drug resistance gene inthe volume regulation of ciliary epithelial cellsCHEN Li-Xin, WANG Li-Wei, Tim JacobPhysiological Unit, Cardiff School of Biosciences, Cardiff Univ

3、ersity, Cardiff CF1 3US, UKAbstract AIM:The relationship between multiple drug resistance (MDR1) gene and the volume regulation was investigated.METHODS：Antisense “knock-down” approach was used to inhibit MDR1 gene expression in bovine nonpigmented ciliary epithelial cells. The uptake of MDR1 antise

4、nse oligonucleotides (MDR-anti) was detected by a confocal microscopy. Volume changes following exposure to hypotonic solution were measured using a light reflection/scattering technique. RESULTS：The transfection reagent lipofectin facilitated the uptake of MDR-anti. The uptake of hmuan MDR-anti was

5、 directly proportional to the external concentration of antisense. There was a linear relationship between them (r=0.97, P0.01). The regulatory volume decrease (RVD) induced by hypotonic solution was delayed and slowed down by incubating the cells with human MDR-anti. The volume of the cells only pa

6、rtially recovered (60%). There was no effect of mouse MDR-anti on the volume regulation. CONCLUSION：The specific MDR-anti inhibited the RVD and this suggests that MDR1 gene be involved in the volume regulation of cells.MeSHOligonucleotides, antisense; Drug resistance; Epithelioid cells細(xì)胞容積調(diào)節(jié)是細(xì)胞基本功能之

7、一，一旦這種調(diào)節(jié)失控將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。滲透性細(xì)胞腫脹會(huì)引起細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減少(regulatory volume decrease， RVD)，使細(xì)胞容積恢復(fù)正常。有關(guān)RVD機(jī)制目前尚不清楚，有多因素參與13。多重耐藥(multiple drug resistance, MDR)基因在其中所起的作用有許多爭論4，5。本文應(yīng)用基因表達(dá)反義技術(shù)，抑制MDR基因表達(dá)，以闡明MDR基因與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的關(guān)系。材料與方法(一)MDR1反義寡核苷酸：本實(shí)驗(yàn)所用兩種反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, 簡稱anti)由15個(gè)堿基組成(Severn Biotech Ltd, UK)。

8、一種與人類MDR1基因mRNA起始碼區(qū)(第416430堿基)互補(bǔ)(5ATC CAT CCC GAC CTC 3)，簡稱人MDR1-anti。另一種與小鼠MDR1基因mRNA起始碼區(qū)(第101115堿基)互補(bǔ)(5CTC CAT CAC CAC CTC 3)，簡稱鼠MDR1-anti。為了測量上述兩種反義寡核苷酸的導(dǎo)入量，用熒光標(biāo)記人MDR1-anti第4，11堿基和鼠MDR1-anti第1，15堿基。(二)細(xì)胞分離和培養(yǎng)：牛眼睫狀體上皮細(xì)胞按Jacob6描述的方法分離和培養(yǎng)。用E199(含10%小牛血清)培養(yǎng)液孵育1418 h，更換培養(yǎng)液，按不同組別分別處理。(三)實(shí)驗(yàn)分組：分別在各處理組培養(yǎng)液

9、中加入不同成份、不同濃度的藥物，再培養(yǎng)24或48 h。測量MDR-anti的導(dǎo)入量和細(xì)胞在低滲液刺激下的容積變化。(1)空白對(duì)照組；(2)Lip組：陽離子脂質(zhì)體-lipofectin (Lip) 20 g/mL;(3)M-A 5組：鼠MDR1-anti 5 g/mL;(4)M-A 10組：鼠MDR1-anti 10 g/mL；(5)A-Hypo組：230 mOsm/L低滲液(含鼠MDR1-anti 10g/mL)浸浴40 min，更換為E199培養(yǎng)液(含鼠MDR1-anti 10g/mL)；(6)M-LA5組：鼠MDR-anti 5g/mL;(7)M-LA 10組：鼠MDR-anti 10 g

10、/mL；(8)M-LA 200組：鼠MDR-anti 200 g/mL；(9)H-LA 50組：人MDR-anti 50g/mL；(10)H-LA 100組：人MDR-anti 100g/mL；(11)H-LA 200組：人MDR-anti 200 g/mL。 610各組分別用Lip 20g/mL與MDR-anti混合后再處理細(xì)胞。(四)灌流液：等滲灌流液滲透壓300 mOsm/L,內(nèi)含(mmol/L)：105 NaCl,0.5 MgCl2，2CaCl2，10HEPES，70 D甘露醇，用蔗糖調(diào)至300 mOsm/L；低滲灌流液滲透壓230 mOsm/L，除不含甘露醇和蔗糖外，其他成分和濃度與

11、等滲液相同。2種灌流液用Tris調(diào)至pH7.4。(五)MDR-anti熒光測量：各組熒光標(biāo)記細(xì)胞如上述分別處理24 h或48 h后，在激光共聚焦顯微鏡(Noran Instruments, Middleton, WI, USA)下拍攝像，檢測細(xì)胞內(nèi)anti的熒光，獲取像用Metamorph像分析系統(tǒng)(Universal Imaging Corporation, USA)分析，熒光(灰度)： 0=黑，255=白。(六)細(xì)胞容積測量：用LS50B發(fā)光分光計(jì)(Perkin-Elmer, UK)連續(xù)測量和記錄處理48 h后H-L A 200組、M-LA 200組和空白對(duì)照組在低滲液中細(xì)胞容積變化。當(dāng)細(xì)

12、胞在低滲液中腫脹時(shí)，光度下降。而細(xì)胞通過RVD使其容積減少，趨向恢復(fù)正常時(shí)，光度回升，用配套軟件對(duì)所測光度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理分析。(七)統(tǒng)計(jì)方法：本文數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。中圓括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)是觀察例數(shù)。結(jié)果一、MDR-anti的熒光標(biāo)記像：1分別是空白對(duì)照組、M-LA 10組、H-LA 200組處理48 h后普通光學(xué)像(上行a、b、c)和相應(yīng)激光共聚焦掃描熒光像(下行d、e、f)。左列是對(duì)照組，中列是M-LA 10組，右列是H-LA 200組。從1可見，在Lip和MDR-anti處理48 h后，細(xì)胞內(nèi)有較強(qiáng)的MDR-anti熒光。Fig 1U

13、ptake of fluorescently labelled MDR-antisense1熒光標(biāo)記的MDR-antisense的攝取二、鼠MDR-anti的導(dǎo)入：在沒有Lip存在時(shí)，MDR-anti導(dǎo)入量很少，低滲液也不能提高M(jìn)DR-anti導(dǎo)入。然而，在Lip作用下，MDR-anti導(dǎo)入量明顯增加，與對(duì)照組比有顯著差異(P0.01)(2)。Fig 2Uptake of fluorescently labelled mouse MDR-antisense under different conditions*P0.01,vs control (±s)(n)2不同條件下熒光標(biāo)記的鼠M

14、DR-antisense的導(dǎo)入三、細(xì)胞對(duì)人MDR-anti的劑量依賴性攝?。篖ip成功介導(dǎo)人MDR-anti進(jìn)入細(xì)胞，H-LA 50、100、200組與對(duì)照組比有顯著差異(P0.01)。隨著培養(yǎng)液熒光標(biāo)記的人MDR-anti濃度提高，MDR-anti熒光值增加，二者呈顯著直線相關(guān)(r=0.97，P0.01)，即MDR-anti導(dǎo)入量與劑量呈依賴性增強(qiáng)關(guān)系(見3)。Fig 3Dose dependent uptake of fluorescently labelled human MDR-antisense ?*P0.01,vs control (±s)(n)3熒光標(biāo)記的人MDR-an

15、tisense的劑量依賴性攝取四、MDR-anti對(duì)RVD的影響：4(數(shù)據(jù)已標(biāo)準(zhǔn)化處理)所示是灌流過程的光度變化(容積變化)。低滲液灌流約20 s時(shí)對(duì)照組(n=10)光度開始下降(細(xì)胞開始腫脹)，約50 s光度下降到最低值(97.8±0.6)，隨后由于RVD，光度回升，約300 s完全恢復(fù)正常對(duì)照水平。M-LA 200組(n=8)與對(duì)照組相似(P0.05)。H-LA 200組細(xì)胞容積變化與對(duì)照組顯著不同的是容積恢復(fù)反應(yīng)延遲、緩慢，約450 s時(shí)光度才回升至99.2±0.3，與對(duì)照組比仍有顯著差異(P0.01)。并一直維持在此水平，不能恢復(fù)正常。5是RVD過程中光度恢復(fù)(容積

16、恢復(fù))百分率。各組均以各自光度最低值(此時(shí)容積最大)為恢復(fù)起始點(diǎn)。容積恢復(fù)百分率計(jì)算公式：對(duì)照組和M-LA 200組容積恢復(fù)斜率相似，分別為0.36和0.34，在低滲液持續(xù)作用期間，細(xì)胞通過RVD可使其容積完全恢復(fù)正常。而H-LA 200組容積恢復(fù)斜率0.12，與對(duì)照組比有顯著差異(P0.01)，且細(xì)胞容積只能恢復(fù)至對(duì)照值的60%。Fig 4Effects of MDR-antisense on the regulatory volume decrease of cells4MDR-antisense對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減小的影響Fig 5The recovery (%) of cell volu

17、me during RVD5RVD過程中細(xì)胞容積恢復(fù)百分率討論反義寡核苷酸是人工合成的短鏈核苷酸，它可與相應(yīng)的靶mRNA結(jié)合，占據(jù)相應(yīng)的mRNA空間，阻抑該mRNA表達(dá)，妨礙該基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的翻譯，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)減少而不影響其他基因的表達(dá)。但是，它不容易進(jìn)入細(xì)胞。正如本文結(jié)果所示，睫狀體上皮細(xì)胞只能攝取少量寡核苷酸，用低滲液使細(xì)胞膨脹以促進(jìn)寡核苷酸導(dǎo)入的方法也不能奏效。核酸轉(zhuǎn)染劑-陽離子脂質(zhì)體lipofectin可與寡核苷酸形成脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物，被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)它們的攝取，但并非對(duì)所有細(xì)胞都有此作用7。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Lip作用下，細(xì)胞內(nèi)MDR-anti熒光明

18、顯增加，表明Lip可顯著促進(jìn)寡核苷酸導(dǎo)入睫狀體上皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的鼠MDR-anti在1、8、10位置上3個(gè)堿基與人MDR-anti不相同，雖然它可被細(xì)胞攝取，但不能特異性阻斷NPE細(xì)胞MDR基因的表達(dá)，對(duì)RVD也沒有影響。而人MDR-anti被細(xì)胞攝取后，由低滲液引起的光度值恢復(fù)延遲、緩慢，斜率小，且恢復(fù)率僅60%，表明人MDR-anti可特異性阻斷NPE細(xì)胞MDR基因的表達(dá)，抑制RVD，使細(xì)胞容積恢復(fù)不完全。容積激活性氯電流在RVD過程中起重要作用，細(xì)胞容積調(diào)節(jié)機(jī)制之一是滲透性腫脹激活細(xì)胞膜容積調(diào)節(jié)性氯通道，Cl-外流，水伴隨外流而導(dǎo)致RVD。但容積調(diào)節(jié)性氯通道的分子本質(zhì)目前還不清楚。M

19、DR基因產(chǎn)物P-gp蛋白(P-glycoprotein)4、pICln2、ClC-31等是這種通道候選分子。文獻(xiàn)報(bào)道P-gp抗體抑制容積激活性Cl?電流8，但MDR基因轉(zhuǎn)染而過度表達(dá)MDR基因時(shí)，MDR基因表達(dá)與Cl?電流水平卻不相關(guān)9，雖然人們已做了大量研究，但MDR是否與容積激活性Cl?電流及RVD有關(guān)還未明確。本實(shí)驗(yàn)用反義阻抑技術(shù)抑制天然細(xì)胞內(nèi)生性MDR基因表達(dá)，導(dǎo)致RVD減弱，表明MDR基因參與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)。但MDR-anti并不能完全抑制RVD，提示RVD過程還有其它因素參與。MDR基因被阻抑后容積激活性Cl-電流的變化如何，這些問題有待進(jìn)一步研究。目前認(rèn)為睫狀體上皮細(xì)胞容積調(diào)節(jié)與房

20、水分泌密切相關(guān)。在房水分泌過程中，大量離子和水通過色素上皮細(xì)胞進(jìn)入非色素上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞腫脹，激活細(xì)胞容積調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞膜K、Cl-通道開放，K、Cl-和水外流形成房水，同時(shí)細(xì)胞容積恢復(fù)正常。因此，深入研究睫狀體上皮細(xì)胞容積調(diào)節(jié)，對(duì)進(jìn)一步闡明房水分泌機(jī)制，尋找抗青光眼的基因療法有著重要意義。作者單位：英國卡的夫大學(xué)生物學(xué)院生理系參考文獻(xiàn)1Coca-Prados M, Sanches-Torres J, Peterson-Yantorno K, et al. Association of ClC-3 channel with Cl- transport by human nonpigmente

21、d ciliary epithelial cells. J Membr Biol, 1996, 150:197.2Coca-Prados M, Anguita J, Chalfant M, et al. PKC-sensitive Cl- channels associated with ciliary epithelial homologue of pICln. Am J Physiol, 1995, 268:C572.3Duan D, Winter C, Cowly S, et al. Molecular identification of a volume-regulated chloride channel. Nature, 1997, 390:417.4Higgins CF. Volume-activated chloride currents associated with multidrug resistance P-glycoprotein. J Physiol,1995, 482:31.5Nilius B, Eggermont J, Voets T, et al. Volum