利用激光共聚焦圖像系統(tǒng)檢測實(shí)驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動物淋巴細(xì)

1、    利用激光共聚焦圖像系統(tǒng)檢測實(shí)驗性變態(tài)反應(yīng)性 腦脊髓炎動物淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度        摘要: 目的進(jìn)一步探討多發(fā)性硬化（MS）和實(shí)驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）的發(fā)病機(jī)制。方法取EAE動物的脾細(xì)胞，制備淋巴細(xì)胞懸液，以熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載后，通過激光掃描共聚焦顯微鏡（Insight plus IQ, Meridian, USA）檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度成正比。結(jié)果EAE組淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯高于正常對照組。結(jié)論細(xì)胞

2、內(nèi)鈣在EAE動物淋巴細(xì)胞的過度活化方面發(fā)揮重要作用。關(guān)鍵詞： 共聚焦顯微鏡檢查； 實(shí)驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎； 鈣； Fluo-3/AM中分類號： R392.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1006-2963 （2000）03-172-03Measurement of Lymphocyte Ca2+i in Guinea Pigwith EAE by Confocal MicroscopeZHANG Feng-yun, LU Xue-ying, ZHANG Biao, WANG Li-qun, ZHOU Gui-sheng, ZHAO Yu-ying, LI Dian-jun(Department

3、 of Immunology , Haerbin Medical University , Haerbin 150086 , China)ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the implicated pathogenesis of multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis. MethodsThe Lymphocytes from guinea pig with experimental allergic encephalomyelitis (EAE) were loaded

4、with Flou-3/AM, a Ca2+ fluorescent indicator.The intracellular calcium concentration (Ca2+i ) was measured by using confocal microscope and Ca2+i changes were represented by fluorescent intensities. ResultsThe Ca2+i was significantly increased in lymphocytes of guinea pig with EAE compared with that

5、 of normal control group. ConclusionThe Ca2+i played an important role in lymphocyte activation of EAE.Key words : confocal microscope ; experimental allergic encephalomylitis; calcium; Fluo-3/AM實(shí)驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis,EAE）是人類多發(fā)性硬化（MS）的動物模型，主要表現(xiàn)為以脫髓鞘為主的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，是一種自身免疫性疾病

6、，其CD4+細(xì)胞（主要是Th1細(xì)胞）過度活化，而Ca2+是參與細(xì)胞活化的重要成分1。為進(jìn)一步探討在EAE動物淋巴細(xì)胞活化中Ca2+的濃度變化，我們以Fluo-3/AM熒光染料負(fù)載細(xì)胞，用激光掃描共聚焦像系統(tǒng)檢測了EAE動物淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度(Ca2+i )。1材料和方法1.1EAE模型的建立2月齡雌性豚鼠14只（購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱市獸醫(yī)研究所），體重300 g左右。隨機(jī)分組，其中實(shí)驗組7只，正常對照組7只。實(shí)驗組以自提牛腦加佐劑免疫2，于免疫后第15 d處死豚鼠。正常對照組豚鼠注射等量生理鹽水加佐劑，于注射后15 d處死。1.2淋巴細(xì)胞的分離處死鼠后立即無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，Han

7、k液洗滌3次后以無酚紅無血清RPMI-1640調(diào)細(xì)胞濃度為1×109/L，取1 mL置eppendorf管中。1.3熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載3將4 mol/L Fluo-3/AM加至細(xì)胞懸液中，置37 40 min。以PBS洗3次后，再懸于1 mL PBS中，滴1滴于載玻片上，加蓋玻片備用。1.4Ca2+i 檢測3樣品置于激光掃描共聚焦顯微鏡（Insight plus IQ,Meridian, USA）上，目鏡為40倍。以熒光強(qiáng)度代表Ca2+i ，實(shí)驗數(shù)據(jù)直接輸入計算機(jī)進(jìn)行處理和像分析。1.5統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。2結(jié)果附表EAE動物淋巴

8、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度TableIntracellular Ca2+ concentration of lymphocyte in guinea pig with EAE(±s)GroupnFluorescent intensityEAE72711.29±341.00*Normal71194.50±206.72*P0.01 compared with normal group EAE動物淋巴細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測定結(jié)果如附表所示，Ca2+i 以熒光強(qiáng)度表示。由附表可見，EAE組動物淋巴細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對照組（P0.01）。附中a，b分別顯示EAE動

9、物單個淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 (a) 及正常對照組單個淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 (b)。中右側(cè)標(biāo)尺為不同顏色所代表的熒光強(qiáng)度。附(a)免疫后第15d EAE動物單個淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+(b)正常對照組動物單個淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度Fig(a)IntracellularCa2+i of a single lymphocyte in EAE animal at 15th day after immunization(b)IntracellularCa2+i of a single lymphocyte in normal animal3討論細(xì)胞內(nèi)Ca2+主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞內(nèi)的鈣庫

10、中，在外界信號刺激下，通過細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+釋放入細(xì)胞質(zhì)中，從而誘導(dǎo)一系列反應(yīng)4。資料表明，髓鞘堿性蛋白（MBP）刺激T細(xì)胞活化，造成遲發(fā)型超敏反應(yīng)。抗原（MBP）與T細(xì)胞抗原受體（TCR）結(jié)合后產(chǎn)生的信號傳入T細(xì)胞內(nèi)，使磷脂酶C活化，催化磷脂酰肌醇4?5二磷酸水解產(chǎn)生二乙酰甘油（DAG）和1?4?5三磷酸肌醇（IP3），IP3可使Ca2+i增高。DAG和增高的Ca2+ 作為T細(xì)胞活化的第一信號促使蛋白激酶C（PKC）和其他鈣依賴性蛋白酶活化，催化細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的絲氨酸、纈氨酸和酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)而在IL-1和其他協(xié)同刺激因子的作用下啟動T細(xì)胞活化，由于T細(xì)胞的過度活化

11、造成EAE發(fā)病。Romagnani5指出，Th1細(xì)胞及Th1型細(xì)胞因子（IL-2、IFN-、TNF等）參與了MS及胰島素依賴性糖尿病等某些器官特異性自身免疫病的發(fā)病。我們曾報道了EAE動物細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2、TNF-的生物學(xué)活性及IFN-水平明顯增高，證實(shí)了其Th1細(xì)胞過度活化6 。本研究進(jìn)一步證實(shí)，Ca2+i在EAE動物的淋巴細(xì)胞過度活化過程中發(fā)揮重要作用，這對研究MS 的發(fā)病機(jī)制及治療自身免疫病有一定的意義。(本文附見插頁第頁)基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目（D-9522）作者簡介：張鳳蘊(yùn)（1943-）,女,山東省龍口市人，教授，主要從事神經(jīng)免疫和移植免疫研究。通訊地址：哈爾濱醫(yī)科

12、大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086。聯(lián)系電話：(0451)6674566。張鳳蘊(yùn)（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）呂雪瑩（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）張飚（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）王麗群（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）周貴生（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）趙育瑩（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）李殿?。ü枮I醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，哈爾濱 150086）參考文獻(xiàn)：1Kasai H,Augustine GJ. Cytosolic Ca2+ gradient triggering unid

13、irectional fluid secretion from exocrine pancreas J. Nature, 1990,348：735-738.2王琳，張鳳蘊(yùn)，王麗群. MBP的提取、鑒定及EAE模型的建立J. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，32（1）：12-14.3Li BY, Qiao GF, Zhou H,et al. Effects of berbamine on ATP-induced Ca2+i mobilization in cultured vascular smooth muscle cell and cardiomyocyteJ. Acta Pharmacol Sinica, 1999,20(8)：705-708.4Berridge MJ. Inositol trisphophate and calcium sigalli