溶菌酶的制備酶活力和蛋白濃度的測定

1、溶菌酶的制備、蛋白質(zhì)的測定及該酶比活力的測定Lysozyme preparation, protein determination and the determination of enzyme specific activity生物制藥工藝學期末考核討論：報告人：（0834110）08屆食品學院制藥1班2011.4.29溶菌酶的來源： 1922年的一天，正在感冒的英國細菌學家Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)，把一些鼻粘液加入細菌的培養(yǎng)基后會引起細胞的溶解。而這種存在于鼻粘液中的能殺死細菌的重要物質(zhì)被認為是一種酶， Fleming命名其為溶菌酶（ Lysozyme ）。 那時，溶菌酶不能

2、證明有臨床價值。但是在酶機制的研究學習方面，溶菌酶扮演了一個很重要的角色。溶菌酶的結(jié)構(gòu)在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射線晶體（X-ray crystallography）結(jié)構(gòu)分析法闡明了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)(tertiary structure)。溶菌酶的作用機制： 溶菌酶是一種N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，該酶可以催化水解細菌細胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，使內(nèi)容物溢出而是細菌溶解，阻礙致病細菌的活性繁殖，并殺死細菌。溶菌酶的制備 實驗原理 實驗材料、試劑及儀器 實驗步

3、驟 實驗看法溶菌酶的制備 本實驗主要是以雞蛋清作為實驗材料，采用D152型樹脂柱層析法除去雜蛋白及等電點法提取溶菌酶的粗品溶菌酶的制備： 雞蛋清中約含有0.3的溶菌酶，分子量為14，000，等電點為11.1，最適溶菌溫度為50，最適pH值為7。雞蛋清溶菌酶化學性質(zhì)非常穩(wěn)定，當pH值在1.211.3范圍內(nèi)劇烈變化時，其結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變，遇熱時該酶也很穩(wěn)定，在pH47的范圍內(nèi)，100處理lmin，仍保持原酶活性。但在堿性環(huán)境中，該酶對熱穩(wěn)定性較差。其一級結(jié)構(gòu)由129個氨基酸殘基組成的一條多肽鏈，其穩(wěn)定性主要與多級結(jié)構(gòu)中的4對二硫鍵、氫鍵及疏水鍵相互作用。 人溶菌酶的溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。 溶

4、菌酶的制備 實驗主要儀器、材料及試劑：（一）主要儀器： 高速冷凍離心機、恒流泵、部分收集器（二）材料及儀器： D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂，新鮮雞蛋，0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，pH7.0 , 氯化鈉，硫酸銨，0.5mol/L NaOH, 0.5mol/L HCl,層析柱（2.6cm*30cm）, 無水乙醇 ， 聚乙二醇溶菌酶的制備 實驗步驟： 蛋清樣品的制備： 取出蛋清，加入1.5倍體積的0.1mol/L磷酸鹽緩沖劑，攪拌均勻，將pH值調(diào)至8左右，然后用八層紗布過濾，去濾液，量取體積并記錄。溶菌酶的制備 實驗步驟： 陽離子交換層析的制備：1、D152樹脂的處理：將D152樹脂先將蒸餾水

5、洗去雜物，濾除，用1mol/L NaOH攪拌浸泡并攪拌48h，抽濾干NaOH,用蒸餾水洗近pH7.5左右，抽濾干，再用1mol/L HCl按上述方法處理樹脂，知道全部轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫停闉V干HCl，用2mol/ L NaOH處理樹脂，是指轉(zhuǎn)變?yōu)殁c型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH6.5）平衡樹脂。2、裝柱：取直徑為2.6cm，長度為30cm的層析柱，自頂部注入經(jīng)處理過的上述樹脂懸浮液，關閉層析柱出口，帶樹脂沉降后，放過量的溶液，再加上一些樹脂，至樹脂沉積至1520cm高度即可。與柱子頂部繼續(xù)加入0.02mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH6.5）平衡樹脂。最終是流出

6、液pH為6.5為止，關閉柱子出口，保持頁面高出樹脂表面1cm。溶菌酶的制備 裝柱吸附：將上述蛋清液仔細加入到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流如注內(nèi)，流速為1ml/min。 去雜蛋白：取出樹脂，用柱平衡液洗去樹脂上可能有的雜蛋白。在手機洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢測雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5、濃度為0.02mol/L 磷酸鈉緩沖液洗脫收集洗脫液！ 聚乙二醇濃縮：將上訴洗脫液合并裝入透析袋內(nèi)，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加蓋。酶液中的水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得濃縮液之后的透析袋用蒸餾水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！

7、小心取的濃縮版的溶菌酶溶液實驗看法： 與教科書P488頁制備方法不同的是：教材所選用的吸附方法使用磁力攪拌器攪拌蛋清液和樹脂，個人覺得此方法可以用于樣品較小的情況下，大約在300毫升以下！溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 實驗原理 實驗儀器、材料及試劑 試劑配制 實驗步驟溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 實驗儀器、材料及試劑： （一）儀器：721分光光度計 (二) 材料及試劑： 溶菌酶，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，溶壁微球菌干粉，氯化鈉，考馬斯亮藍G-250, 95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）溶菌酶蛋白濃度的測定 實驗原理： 棕紅色的染料考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，形成藍色的復合物最大吸光

8、度由465nm變?yōu)?95nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白和染料的結(jié)合符合比爾定律。通過測定595nm處的光吸收值的增加量，可對蛋白質(zhì)濃度進行定量測定。 溶菌酶活力、蛋白濃度的測定 試劑的配制：1、測活緩沖液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.2。2、底物濃度：40mg溶壁微球菌干粉，榮譽100mL測活緩沖液中。3、考馬斯亮藍G-250試劑;考馬斯亮藍G-250 100mL 95%乙醇中，加入100mL 85%鹽酸，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過濾。4、標準蛋白質(zhì)溶液，用含有0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0(緩沖液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。

9、5、溶菌酶液配制：取上述實驗中所獲得的溶菌酶粗品液，榮譽100mL的測活緩沖液。溶菌酶蛋白濃度的測定 實驗步驟 標準曲線的測定： 取14支試管按下表，分兩組進行平行操作：管號管號0 01 12 23 34 45 56 6標準蛋白標準蛋白溶液溶液/mL/mL0.00 0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.04 0.05 0.05 0.06 0.06 緩沖液緩沖液A/mLA/mL0.10 0.10 0.09 0.09 0.08 0.08 0.07 0.07 0.06 0.06 0.05 0.05 0.04 0.04 考馬斯亮考馬斯亮藍藍G-G-250/

10、mL250/mL5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 搖勻，搖勻，1h1h內(nèi)以內(nèi)以0 0號管為空白對照，在號管為空白對照，在595nm595nm處處比色比色A A295295溶菌酶蛋白濃度的測定 按上表的數(shù)據(jù)，以A595為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。 測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度：測定方法同上。去合適的未知樣品提及，使其測定值在標準曲線的線性范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595值，在標準曲線上查處相當于標準蛋白的Laing，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）溶菌酶蛋白濃度的測定

11、實驗備注： 若樣品濃度超出了標準曲線的線性范圍，則適當加以稀釋，稀釋至標準曲線的線性范圍之內(nèi)的濃度！溶菌酶活力的測定 實驗原理： 本實驗以溶壁微球菌為底物，通過測定細菌懸液濁度的變化（OD600）來測定溶菌酶的活性溶菌酶活力的測定 酶活力的測定： 在室溫下，取2個試管，分別在1號管中加入3.0mL測活緩沖液，2.5mL底物濃度；2號管中加入2.5mL測活緩沖液，2.5mL酶液。以2號管為對照，根據(jù)不同反應時間內(nèi)在721分光光度計上每隔30s測定1號650nm處的吸光值。按下列表格記錄是按結(jié)果：時間時間/s/s0 0303060609090120120150150180180ODOD650650溶菌酶活力的測定 實驗數(shù)據(jù)處理酶活力單位（U）：沒在溫室pH6.2條件下，OD650每分鐘強大0.001為1個酶活力單位U。 比活力=活力單位/mg蛋白根據(jù)測得結(jié)果，計算各步數(shù)據(jù)填入下表：組分組分體