多重耐藥基因在睫狀體上皮細胞容積調(diào)節(jié)中的作用

1、    多重耐藥基因在睫狀體上皮細胞容積調(diào)節(jié)中的作用        摘要目的：研究多重耐藥(MDR1)基因與細胞容積調(diào)節(jié)的關系。方法：用反義寡核苷酸阻抑牛眼睫狀體非色素上皮細胞MDR1基因表達，在激光共聚焦顯微鏡下檢測MDR1基因反義寡核苷酸(MDR-anti)的導入，用反射/散射技術測量由低滲液引起的細胞容積變化。結果：陽離子脂質體促進MDR-anti導入細胞，MDR-anti導入量與劑量呈依賴性增強關系(r0.97，P0.01)。人MDR-anti使低滲液引起的細胞調(diào)節(jié)性

2、容積減小反應延遲、緩慢，容積恢復不完全(60%)，而鼠DMR-anti沒有此作用。結論：人MDR-anti抑制細胞調(diào)節(jié)性容積減小，提示MDR1基因參與細胞容積調(diào)節(jié)。主題詞寡核苷酸類， 反義；抗藥性；上皮樣細胞 The role of the multiple drug resistance gene inthe volume regulation of ciliary epithelial cellsCHEN Li-Xin, WANG Li-Wei, Tim JacobPhysiological Unit, Cardiff School of Biosciences, Cardiff Univ

3、ersity, Cardiff CF1 3US, UKAbstract AIM:The relationship between multiple drug resistance (MDR1) gene and the volume regulation was investigated.METHODS：Antisense “knock-down” approach was used to inhibit MDR1 gene expression in bovine nonpigmented ciliary epithelial cells. The uptake of MDR1 antise

4、nse oligonucleotides (MDR-anti) was detected by a confocal microscopy. Volume changes following exposure to hypotonic solution were measured using a light reflection/scattering technique. RESULTS：The transfection reagent lipofectin facilitated the uptake of MDR-anti. The uptake of hmuan MDR-anti was

5、 directly proportional to the external concentration of antisense. There was a linear relationship between them (r=0.97, P0.01). The regulatory volume decrease (RVD) induced by hypotonic solution was delayed and slowed down by incubating the cells with human MDR-anti. The volume of the cells only pa

6、rtially recovered (60%). There was no effect of mouse MDR-anti on the volume regulation. CONCLUSION：The specific MDR-anti inhibited the RVD and this suggests that MDR1 gene be involved in the volume regulation of cells.MeSHOligonucleotides, antisense; Drug resistance; Epithelioid cells細胞容積調(diào)節(jié)是細胞基本功能之

7、一，一旦這種調(diào)節(jié)失控將導致細胞死亡。滲透性細胞腫脹會引起細胞調(diào)節(jié)性容積減少(regulatory volume decrease， RVD)，使細胞容積恢復正常。有關RVD機制目前尚不清楚，有多因素參與13。多重耐藥(multiple drug resistance, MDR)基因在其中所起的作用有許多爭論4，5。本文應用基因表達反義技術，抑制MDR基因表達，以闡明MDR基因與細胞容積調(diào)節(jié)的關系。材料與方法(一)MDR1反義寡核苷酸：本實驗所用兩種反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, 簡稱anti)由15個堿基組成(Severn Biotech Ltd, UK)。

8、一種與人類MDR1基因mRNA起始碼區(qū)(第416430堿基)互補(5ATC CAT CCC GAC CTC 3)，簡稱人MDR1-anti。另一種與小鼠MDR1基因mRNA起始碼區(qū)(第101115堿基)互補(5CTC CAT CAC CAC CTC 3)，簡稱鼠MDR1-anti。為了測量上述兩種反義寡核苷酸的導入量，用熒光標記人MDR1-anti第4，11堿基和鼠MDR1-anti第1，15堿基。(二)細胞分離和培養(yǎng)：牛眼睫狀體上皮細胞按Jacob6描述的方法分離和培養(yǎng)。用E199(含10%小牛血清)培養(yǎng)液孵育1418 h，更換培養(yǎng)液，按不同組別分別處理。(三)實驗分組：分別在各處理組培養(yǎng)液

9、中加入不同成份、不同濃度的藥物，再培養(yǎng)24或48 h。測量MDR-anti的導入量和細胞在低滲液刺激下的容積變化。(1)空白對照組；(2)Lip組：陽離子脂質體-lipofectin (Lip) 20 g/mL;(3)M-A 5組：鼠MDR1-anti 5 g/mL;(4)M-A 10組：鼠MDR1-anti 10 g/mL；(5)A-Hypo組：230 mOsm/L低滲液(含鼠MDR1-anti 10g/mL)浸浴40 min，更換為E199培養(yǎng)液(含鼠MDR1-anti 10g/mL)；(6)M-LA5組：鼠MDR-anti 5g/mL;(7)M-LA 10組：鼠MDR-anti 10 g

10、/mL；(8)M-LA 200組：鼠MDR-anti 200 g/mL；(9)H-LA 50組：人MDR-anti 50g/mL；(10)H-LA 100組：人MDR-anti 100g/mL；(11)H-LA 200組：人MDR-anti 200 g/mL。 610各組分別用Lip 20g/mL與MDR-anti混合后再處理細胞。(四)灌流液：等滲灌流液滲透壓300 mOsm/L,內(nèi)含(mmol/L)：105 NaCl,0.5 MgCl2，2CaCl2，10HEPES，70 D甘露醇，用蔗糖調(diào)至300 mOsm/L；低滲灌流液滲透壓230 mOsm/L，除不含甘露醇和蔗糖外，其他成分和濃度與

11、等滲液相同。2種灌流液用Tris調(diào)至pH7.4。(五)MDR-anti熒光測量：各組熒光標記細胞如上述分別處理24 h或48 h后，在激光共聚焦顯微鏡(Noran Instruments, Middleton, WI, USA)下拍攝像，檢測細胞內(nèi)anti的熒光，獲取像用Metamorph像分析系統(tǒng)(Universal Imaging Corporation, USA)分析，熒光(灰度)： 0=黑，255=白。(六)細胞容積測量：用LS50B發(fā)光分光計(Perkin-Elmer, UK)連續(xù)測量和記錄處理48 h后H-L A 200組、M-LA 200組和空白對照組在低滲液中細胞容積變化。當細

12、胞在低滲液中腫脹時，光度下降。而細胞通過RVD使其容積減少，趨向恢復正常時，光度回升，用配套軟件對所測光度值進行標準化處理分析。(七)統(tǒng)計方法：本文數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，均數(shù)差異顯著性檢驗用t檢驗。中圓括號內(nèi)數(shù)據(jù)是觀察例數(shù)。結果一、MDR-anti的熒光標記像：1分別是空白對照組、M-LA 10組、H-LA 200組處理48 h后普通光學像(上行a、b、c)和相應激光共聚焦掃描熒光像(下行d、e、f)。左列是對照組，中列是M-LA 10組，右列是H-LA 200組。從1可見，在Lip和MDR-anti處理48 h后，細胞內(nèi)有較強的MDR-anti熒光。Fig 1U

13、ptake of fluorescently labelled MDR-antisense1熒光標記的MDR-antisense的攝取二、鼠MDR-anti的導入：在沒有Lip存在時，MDR-anti導入量很少，低滲液也不能提高MDR-anti導入。然而，在Lip作用下，MDR-anti導入量明顯增加，與對照組比有顯著差異(P0.01)(2)。Fig 2Uptake of fluorescently labelled mouse MDR-antisense under different conditions*P0.01,vs control (±s)(n)2不同條件下熒光標記的鼠M

14、DR-antisense的導入三、細胞對人MDR-anti的劑量依賴性攝取：Lip成功介導人MDR-anti進入細胞，H-LA 50、100、200組與對照組比有顯著差異(P0.01)。隨著培養(yǎng)液熒光標記的人MDR-anti濃度提高，MDR-anti熒光值增加，二者呈顯著直線相關(r=0.97，P0.01)，即MDR-anti導入量與劑量呈依賴性增強關系(見3)。Fig 3Dose dependent uptake of fluorescently labelled human MDR-antisense ?*P0.01,vs control (±s)(n)3熒光標記的人MDR-an

15、tisense的劑量依賴性攝取四、MDR-anti對RVD的影響：4(數(shù)據(jù)已標準化處理)所示是灌流過程的光度變化(容積變化)。低滲液灌流約20 s時對照組(n=10)光度開始下降(細胞開始腫脹)，約50 s光度下降到最低值(97.8±0.6)，隨后由于RVD，光度回升，約300 s完全恢復正常對照水平。M-LA 200組(n=8)與對照組相似(P0.05)。H-LA 200組細胞容積變化與對照組顯著不同的是容積恢復反應延遲、緩慢，約450 s時光度才回升至99.2±0.3，與對照組比仍有顯著差異(P0.01)。并一直維持在此水平，不能恢復正常。5是RVD過程中光度恢復(容積

16、恢復)百分率。各組均以各自光度最低值(此時容積最大)為恢復起始點。容積恢復百分率計算公式：對照組和M-LA 200組容積恢復斜率相似，分別為0.36和0.34，在低滲液持續(xù)作用期間，細胞通過RVD可使其容積完全恢復正常。而H-LA 200組容積恢復斜率0.12，與對照組比有顯著差異(P0.01)，且細胞容積只能恢復至對照值的60%。Fig 4Effects of MDR-antisense on the regulatory volume decrease of cells4MDR-antisense對細胞調(diào)節(jié)性容積減小的影響Fig 5The recovery (%) of cell volu

17、me during RVD5RVD過程中細胞容積恢復百分率討論反義寡核苷酸是人工合成的短鏈核苷酸，它可與相應的靶mRNA結合，占據(jù)相應的mRNA空間，阻抑該mRNA表達，妨礙該基因產(chǎn)物蛋白質的翻譯，結果導致相應蛋白質減少而不影響其他基因的表達。但是，它不容易進入細胞。正如本文結果所示，睫狀體上皮細胞只能攝取少量寡核苷酸，用低滲液使細胞膨脹以促進寡核苷酸導入的方法也不能奏效。核酸轉染劑-陽離子脂質體lipofectin可與寡核苷酸形成脂質體-寡核苷酸復合物，被表面帶負電荷的細胞膜吸附，促進細胞對它們的攝取，但并非對所有細胞都有此作用7。本實驗結果顯示，在Lip作用下，細胞內(nèi)MDR-anti熒光明

18、顯增加，表明Lip可顯著促進寡核苷酸導入睫狀體上皮細胞。本實驗設計的鼠MDR-anti在1、8、10位置上3個堿基與人MDR-anti不相同，雖然它可被細胞攝取，但不能特異性阻斷NPE細胞MDR基因的表達，對RVD也沒有影響。而人MDR-anti被細胞攝取后，由低滲液引起的光度值恢復延遲、緩慢，斜率小，且恢復率僅60%，表明人MDR-anti可特異性阻斷NPE細胞MDR基因的表達，抑制RVD，使細胞容積恢復不完全。容積激活性氯電流在RVD過程中起重要作用，細胞容積調(diào)節(jié)機制之一是滲透性腫脹激活細胞膜容積調(diào)節(jié)性氯通道，Cl-外流，水伴隨外流而導致RVD。但容積調(diào)節(jié)性氯通道的分子本質目前還不清楚。M

19、DR基因產(chǎn)物P-gp蛋白(P-glycoprotein)4、pICln2、ClC-31等是這種通道候選分子。文獻報道P-gp抗體抑制容積激活性Cl?電流8，但MDR基因轉染而過度表達MDR基因時，MDR基因表達與Cl?電流水平卻不相關9，雖然人們已做了大量研究，但MDR是否與容積激活性Cl?電流及RVD有關還未明確。本實驗用反義阻抑技術抑制天然細胞內(nèi)生性MDR基因表達，導致RVD減弱，表明MDR基因參與細胞容積調(diào)節(jié)。但MDR-anti并不能完全抑制RVD，提示RVD過程還有其它因素參與。MDR基因被阻抑后容積激活性Cl-電流的變化如何，這些問題有待進一步研究。目前認為睫狀體上皮細胞容積調(diào)節(jié)與房

20、水分泌密切相關。在房水分泌過程中，大量離子和水通過色素上皮細胞進入非色素上皮細胞，引起細胞腫脹，激活細胞容積調(diào)節(jié)機制，細胞膜K、Cl-通道開放，K、Cl-和水外流形成房水，同時細胞容積恢復正常。因此，深入研究睫狀體上皮細胞容積調(diào)節(jié)，對進一步闡明房水分泌機制，尋找抗青光眼的基因療法有著重要意義。作者單位：英國卡的夫大學生物學院生理系參考文獻1Coca-Prados M, Sanches-Torres J, Peterson-Yantorno K, et al. Association of ClC-3 channel with Cl- transport by human nonpigmente

21、d ciliary epithelial cells. J Membr Biol, 1996, 150:197.2Coca-Prados M, Anguita J, Chalfant M, et al. PKC-sensitive Cl- channels associated with ciliary epithelial homologue of pICln. Am J Physiol, 1995, 268:C572.3Duan D, Winter C, Cowly S, et al. Molecular identification of a volume-regulated chloride channel. Nature, 1997, 390:417.4Higgins CF. Volume-activated chloride currents associated with multidrug resistance P-glycoprotein. J Physiol,1995, 482:31.5Nilius B, Eggermont J, Voets T, et al. Volum