乙型肝炎病毒特異性核酶與丁型肝炎病毒重組體的體外轉(zhuǎn)錄及切割活

1、    乙型肝炎病毒特異性核酶與丁型肝炎病毒重組體 的體外轉(zhuǎn)錄及切割活性        摘要 目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)特異性核酶(簡(jiǎn)稱rRZ)體外轉(zhuǎn)錄及切割HBV的活性。方法 將831 bp的HBV C基因片段克隆于T載體T7啟動(dòng)子下游，32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄后作為靶RNA(32P-rHBV)。rRZ、rHDVRZA(插入有核酶結(jié)構(gòu)的丁型肝炎病毒基因組重組體)和rHDVRZP(部分HDV基因組重組體)進(jìn)行非標(biāo)記的大量轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后，與32P-rHBV按一

2、定比例和條件保溫切割，電泳后放射自顯影。結(jié)果 rRZ，rHDVRZP，rHDVRZA在37有活性，并隨溫度升高而提高，體外觀察到重組體的切割活性，證明所設(shè)計(jì)的核酶結(jié)構(gòu)是正確的。結(jié)論 將核酶基因插入到HDV基因組中，使其具有特異性切割HBV的活性，可實(shí)現(xiàn)核酶的保護(hù)性和靶向性運(yùn)載，為下一步重組體的體內(nèi)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 核酶 乙型肝炎病毒 丁型肝炎病毒 轉(zhuǎn)錄Study of transcription and cleavage in vitro of HDV with HBV-specific hammerhead ribozymeWEN Shujuan,QI Xuezhong,ZHOU

3、Rong,et al.Genetic Centre,Nanfang Hospital,Guangzhou 510515Abstract Objective To study the effect of hepatitis B virus(HBV) specific ribozyme(RZ) and recombinant hepatitis D virus(HDV) inserting hammerhead ribozyme(rHDVRZP and rHDVRZA).Methods 831 bp HBV C gene fragment was cloned under the control

4、of T7 promoter,32P-labeld HBV transcript was incubated with gel-purified RZ,rHDVRZA,rHDVRZP at different temperature and autoradiographed after denaturing gel-electrophoresis.Result These results show that rRZ,rHDVRZA,rHDVRZP were active at 37 and more so at higher themperatures.Conclusion Recombina

5、nt Delt virus could serve as a vector for the delivery of a ribozyme specific for hepatitis B virus cleavage.Our data demonstrate the value of recombinant ribozyme as potential therapeutic agents for treatment of HBV infection.Further study about cleavage in vitro and in vivo will continue.Key words

6、 Ribozyme Hepatitis B virus Hepatitis D virus Transcription針對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的RNA中間體而設(shè)計(jì)的核酶，是研究乙型肝炎基因治療的熱點(diǎn)1,2。將已構(gòu)建成功的HBV特異性核酶(rRZ)插入有核酶結(jié)構(gòu)的丁型肝炎病毒(HDV)基因組重組體(rHDVRZA)和部分HDV基因組重組體(rHDVRZP)，進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄、切割活性的研究，并于體外觀察到重組體的切割活性，證明所設(shè)計(jì)的核酶結(jié)構(gòu)是正確的。材料與方法1.質(zhì)粒rRZ、rHDVRZA、rHDVRZP由本室構(gòu)建。2.RiboMax transcription kit、丙烯酰胺

7、、雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨為Promega公司產(chǎn)品。a-32PATP購(gòu)自北京亞輝公司；X光片為Kodak公司產(chǎn)品；Advan-tage-TM凝膠純化試劑盒為Clontech公司產(chǎn)品；DEPC為Sigma公司產(chǎn)品；DNA polymerase I klenow為Biolabs公司產(chǎn)品；測(cè)序由ABI391自動(dòng)測(cè)序儀完成。3.引物：HBV引物DT3: 5GAT AAG CTT TTA CAT AG AGG ACT CTT GG(1 6501670)3；DT4: 5CTG GAA TTC GGC GAG GGA GTT CTT CTT CTA G3(2 3942 375)；載體引物P31 5CAA AAG

8、 GGT CAG TGC TGC3由ABI310自動(dòng)合成儀合成。4.靶基因片段的克隆及鑒定：以DT3，DT4引物從患有乙型肝炎的病人血清中擴(kuò)增，DNA抽提方法及PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)3，PCR產(chǎn)物的純化、連接及轉(zhuǎn)化參考試劑盒說(shuō)明和文獻(xiàn)4；挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，用EcoRI酶切鑒定，P31/DT4 PCR擴(kuò)增鑒定正向插入，以T7,SP6引物進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定，陽(yáng)性克隆簡(jiǎn)稱為pTA-HBV。5.靶基因片段體外轉(zhuǎn)錄：質(zhì)粒pTA-HBV用BamHI消化成線性后，以Klenow I補(bǔ)平5，參照試劑盒說(shuō)明和文獻(xiàn)1,2進(jìn)行體外32P標(biāo)記轉(zhuǎn)錄(同時(shí)設(shè)立rRZ、rHDVRZA、rHDVRZP對(duì)照)，轉(zhuǎn)錄完后加D

9、Nase I(1 U/ml)，37消化30分鐘，抽提干燥后用RNase-Free H2O重懸。同時(shí)將質(zhì)粒pTA-rRZ、rHDVRZP、rHDVRZA大量轉(zhuǎn)錄并純化。6.切割反應(yīng)：10 ml反應(yīng)體系含0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.02 mol/L MgCl2。取等體積核酶(重組核酶)和32P標(biāo)記HBV轉(zhuǎn)錄物，分別于37，42，55保溫1小時(shí)，加10 ml去離子甲酰胺和1 ml上樣緩沖液，65 10分鐘，7 mol/L尿素-5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影。結(jié)果1.靶基因的克隆及鑒定：將HBV C區(qū)基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pTAdV載體中，用PCR篩選、酶切鑒定得到陽(yáng)

10、性正向克隆pTA-HBV。再經(jīng)EcoRI單酶切，得到831 bp片段，與PCR產(chǎn)物大小相符，序列和方向經(jīng)雙向測(cè)序證實(shí)。2.靶基因的體外轉(zhuǎn)錄：正向插入有HBV C基因片段的重組質(zhì)粒pTA-HBV大小為931 nt。對(duì)照32P-rHDVRZA、rHDVRZP相應(yīng)大小分別約為1782 nt、1044 nt，均與設(shè)計(jì)相符合。3.切割反應(yīng)：核酶與靶RNA在不同溫度下保溫切割的結(jié)果，1、I為HBV對(duì)照(55)，只有一條主轉(zhuǎn)錄帶，rRZ、rHDVRZP在37、42、55切割HBV為兩條帶(721 nt，210 nt)，rHDVRZA在37和55都觀察到切割活性。討論核酶是一類具有催化活性的RNA分子，能特異

11、地識(shí)別和切割靶RNA。針對(duì)HBV復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的RNA中間體的核酶，有望不僅抑制HBV的表達(dá)，而且破壞HBV的復(fù)制。利用DNA重組技術(shù)將特異性核酶結(jié)構(gòu)插入到HDV基因組中，使之成為一種肝細(xì)胞導(dǎo)向性載體6，通過(guò)HDV的復(fù)制，特異地切割HBV靶RNA，阻斷HBV的表達(dá)和復(fù)制，最終清除體內(nèi)的HBV，而HDV由于不能依賴于HBV包裝和釋放，導(dǎo)致自身消亡，具有巨大的應(yīng)用潛力。構(gòu)建HBV特異性錘頭型核酶(rRZ)及插入核酶的HDV基因組重組體rHDVRZA的同時(shí)，鑒于C區(qū)基因比較保守，克隆了831 bp的HBV C基因片段。其靶序列為：UCC AGG GAA UUA GUA GUC AGC UAU GUC

12、 AAU GUU (21412175)，切割點(diǎn)位于21562158的GUC?？紤]到全長(zhǎng)的rHDVRZA可能影響核酶與靶物相互作用，還克隆了部分長(zhǎng)度的重組體rHDVRZP。所有克隆均正向插入到T7啟動(dòng)子下游，以便于體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后電泳顯示主帶明顯，轉(zhuǎn)錄物的大小基本上與設(shè)計(jì)相吻合。切割實(shí)驗(yàn)表明：153 nt的RZ和1 044 nt的rHDVRZP在37均有切割活性，并且在37至55范圍，溫度越高，切割產(chǎn)物帶越明顯(721nt,210 nt)。兩者切割效率相近，表明rHDVRZP中核酶能形成正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)。全長(zhǎng)重組體rHDVRZA在37，55也觀察到切割活性，只是切割活性較低，可能是由于核酶二級(jí)結(jié)構(gòu)

13、形成受影響。核酶的切割涉及很多因素，比如離子強(qiáng)度、溫度、靶與底物分子比、變性劑的存在等。有關(guān)HDV基因組重組體rHDVRZA的體外切割的動(dòng)力學(xué)研究及體內(nèi)復(fù)制和切割活性的研究正在進(jìn)行之中。本課題受廣東省自然科學(xué)基金會(huì)資助作者簡(jiǎn)介:溫淑娟,女,36歲,主管技師.從事基因診斷及基因診斷試劑的開(kāi)發(fā)與研究作者單位:510515,廣州南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)基金技術(shù)中心.參考文獻(xiàn)1Weizsacker FV,Blum HE,Wands JR.Cleavage of heppatitis B virus RNA by three ribozymes transcripted from a single DNA temp

14、late.Biochem Biophy Res Commun,1992,189: 743.2Beck J,Nassal M.Efficient Hammerhead ribozyme-mediated cleavage of the structured hepatitis B virus encapsidation signal in vitro and in cell extracts,but not in intact cells.Nucl Aci Res,1995,23: 4954-4962.3林萬(wàn)明,主編.PCR操作及應(yīng)用指南.北京：人民軍醫(yī)出版社,1993.322-327.4Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular clone labora-tory mannul.2nd.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.42-46.5Hutchins CJ,Rathjen PD,Forster AC,et al.Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avoado sunblotch viroid.Nucl Aci Res,1986,14: 3627-3640.6 Hsi