特應性皮炎的綜合高通量研究：通過OMICS手段探討疾病的核心

1、特應性皮炎的綜合高通量研究：通過OMICS手段探討疾病的核心蛋白與生物標志物目的和意義隨著現(xiàn)代化和工業(yè)化進程的加快,特應性皮炎(AD)患病率增高,是皮膚病和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點。AD是一種慢性炎癥性皮膚病,易反復發(fā)作,以濕疹性皮損分布為特征。主要病理生理表現(xiàn)為苔蘚樣硬化、瘙癢性脫皮和皮膚干燥。AD是一種系統(tǒng)性功能失調(diào)性疾病,可同時觸發(fā)哮喘、過敏性鼻炎和食物過敏,伴有血漿IgE和嗜酸性粒細胞升高。已報道多種細胞參與了AD的發(fā)病,如嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、朗格漢斯細胞和角質(zhì)形成細胞,這些細胞都與細胞因子、化學增活素和IgE等血液因子以及與微生物感染有關(guān)。雖然大多數(shù)AD患者血漿IgE升高,但AD

2、疾病中存在一個亞組對空氣、食物過敏原無致敏性。AD疾病可分為兩個類型:內(nèi)源性和外源性。外源性AD(ADe)占AD疾病的70-80%,具有Th2細胞調(diào)節(jié)的血漿IgE增高,引起IgE介導的致敏作用的特征。與ADe不同,內(nèi)源性AD(ADi)占AD疾病的20-30%,沒有IgE介導的致敏作用和過敏反應。高通量篩選(HTS)方法如DNA芯片和2D-PAGE/MALDI-TOF分析已開始用于AD相關(guān)候選基因的篩選。通過HTS,可以找出大量在AD中上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)或基因,同時,相互作用組工具如PPI圖能有助于核心蛋白的挑選。因為接下來的功能研究是一個耗時、花費較大的過程,所以對目標基因的篩選顯得非常重要,

3、因此,通過對HTS結(jié)果的計算機預測分析是作出正確選擇的關(guān)鍵。PPI圖中列出的候選基因為理解復雜的AD疾病提供了重要信息。一旦PPI預測的相互反應配偶體得到證實,將為疾病相關(guān)的基因調(diào)節(jié)途徑提供新的見解。已知與AD疾病相關(guān)的重要因素有IgE/FcRI、抗微生物肽、細胞因子/化學增活素、蛋白酶及其受體、脂質(zhì)基因、自身抗原、細胞外基質(zhì)基因、表皮分化復合物等。在這個基礎(chǔ)上,研發(fā)出新的治療方法,并且已經(jīng)用于AD的臨床治療。盡管目前對AD的治療有多種途徑,但是AD患者在增加,能否提供有效治療方法如快速緩解嚴重癥狀的方案仍是個嚴峻的挑戰(zhàn)。因此,需要更深入的研究AD的發(fā)病機理,進一步闡明其免疫機制。另外本研究還

4、進行了分子水平的環(huán)境毒理學研究。環(huán)境小分子化學物進入體內(nèi),可以與體內(nèi)最主要的生物大分子一蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,除了通過共價作用形成蛋白加合物外,環(huán)境化學物可能會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象,導致蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊,從而產(chǎn)生環(huán)境健康風險。這種途徑是否與折疊病的環(huán)境因素有關(guān),迄今為止,這方面的報道較少,有必要開展深入研究。本研究以腦型肌酸激酶(CK-BB)為模型,試圖探討小分子化合物對酶的結(jié)構(gòu)與功能影響。在了解CK-BB去折疊與再折疊過程基礎(chǔ)上,進一步對日常生活中人群接觸的頻率較高的十二烷基硫酸鈉(SDS)作用及與CK-BB結(jié)合機制進行了探討,而且闡述了兩種可能與退行性疾病相關(guān)的環(huán)境化學物,丙烯酰胺與鋅離子,對

5、CK-BB的結(jié)構(gòu)與功能影響的作用機制。研究方法1.本研究中對患者活檢樣本、原代細胞培養(yǎng)(角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞)和血清樣本中的基因改變進行研究。所有的AD樣本分為外源性(ADe)和內(nèi)源性(ADi)兩型。非特異性正常對照組(n=22),均無個人或家族史,過敏性疾病癥狀和體征,其樣本選自整形外科手術(shù)取下的皮膚。從ADe和ADi患者(n=40)皮損處取直徑3-5mm活檢樣本。20名ADe患者(SCORAD:50.0915.68),20名ADi患者(SCORAD:46.3811.77)。ADe組和ADi組總IgE水平、紅細胞計數(shù)和年齡的平均值分別為:1739 U/mL,625/L and 27.4歲

6、和105U/mL,248/L and 28.2歲。所有樣本均取自于男性。血清按照之前報道的方法收集,等分試樣后儲藏在-80。DNA芯片的制備按照RNA制備、標記和雜交步驟進行:分別準備正常對照、ADe、ADi樣本,每個樣本均進行cDNA模板合成和標記。分別采用兩種芯片對不同樣本進行檢測:GeneChip(?)人U133 Plus 2.0芯片和GenePlorerTwinchip人-8K芯片?；虮磉_比值經(jīng)過圖像分析,并用LOWESS回歸方程標準化。應用SAM和DEG。選擇q值(按照5%)有明顯表達差異(2倍)的基因。GeneChip(?)人U133 P1us 2.0芯片用來進行ADe和ADi皮

7、膚組織的分析,而GenePlorer Twinchip人-8K芯片用于分析特應性角質(zhì)形成細胞。自流電泳(FFE)和2-DE分別用于特應性成纖維細胞和血清處理分析?；颊咴葱匝褰?jīng)多重親和移除柱(MARC)處理后進行2-DE分析。接下來,用苯基瓊脂糖樹脂分段式方法進行AD血清蛋白質(zhì)的分析。血清經(jīng)柱子分離后TCA沉淀。根據(jù)以上結(jié)果,可采組學工具來進行核心基因和蛋白質(zhì)的預測。PPI預測使用了PPI的主要算法,包括:1)蛋白結(jié)構(gòu)相互作用使用PSIMAP(蛋白質(zhì)組圖譜),一種使用SCOP(蛋白結(jié)構(gòu)分類)數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)域的方法;2)蛋白質(zhì)實驗性相互作用PEIMAP(蛋白質(zhì)組圖譜),是一種普遍的使用實驗性蛋白相互

8、反應信息資源的方法,如HPRD、BIND、DIP、MINT、IntAct和BioGid。2.重組人CK-BB按照之前報道的方法進行表達和純化。CK-BB活性測定采用ATP和肌酸反應釋放質(zhì)子,在百里酚藍指示劑存在下,其597nm光吸收變化速率對應于酶活性。內(nèi)源熒光和ANS結(jié)合光譜方法檢測CK-BB三級結(jié)構(gòu)的影響。采用圓二色譜分光光度計,在190-250nm范圍內(nèi)記錄遠紫外圓二色譜(CD)光譜檢測CK-BB二級結(jié)構(gòu)的影響。等溫滴定微量量熱法采用3101TAM恒溫箱按照之前報道的方法進行測量。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中獲得已知的CK-BB同源性結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)同系物牛的視黃醛肌酸激酶A鏈(PDB編碼:1g

9、0w)是一個良好的CK-BB結(jié)構(gòu)模板(含97%相同序列)。結(jié)合模擬操作分為:1)計算相應的受體和3D配體,2)對接大小特征,3)計算網(wǎng)格評分,4)決定補充受體和配體對接。結(jié)果1.Affymetrix芯片檢測出406種差異表達基因(DEG),在正常人和AD患者(ADe和ADi)之間,鑒別出130個DEG;在正常人和ADe患者之間,鑒別出327個DEG;在正常人和ADi患者之間,鑒別出146個DEG。8K cDNA芯片結(jié)果顯示在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞AD疾病中有157個基因失調(diào)。接下來,通過FFE在AD成纖維細胞中獲得93個候選基因。MARC處理后的AD血清樣本檢測到30個上調(diào)蛋白質(zhì)和19個下調(diào)蛋

10、白質(zhì)。改進分段方法,檢測到9個失調(diào)基因。Affymetrix芯片分析利用PSIMAP和PEIMAP兩種不同的生物信息學計算方法得到5個和8個核心基因,分別是:PIK3R1、IGF1R、MAPK13、SFN、YWHAE和CORIN、COL14A1、CLCA4、PTPRC、IL10RA、C1S、PHLPP、SLITRK6。應用8K cDNA芯片在角質(zhì)形成細胞中找出25個基因。通過FFE在AD成纖維細胞中4個核心蛋白在PSIMAP和PEIMAP算法中均檢測到,即:I55423、ARR3、YWHAE和EEF1A1。AD血清樣本的2-DE結(jié)果中發(fā)現(xiàn)26種蛋白質(zhì)。AD組織中SFN和PTPRC經(jīng)實時PCR進

11、一步驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SFN在ADi中上調(diào)4.5倍,PTPRC在ADe和ADi中分別下調(diào)60%和46%。ELISA結(jié)果顯示,MMP1和MMP10在ADi患者中均上調(diào)。ADi患者血清的ELISA研究結(jié)果表明,與正常人和ADe患者相比較,MMP1和MMP10顯著上調(diào)(幾乎兩倍),均存在統(tǒng)計學差異,采用隨機配對和Wilcoxon檢測。2.對SDS使CK-BB的折疊后的失活進行了研究。SDS能非競爭性抑制CK-BB的活性(K_i=1.22mM)。SDS與CK-BB暴露的疏水表面結(jié)合誘導其三級結(jié)構(gòu)的改變。SDS配體結(jié)合熱力學參數(shù)的改變?nèi)珈?、吉布斯自由能和熵分別為-137.0MJ/mol,8.39

12、kJ/mol and-42.754 kJ/(Kmol)。研究明確了重要的CK-BB結(jié)構(gòu)以及和SDS相互反應的折疊和抑制動力學信息。預測的結(jié)構(gòu)具有0.51(?)的均方根偏差。CK-BB與SDS之間對接成功,具有顯著性評分(-4.67 kcal/mol,自動對接4和-48.32 kcal/mol,DOCK6)。丙烯酰胺對腦型肌酸激酶(CK-BB)的抑制效應研究發(fā)現(xiàn),CK-BB能被動態(tài)的失活并伴隨疏水表面的暴露。丙烯酰胺主要與CK-BB的硫氫基(-SH)殘基相互作用導致烷化。計算機模擬對接支持丙烯酰胺直接結(jié)合到CK-BB的活性位點上,主要與CYS74和GLY73殘基相互作用。Zn(2+)通過劑量依賴

13、效應失活CK-BB(IC50=0.06 mM)。Zn(2+)顯著誘導CK-BB疏水基表面破裂導致三維結(jié)構(gòu)改變。還發(fā)現(xiàn)Zn(2+)能使CK-BB發(fā)生聚沉。聚沉依賴于溫度以及酶和Zn(2+)的濃度。結(jié)論1.為了更深入了解AD發(fā)病機制,明確在AD病情發(fā)展中有多少基因起作用,進行了大規(guī)模的微陣列研究,得到許多新的相關(guān)信息。結(jié)果主要集中在AD相關(guān)基因大規(guī)模DNA芯片研究的描述上,這將為全面了解AD疾病提供新的見解,但是結(jié)果中尚不包括詳細的功能研究。在后續(xù)的實驗中進行了AD皮膚組織的研究并檢測到了核心基因。然后進行角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的研究。同時還對AD患者血清中蛋白質(zhì)差異表達進行了研究。已知多種因子

14、參與了AD的發(fā)病,不同的患者中存在多種觸發(fā)因素,本研究數(shù)據(jù)提示人表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞活化在AD疾病中起作用。然而,在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞中檢測到的蛋白質(zhì)或基因可能提示著體內(nèi)也存在相應的蛋白質(zhì)變化,但是mRNA水平和表達的蛋白質(zhì)水平之間的差異干擾了對AD中準確作用的理解。大規(guī)模的芯片研究結(jié)果能有助于深入了解AD發(fā)病機制的復雜的相關(guān)因素。結(jié)合表達數(shù)據(jù)分析和蛋白質(zhì)相互作用組預測能找到更可靠的與AD疾病相關(guān)的基因。預測的蛋白質(zhì)相互作用配體和核心蛋白能為下一步AD治療的功能研究提供有效、可靠的靶點。AD患者數(shù)量迅速增多,急需找到特異性診斷和敏感性治療方法。因此,OMICS手段的

15、應用改善了對AD皮膚組織的表達形式以及組分如角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的研究。根據(jù)本研究,得出以下結(jié)論:1)生物信息學工具結(jié)合HTS數(shù)據(jù)篩選新的核心基因或蛋白,在今后的功能學研究和臨床藥物開發(fā)中將發(fā)揮重要作用;2)本研究中發(fā)現(xiàn)多個在AD源性樣本中表達顯著改變的重要基因,如SFN、PTPRC、MMP1和MMP10,可能是AD疾病的生物學標記;3)本研究中預測出的大部分核心蛋白、以及實時PCR檢測出的候選基因/蛋白在之前關(guān)于AD發(fā)病機制的研究中未見報道;4)結(jié)合基因組學、蛋白質(zhì)組學和相互作用組分析方法等研究手段將有助于AD復雜病理機制的研究,以及準確的生物標記物或臨床治療靶點的探測。2.本部分研究我們以腦型肌酸激酶(CK-BB)為模型,探討了小分子工業(yè)化學物通過影響酶的結(jié)構(gòu)和功能,引發(fā)蛋白質(zhì)錯去折疊,導致酶的失活以及聚沉的毒理途徑。不管是SDS(兩親變