高效液相色譜法檢測(cè)六種氟喹諾酮類獸藥殘留前處理的優(yōu)化

1、收稿日期:2010-07-01;修訂日期:2010-09-10作者簡(jiǎn)介:潘 媛(1982-,女,工程師;E -m ai:l me i m e-i 82909163.co m高效液相色譜法檢測(cè)六種氟喹諾酮類獸藥殘留前處理的優(yōu)化潘 媛*,牛 華,程曉云,祝紅昆,申南玉,李 波,馮 雷,珠 娜,牛之瑞(云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院;昆明650223摘 要:建立了一個(gè)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中6種氟喹諾酮類藥物殘留的高效液相色譜方法。不同基質(zhì)的樣品前處理對(duì)檢測(cè)影響較大:魚(yú)、肉及肝臟等樣品需經(jīng)過(guò)乙腈-011m o l/L KH 2PO 4緩沖液提取,乙腈飽和的正己烷洗滌去除油脂;蛋及乳制品樣品用正己烷飽和的乙腈

2、提取,乙腈飽和的正己烷去脂。目標(biāo)化合物采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量。對(duì)市售雞肉、豬肉、雞蛋進(jìn)行檢測(cè),添加10、20、50、100L g /kg 濃度水平時(shí),回收率在82%105%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4%12%之間,方法的檢出限諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星及單諾沙星為510L g /Kg ,恩諾沙星、達(dá)氟沙星為310L g /Kg 。關(guān)鍵詞:氟喹諾酮;高效液相色譜法;熒光檢測(cè)器;動(dòng)源性食品中圖分類號(hào):O65717 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1000-0720(201105-069-04氟喹諾酮類(Fluoroqu i n o l o nes抗生素進(jìn)入我國(guó)僅僅20多年,耐藥率已經(jīng)達(dá)

3、60%70%。目前,有近10種氟喹諾酮類藥物應(yīng)用于畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),而FQs 殘留的檢測(cè)方法未有食品檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),且僅有農(nóng)業(yè)部無(wú)公害類產(chǎn)品對(duì)環(huán)丙沙星(C I P 011m g /Kg和恩諾沙星(ENR 011mg /Kg有限量要求。所采用的檢測(cè)方法一般有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法1、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法2、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、微生物法3等。利用高效液相色譜熒光檢測(cè)器對(duì)動(dòng)物源食品中FQs 藥物殘留進(jìn)行檢測(cè),不僅成本較低,經(jīng)改進(jìn),前處理簡(jiǎn)單易行,可滿足我國(guó)現(xiàn)行獸藥殘留檢測(cè)分析的要求。1 材料與方法111 儀器與試劑HPLC -20A 高效液相色譜儀,配10AXL 熒光檢測(cè)器

4、及Analysis 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本島津公司;超聲波儀;乙腈、正己烷(色譜純;KH 2PO 4、H 3PO 4(分析純;固相萃取裝置;三乙胺(分析純;四丁基溴化銨(分析純;P H S -2型精密酸度計(jì)。色譜柱:G rance A llti m a C 18柱(416mm 150mm 色譜柱,SPE -C 18小柱(6m g ,3cc。諾氟沙星(NOR 、環(huán)丙沙星(C IP、恩諾沙星(ENR、沙拉沙星(SAR 、單諾沙星(DAN 、雙氟沙星(D I F,純度>99%,配制濃度為1m g /m L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,乙腈定容,避光4e 保存3個(gè)月,使用液逐級(jí)稀釋,現(xiàn)用現(xiàn)配。112 色譜條件流動(dòng)

5、相(A 為乙腈,(B 為0105m o l/L H 3PO 4含014%三乙胺(V /V ,使用前過(guò)濾脫氣,流速1mL /m i n ,柱溫:35e ,進(jìn)樣量:10L L ;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)(K ex 248nm,發(fā)射波長(zhǎng)(K e m :445nm ?？紤]到被測(cè)物質(zhì)的復(fù)雜性,使用梯度洗脫程序(見(jiàn)表1,分析結(jié)束后將乙腈提至90%,沖出樣品中的表1 梯度洗脫程序Tab .1 G rad i en t e l u ti on progra m分析時(shí)間t /m i n 流動(dòng)相A /%(CH 3CN 流動(dòng)相B /%01684151684209010259010251684301684熒光物質(zhì),保證連續(xù)

6、進(jìn)樣時(shí)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,并起到保護(hù)柱子的作用。113樣品的前處理魚(yú)、肌肉類及肝臟類:樣品(魚(yú)去鱗去皮均質(zhì)后準(zhǔn)確稱取均勻樣品510g(精確至0101g于50mL聚丙烯離心管中,加入15mL經(jīng)N a OH調(diào)節(jié)p H至714的011m o l/L KH2PO4-乙腈緩沖液(1B3, V/V,充分提取兩次,移取上清液至50mL比色管中,分次加入乙腈飽和的正己烷洗滌至澄清,留取下層澄清液體,50e氮吹至干,用2mL乙腈溶解殘?jiān)?經(jīng)0122L m濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析。蛋及奶制品:準(zhǔn)確稱取均勻樣品210g(精確至0101g,加經(jīng)正己烷飽和的乙腈10mL渦旋振蕩均勻,過(guò)濾并洗滌,合并于25mL比色管中,加入10mL

7、乙腈飽和的正己烷溶液渦旋振蕩洗滌至澄清,棄去上層液體,下層液體氮吹至干,加2mL乙腈溶解殘?jiān)?過(guò)0122L m濾膜后進(jìn)行分析。2結(jié)果與分析211流動(dòng)相的選擇參照農(nóng)業(yè)部方法對(duì)FQs類物質(zhì)進(jìn)行分離4,在流動(dòng)相的選擇上多采用磷酸鹽緩沖溶液或經(jīng)調(diào)pH值的酸性水溶液5,然而C18柱上卻不能得到良好分離,普遍存在出峰過(guò)早、標(biāo)準(zhǔn)品之間分離不完全、峰拖尾等情況。氟喹諾酮類藥物在酸性水溶液中通常以離子形式存在6,文獻(xiàn)報(bào)道多采用磷酸/三乙胺7、磷酸鹽/四丁基溴化銨及磷酸/庚烷磺酸鈉體系8。本試驗(yàn)對(duì)比了四丁基溴化銨和三乙胺兩種離子對(duì)試劑,選用0105m ol/L KH2PO4-01015m o l/L四丁基溴化銨緩

8、沖鹽B乙腈=90%B10%,滿足分離要求,但存在平衡時(shí)間長(zhǎng),流動(dòng)相需調(diào)節(jié)pH等步驟;若選用0105m o l/L H3PO4含014%三乙胺(V/V:乙腈=84%B16%作為流動(dòng)相,六種FQ s在15m i n內(nèi)均能達(dá)到基線有效分離,此時(shí)流動(dòng)相p H在4左右1,有效避免了雜峰的干擾。212方法的檢出限及標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行色譜分析,工作曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2?？梢?jiàn),本方法靈敏度高、線性范圍較寬,有一定的實(shí)用價(jià)值。表2方法的線性范圍、回歸方程與相關(guān)系數(shù)Tab.2Th e li near ran ges,regression equations and corr

9、elation coefficien ts氟喹諾酮線性范圍w/(L g/K g回歸方程檢出限w/(L g/kgr諾氟沙星(NOR5200Y=4114107x+345159895019972環(huán)丙沙星(CIP5200Y=4154107x+212119025019999單諾沙星(DAN3200Y=4197107x+162111713019998恩諾沙星(E HR3200Y=4101107x+398102053019999沙拉沙星(SAR5200Y=3196107x+617191475019964雙氟沙星(D I F5200Y=4160107x+177106825019957 Y:峰面積,x:被則物含

10、量213樣品前處理方法的優(yōu)化動(dòng)物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜,富含大量脂肪和蛋白質(zhì),選擇并優(yōu)化樣品前處理方法對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要。實(shí)驗(yàn)對(duì)肌肉類、肝臟類及魚(yú)蝦、蛋、乳制品類的前處理進(jìn)行了優(yōu)化比較。按照農(nóng)業(yè)部方法4,魚(yú)、蛋及乳制品中含有大量脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸等干擾物質(zhì),樣品組織提取液一般呈渾濁狀態(tài),直接進(jìn)入固相萃取柱,凈化效果并不理想,而且會(huì)造成小柱的堵塞,且目標(biāo)物在前處理過(guò)程中回收率低、不穩(wěn)定,增大了殘留檢測(cè)的難度。采用上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行液-液萃取,用異丙醇溶解氮吹干后的殘?jiān)?發(fā)現(xiàn)雖然殘?jiān)芙獗容^充分,但雜峰干擾太多,低濃度時(shí)基本無(wú)法定量,對(duì)回收率的貢獻(xiàn)也并不明顯;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)魚(yú)肉中FQ s藥物殘留檢測(cè)

11、影響較大的是提取液磷酸鹽緩沖液的pH值,未經(jīng)p H調(diào)節(jié)時(shí),魚(yú)肉中殘留檢測(cè)回收率極不穩(wěn)定,基線抖動(dòng)劇烈,后經(jīng)Na OH調(diào)節(jié)p H值到714時(shí),情況大有改善(見(jiàn)圖1;對(duì)于蛋及乳制品,特別在殘留分圖1魚(yú)肉組織色譜圖Fig11Chro m atogra m s of fish sa mp lesA-空白加標(biāo);B-空白樣品1-諾氟沙星810;2-環(huán)丙沙星810;3-單諾沙星810;4-恩諾沙星610;5-沙拉沙星810;6-雙氟沙星810(10-6%析測(cè)定時(shí)直接濃縮進(jìn)樣易產(chǎn)生雜質(zhì)干擾,若采用乙腈飽和的正己烷則可將脂溶性雜質(zhì)進(jìn)一步凈化。實(shí)驗(yàn)比較了用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果,綜合考慮對(duì)殘留目標(biāo)化

12、合物的提取率;易產(chǎn)生高度混濁濾液的樣品中雜質(zhì)的影響程度;濃縮富集的便利程度等幾個(gè)因素,結(jié)果是以正己烷飽和的乙腈為優(yōu)。分別試驗(yàn)了采用混合溶劑提取的效果,乙腈-丙酮,乙酸乙酯-甲醇,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶劑比例對(duì)目標(biāo)化合物的影響較大,并且對(duì)某些基質(zhì)樣品提取的雜質(zhì)較多,最終確定蛋及乳制品選擇直接加入正己烷飽和的乙腈溶液沉淀蛋白,用乙腈飽和的正己烷溶液去除脂肪等干擾物質(zhì),效果較好。3結(jié)論將新鮮配制的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液30L g/Kg (30ppb4e冰箱避光保存1、3、5、7d后上機(jī)檢測(cè),被測(cè)物質(zhì)保留時(shí)間基本不變,但濃度降低明顯,多有雜質(zhì)峰出現(xiàn)。因此在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)做到現(xiàn)做現(xiàn)配,樣品處理也需及時(shí)上機(jī),方能保證數(shù)據(jù)的可靠

13、性。在樣品添加各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品至最小量確定本實(shí)驗(yàn)的檢出限,儀器的檢出限可達(dá)015L g/K g,但在實(shí)際殘留量測(cè)定過(guò)程中,回收率不可得,變異系數(shù)較大?？紤]到樣品復(fù)雜的基體干擾,方法檢出限為諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星及單諾沙星為5L g/Kg、,恩諾沙星、達(dá)氟沙星為3L g/K g9。FQ s類藥物殘留的檢測(cè)根據(jù)上述方法,經(jīng)過(guò)市場(chǎng)采集,檢測(cè)市售30個(gè)豬肉樣品、30個(gè)魚(yú)類樣品、30個(gè)雞肉樣品和30個(gè)雞蛋樣品,發(fā)現(xiàn)一例豬肉諾氟沙星陽(yáng)性,結(jié)果為3217L g/K g。添加10、20、50、100L g/Kg濃度水平,該方法回收率穩(wěn)定(見(jiàn)表3,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,對(duì)于大規(guī)模的檢測(cè)篩查,是較為理想的檢測(cè)方法。表3六

14、種喹諾酮類藥物殘留的加標(biāo)回收率(n=3 Tab.3Th e recoveries of three qu i n ol one an ti m icrob i a ls(n=3加入量w/(L g/kg化合物平均回收率/%豬肉魚(yú)類雞蛋雞肉R SD/%豬肉魚(yú)類雞蛋雞肉10NORCIPDANE NRS ARD I F901682119210861283118214821082118316841584128310861194148615951589168411831983169112851384189019119128199101071212121091410816619415619513710617

15、816101261241491320NORCIPDANE NRS ARD I F86138619961999139215911585169013941387148311861688199512871889109011871291179012881894148619941910121091711917121291911713712119167179178196171191111109151050NORCIPDANE NRS ARD I F90131021892169218901794159011951696149117851485158712101149719102129813103169713

16、901191161011487119211614616716109157137147159138144118198138171271510119118131181871912 續(xù)表3(Con ti nued T ab.3加入量w/(L g/kg化合物平均回收率/%豬肉魚(yú)類雞蛋雞肉R SD/%豬肉魚(yú)類雞蛋雞肉100NORCIPDANE NRS ARD I F9418931210417101151001010210101149614971097168914901895121011499111041597149916931810318105109911961710110513712410819718

17、9196185129126141211811812818714819116117131241011916參考文獻(xiàn)1G igososP G,R evesado P R,CadahiaO.J Chrom atogrA,2000,871:312劉媛,謝孟峽,丁嵐,等.分析化學(xué),2004,32(3:3523L isianeS E,E lfr i des E S S.J Phar m B i om ed A na,l2002:914楊先樂(lè),胡鯤,楊勇,等.農(nóng)業(yè)部第783號(hào)公告-2-20065Zhenli ng Z,A i guo D,G ui x i ang Y.J Chro m a t og r B,

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