鹿茸頂端組織GHR基因的cDNA克隆及組織定位_圖文

1、第36卷第9期西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版Vol.36No.9 2008年9月Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.Sep.2008鹿茸頂端組織GHR基因的cD NA克隆及組織定位李艷梅1a,賈康勝2,楊鳴琦1a,徐秀容1b(1西北農(nóng)林科技大學a動物醫(yī)學院,b動物科技學院,陜西楊凌712100;2陜西省珍稀野生動物搶救飼養(yǎng)中心,陜西西安710402摘要【目的】檢測鹿茸頂端組織GHR基因的表達,為鹿茸再生的分子機理研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)GenBank已發(fā)表的牛、山羊和綿羊生長激素受體(GHR基因序列,用CL USTAL

2、W軟件進行同源性分析,在保守序列設計克隆鹿GHR基因編碼序列的引物。以34歲健康鹿生長30d的鹿茸頂端組織提取的總RNA為模板,利用R T2PCR技術(shù)克隆GHR基因的cDNA序列;并用原位雜交技術(shù)對GHR基因在鹿茸頂端進行組織定位?！窘Y(jié)果】成功克隆到了1967bp的序列(G enBank登陸號為EU381142,該序列包含GHR基因的全部編碼序列。鹿GHR基因與牛、羊、人GHR核苷酸同源性分別為97%,97%和80%,GHR蛋白氨基酸序列同源性分別為97.9%,97.6%和77.3%。雜交結(jié)果顯示,在皮膚層、間葉細胞層、軟骨膜層和軟骨層的陽性組均有藍色雜交信號?！窘Y(jié)論】利用R T2PCR技術(shù)和

3、原位雜交技術(shù)在鹿茸頂端皮膚層、間葉細胞層、軟骨膜層和軟骨層均檢測到GHR的表達。關(guān)鍵詞鹿茸;GHR;基因克隆;原位雜交中圖分類號Q786文獻標識碼A文章編號167129387(20080920005206cDNA cloning and tissue localization of GHR gene in antler tipL I Yan2mei1a,J IA Kang2sheng2,YAN G Ming2qi1a,XU Xiu2rong1b (1a College of V eteri nary Medicine,b College of A ni mal S cience,N ort h

4、west A&F Universit y,Yangling,S haanx i712100,China;2Rare W il d A ni mal Rescuing and Feeding Center of S haanxi,X ian,S haanx i710402,ChinaAbstract:【Objective】The st udy was to detect exp ressio n of GHR in antler tip to p rouide t heoretical basis for regeneratio n of anter molecular machanis

5、m.【Met hod】A pair of primers were designed according to t he homology region of GHR among ot her species.Total RNA was isolated f rom antler tip,t he growing antlers from3-4years spotted deer were removed on t he30t h day after t he mineralized ones shed,and t he cDNA sequence of GHR gene was cloned

6、 by R T2PCR technology.Then,in sit u hybridization was per2 formed to detect exp ression of GHR in t he antler tip.【Result】Co mplete coding sequence of GHR gene was cloned(GenBank accepted number is EU381142,including1967bp.Compared wit h ot hers,t he homology of GHR to bovine,ovine and human was97%

7、,97%and80%respectively,but t he homology of protein was 97.9%,97.6%and77.3%respectively.Hybridization signals were obtained using in sit u hybridization.【Conclusion】The result s of R T2PCR and in sit u hybridization showed t hat four regions had expression of GHR in deer antler tip.K ey w ords:deer

8、antler;GHR;gene cloning;in sit u hybridization3收稿日期2008203226基金項目西北農(nóng)林科技大學博士科研啟動費(01140501作者簡介李艷梅(1981-,女,河北唐山人,在讀碩士,主要從事動物生理學研究。E2mail:7311647通訊作者徐秀容(1969-,女,湖北英山人,副教授,博士,主要從事生物技術(shù)與動物遺傳育種研究。E2mail:xiurong_xu鹿為現(xiàn)存惟一可再生茸的動物,是目前繼家畜后馴化程度最高的經(jīng)濟動物之一122。鹿茸是一種特殊的骨組織,其上沒有肌肉附著,而是由一層豎毛的表皮所覆蓋,內(nèi)含膠質(zhì)等前成骨組織,富含血管和神經(jīng)3。鹿

9、茸是哺乳動物惟一在失去后還能完全再生的器官,是研究哺乳動物器官再生及創(chuàng)傷修復的理想動物模型4。在鹿茸的生長期(約90120d骨軸的延伸很快,可達12cm/d,相應表皮層也生長很快,以便覆蓋新增長的骨質(zhì),且每年鹿茸都進行周期性替換即鹿茸的再生,因此人們推測鹿茸中可能存在某種活性物質(zhì),控制并刺激鹿茸的生長。胰島素樣生長因子21(IGF21最有可能是該種活性物質(zhì),其是骨吸收和骨形成的重要偶聯(lián)因子。生長激素(GH做為一種重要的內(nèi)分泌因子,對骨骼的作用復雜,在骨細胞中GH與其特異性受體生長激素受體(GHR結(jié)合,通過J A K22MA P K2STA T途徑促進I型膠原、堿性磷酸酶、骨鈣素的表達和分泌。動

10、物模型研究表明,注射GH可以加速骨重建,增加骨量和骨強度,促進骨折愈合5。Suttie等6研究發(fā)現(xiàn),赤鹿血液中的GH水平與鹿茸生長有一定相關(guān)性,但至今還未見證明GH直接參與鹿茸軟骨細胞增殖和分化的相關(guān)研究報道。為此,本研究通過原位雜交技術(shù)檢測了鹿茸頂端組織GHR的表達情況,以期為鹿茸再生的分子機理研究提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1試驗動物取生長30d34歲鹿的鹿茸(陜西銀戶生態(tài)產(chǎn)業(yè)園:一部分放入液氮中帶回實驗室,保存于-80,用于RNA提取;另一部分立即切成約1.5cm×1.2cm×0.2cm大小,放入40g/L多聚甲醛中固定34h,轉(zhuǎn)到150g/L蔗糖溶液

11、中過夜,然后倒掉蔗糖溶液保存于-80,用于原位雜交。1.1.2主要試劑Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid TM First St rand cDNA Synt hesis K it和dN TP Mixt ure為Invit rogen公司產(chǎn)品,L A T aq DNA Polymerase和p MD218T vector為Ta KaRa 公司產(chǎn)品,DNA Marker和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司,E.coli D H5、H.Q.&.Q質(zhì)粒微量提取試劑盒購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司,T7RNA聚合酶和地高辛標記及原位雜交試劑盒為Roche公司產(chǎn)品。

12、1.2引物設計與合成根據(jù)GenBank發(fā)表的牛、羊GHR基因cDNA 序列,在高度同源區(qū)設計引物。其中GSP2GHR為反轉(zhuǎn)錄引物,GHR2CDS為以cDNA第一鏈為模版擴增鹿GHR基因編碼序列的引物,引物序列見表1。引物均由上海英俊生物工程服務有限公司(in2 vit rogen合成。表1GHR的引物序列Table1Primers sequences of GHR基因Gene 引物序列Primer產(chǎn)物長度/bpLengt h of amplified fragmentGSP2GHR52A T TCA T GCCCCA GCCAAC23GHR2CDS F:52GGTCCTACA GGTA T G

13、GA TCTCT GG23R:52A GCCAACCCT GT GCCA T TC231967GHR1 GHR2F:52CCT GTCCCA GA T TA TACCTCCA23R:52CCAACCCT GT GCCA T TCAA23196GHR12T F:52TAA TACGACTCACTA TA GGG CCT GTCCCA GA T TA TACCTCCA23GHR22T R:52TAA TACGACTCACTA TA GGG CCAACCCT GT GCCA T TCAA231.3鹿茸頂端組織GHR基因的克隆1.3.1總RNA的提取用Trizol試劑盒提取鹿茸頂端組織的總RNA,提取

14、的總RNA用15g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。1.3.2R T反應以基因特異性引物GSP2GHR 為反轉(zhuǎn)錄引物,鹿茸頂端組織總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。在反應體系中分別加入總RNA2.0L,4mol/L GSP2GHR0.5L,10mmol/L dN TP Mixture1.0L和D EPC水9.5L,于65孵育5min,立即置冰上冷卻后加入下列試劑:5×First2St rand Buffer4.0L,0.1mol/L D T T 1.0L,40U/L RNase inhibitor 1.0L,200 U/L SuperScript TMR T1.0L,反應總體積20L

15、。在PCR儀中,50反應60min,70孵育15min后終止反應,冰上冷卻。1.3.3PCR反應PCR反應體系為20L:46西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版第36卷mol/L上、下游引物各2.0L,2.0L10×PCR Buffer,1.6L25mmol/L MgCl2,2.0L2mmol/L dN TP Mixture,8.8L滅菌的二蒸水,0.2L5 U/L L A T aq DNA Polymerase,1.4L cDNA模板。反應條件:954min;9430s,6030s, 722min,38個循環(huán);727min,4保存。利用MyCycler TM Thermal Cycle

16、r(BIO2RADPCR儀進行擴增。PCR產(chǎn)物用15g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。1.3.4擴增片段的分離和克隆利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,從普通15g/L瓊脂糖凝膠上回收特異性條帶,回收產(chǎn)物連接于p MD218T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli D H5,涂布平板,進行藍白斑篩選,然后分別接種于10mL LB培養(yǎng)基中,37振蕩過夜培養(yǎng)。1.3.5重組質(zhì)粒的酶切鑒定將抽提的質(zhì)粒經(jīng)Eco R和H i n d雙酶切鑒定。經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定均為陽性的克隆,交由上海生工生物工程有限公司測序。1.4原位雜交試驗將1.1.1中已固定好的組織修塊,用A PES處理的載玻片貼片,制備冰凍切片,冰

17、凍切片的厚度為10m。1.4.1探針制備根據(jù)GHR基因編碼序列測序結(jié)果,設計引物GHR1和GHR2(詳見表1。GHR1和GHR2加上T7啟動子接頭后的引物為GHR12T和GHR22T,然后分別以GHR12T和GHR2,GHR1和GHR22T為引物克隆到長度為196bp的序列。PCR產(chǎn)物回收純化后作為轉(zhuǎn)錄模板,用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄,地高辛標記,分別轉(zhuǎn)錄出與mRNA互補的cRNA(陽性探針及與mRNA 鏈序列相同的探針RNA(作為陰性對照。1.4.2預雜交在DEPC處理的PBS(p H7.4中孵育切片2次,每次5min,用不含RNA酶的1g/mL蛋白酶K在37下通透切片30min,4下用DEPC

18、處理的PBS溶液配制的40g/L多聚甲醛后固定切片5min,DEPC處理的PBS沖洗切片2次,每次5min,0.1mol/L三乙醇胺(TEAp H8.0振蕩漂洗2次,每次5min,再用DEPC處理的PBS 沖洗切片1min,37預雜交液中孵育切片60min。1.4.3原位雜交棄去預雜交液,每張切片滴加3040L的雜交液(4×SSC,100g/L dext ran sul2 fate,1×Denhardts solution,2mmol/L ED TA, 500mL/L deionized formamide,500g/mL鮭魚精DNA,RNA探針,用原位雜交專用的雜交膜(h

19、y2 drop hobic plastic coverslip覆蓋切片,置42濕盒內(nèi)孵育切片16h。1.4.4雜交后處理37將切片浸泡于2×SSC 中510min,去掉雜交膜,37用含600mL/L甲酰胺的0.2×SSC沖浸泡沖洗切片2次,每次15 min,2×SSC洗切片2次,每次510min。1.4.5雜交后顯色Buffer(p H7.5振蕩漂洗切片2次,每次10min,每張切片滴加40L bloc2 king reagent孵育30min,用blocking Buffer(含1200稀釋的羊抗地高辛抗體A KP結(jié)合物孵育切片2h,在Buffer中洗切片2次,

20、每次10min,Buffer (p H9.5中孵育切片10min,每張切片滴加100L顯色液,在暗室下顯色16h(224h,顯色后用Buffer(p H8.1終止顯色反應,雙蒸水沖洗切片,甘油封片,晾干后拍照觀察。2結(jié)果與分析2.1鹿茸頂端組織提取總RNA的檢測檢測結(jié)果顯示,提取的鹿茸頂端組織總RNA 5S,18S和28S3條帶清楚可見,條帶整齊(圖1,表明提取的總RNA沒有降解,完整性較好,可用于后續(xù)試驗 。圖1鹿茸頂端組織提取總RNA的電泳結(jié)果Fig.1Electrophoresis profiles of totalRNA f rom antler tip2.2鹿GHR基因編碼序列的克隆

21、利用R T2PCR技術(shù)擴增鹿茸頂端組織GHR基因編碼序列,PCR產(chǎn)物用15g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,得到一條約2000bp的特異性條帶(圖2,與目的片斷大小相符。2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pMD218T后轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli D H5細胞,抽提質(zhì)粒DNA,用PCR方法對陽性克隆進行初步篩選,然后經(jīng)Eco R和H i n d雙酶切,可見2個DNA片段(圖3,大小分別與線性p MD218T載體和鹿GHR基因相一致。7第9期李艷梅等:鹿茸頂端組織GHR基因的cDNA克隆及組織定位 圖2鹿茸頂端組織GHR 基因PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果M.Marker ;1,2.GHR 基因

22、Fig.2Electrophoresis result of GHR PCR productsM.Marker ;1,2.GHR gene圖3重組質(zhì)粒的Eco R 和Hin d 酶切鑒定Fig.3Eco R and Hin d restrication identificationof recombinant plasmid2.4鹿GHR 基因的同源性分析測序結(jié)果表明,克隆的序列長度為1967bp 。比對分析表明,該序列為鹿GHR 基因cDNA 序列,從第13位到1917位為CDS 區(qū)。序列已經(jīng)向Gen 2Bank 提交,登陸號為EU381142。將編碼區(qū)與Gen 2Bank 中已發(fā)表牛、羊和

23、人的GHR 基因序列進行比對,核苷酸同源性分別為97%,97%和80%,GHR 蛋白氨基酸序列同源性分別為97.9%,97.6%和77.3%。表明在鹿與牛、羊間GHR 基因和GHR 蛋白的同源性均較高。在鹿、羊和牛GHR 基因的氨基酸序列中,118氨基酸片段為信號肽序列,145246氨基酸片斷為FN3結(jié)構(gòu)域序列。在GHR 肽鏈末端的細胞外配體結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列中,鹿與羊、牛的同源性更高,鹿和羊該區(qū)域的氨基酸序列完全相同,而鹿與牛的僅有1個氨基酸殘基不同,鹿的GHR 位點為亮氨酸殘基,牛的為甲硫氨酸殘基。2.5原位雜交用地高辛標記的RNA 探針,BCIP/NB T 顯色系統(tǒng)在鹿茸頂端組織的冰凍

24、切片上進行原位雜交,圖4中箭頭所示藍色顆粒為雜交陽性信號。雜交結(jié)果顯示,在皮膚層、間葉細胞層、軟骨膜層和軟骨層的陽性組均有藍色雜交信號,而陰性對照組均無雜交信號,說明以上各層均有GHR 基因的表達。3討論研究發(fā)現(xiàn),GH 和IGF 21在骨代謝中起重要作用728,GH 的大部分生理功能是通過IGF 21實現(xiàn)的,GH 與其受體GHR 結(jié)合后,直接或通過上調(diào)IGF 21的表達間接發(fā)揮對骨細胞的調(diào)節(jié)作用;GH 也可以通過IGF 21的介導作用于軟骨細胞,促進其增殖和基質(zhì)形成9。研究證實,在鹿茸頂端可檢測到IGF 21及其受體的表達10212。體外培養(yǎng)試驗表明,IGF 21促進鹿茸軟骨細胞的增殖和分化4

25、。而Elliott 13通過放射自顯影和RRA 技術(shù)在鹿茸各部位中只檢測到IGF 21受體,沒有檢測到GHR 的分布。原位雜交是在分子生物學領(lǐng)域應用極為廣泛的試驗技術(shù)之一,同時也是生物體發(fā)育研究過程中的一種極為重要的分子遺傳學研究方法14215。由于地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色(標記堿性磷酸酶2抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng),有較好的反差背景;RNA 探針是單鏈分子,所以它與靶序列的雜交反應極高,有報告認為其雜交率高于DNA 探針的8倍,因此本試驗采用地高辛標記的RNA 探針進行原位雜交,以獲得更好的雜交信號。本試驗結(jié)果顯示,在鹿茸頂端組織存在GHR 基因的表達,并且從鹿茸頂端組織成功克隆出GHR c

26、DNA 編碼區(qū)全長序列,其與牛和羊的GHR 基因在核苷酸和氨基酸水平都具有較高的同源性。本試驗分析了牛、羊和鹿GHR 基因的氨基酸序列同源性,結(jié)果顯示,鹿的GHR 與牛、羊GHR 的氨基酸序列同源性分別達到97.9%和97.6%,與GHR 肽鏈末端的細胞外配體結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列同源性更高,鹿和羊該結(jié)構(gòu)域氨基酸序列完全相同,鹿和牛該結(jié)構(gòu)域僅有1個氨基酸殘基不同,鹿GHR 該位點為亮氨酸殘基,牛GHR 為甲硫氨酸殘基,這兩個氨基酸都具有疏水基團。因此,Elliott 13利用牛和羊的GH 為配體檢測鹿茸頂部GHR 的分布,檢測結(jié)果為陰性的原因可能是種屬特異性或方法敏感性的差異所致。4結(jié)論本試驗利

27、用原位雜交試驗首次證實GHR 在鹿茸頂端各部位都有表達,還成功克隆了GHR cDNA 編碼區(qū)全長序列,這為進一步研究GH 2IGF 21軸對鹿茸生長的調(diào)控機理奠定了理論基礎。8西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版第36卷 圖4GHR mRNA 在鹿茸頂端的定位(×200A.皮膚層GHR mRNA 原位雜交染色;B.間葉細胞層GHR mRNA 原位雜交染色;C.軟骨膜層GHR mRNA 原位雜交染色;D.軟骨層GHR mRNA 原位雜交染色;a ,b ,c ,d.分別為A ,B ,C ,D 的陰性對照Fig.4Tissue localization of GHR mRNA in antle

28、r tip (×200A.In situ hybridization staining of GHR mRNA in t he velvet skin ;B.In situ hybridization staining of GHR mRNA in mesenchymal cell ;C.In situ hybridization staining of GHR mRNA in perichondrium ;D.In situ hybridization staining of GHR mRNA in cartilaginous zone ;a ,b ,c ,d.Negative c

29、ontrol9第9期李艷梅等:鹿茸頂端組織GHR 基因的cDNA 克隆及組織定位10 西北農(nóng)林科技大學學報 ( 自然科學版 第 36 卷 參考文獻 1 Chap man D I. Antler2bones of contention J . Mammal Rew , 3 王秋玉 ,王本祥 . 論鹿茸生長因子 J . 中醫(yī)藥學報 ,2000 ,6 :10. ation of deer antlers J . Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci , 2004 ,359 (1445 :8092822. 39242. 3512360. (43 :31666231674

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