拉曼光譜檢測(cè)胃癌變信號(hào)的研究

1、 拉曼光譜檢測(cè)胃癌變信號(hào)的研究陶家友, 黃鷹華中科技大學(xué)光電系(430074E-mail:taojy2572摘要:利用激光拉曼光譜對(duì)胃癌患者血清及非胃癌患者血清進(jìn)行對(duì)比檢測(cè),并結(jié)合對(duì)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞分泌物及裂解物的檢測(cè),對(duì)胃癌特征拉曼峰作初步探討。關(guān)鍵詞:激光拉曼光譜,胃癌,細(xì)胞培養(yǎng)液,血清1.引言胃癌是一種最常見的消化道腫瘤, 在常見的惡性腫瘤死亡率中排名第一,嚴(yán)重的威脅著人類的生命健康。目前臨床上診斷胃癌的主要手段仍是胃鏡和上消化道造影檢查,由于這兩種方法要求具備先進(jìn)的儀器設(shè)備及專門的操作人員,費(fèi)用高,且存在一定痛苦,故很難用于大規(guī)模的人群普查1。本文旨在找到一種方便、靈敏、準(zhǔn)確的用于胃癌

2、篩查和診斷的實(shí)驗(yàn)室方法。由于癌患者血清的組成成份與正常人血清不同,其熒光光譜也發(fā)生相應(yīng)改變2。利用不同物質(zhì)對(duì)入射激光產(chǎn)生頻率不同的拉曼散射現(xiàn)象的原理,可以反映所測(cè)標(biāo)本中所含物質(zhì)的種類和含量的差異。本文利用激光拉曼光譜技術(shù)3對(duì)比分析胃癌患者血清的特征拉曼光譜線,并結(jié)合對(duì)胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液及裂解液的檢測(cè),對(duì)胃癌特征拉曼峰作初步探討。2.標(biāo)本的選取2.1 血清標(biāo)本的選取:選取胃鏡活檢標(biāo)本病理檢查證實(shí)為胃腺癌患者15例,選取胃鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯異常的患者7例作為對(duì)照組。每例病人取3ml血清,即時(shí)4000轉(zhuǎn)/分離心20min,取上層血清于1.5ml EP管內(nèi),于-700C冷凍保存?zhèn)錂z。2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本的選

3、取:將SGC7901胃癌細(xì)胞消化后,濃度調(diào)整至1.25×105個(gè)/ml,以此濃度接種6孔板,每孔5ml細(xì)胞液。接種后于12h、24h、3天、5天、7天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞上清液,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取兩孔配對(duì),共五組。一孔加細(xì)胞裂解液0.5ml于培養(yǎng)板內(nèi),-20放置20min,將裂解后液體收集與細(xì)胞培養(yǎng)上清混合;另一孔直接將0.5ml細(xì)胞裂解液與細(xì)胞培養(yǎng)上清混合。細(xì)胞液培養(yǎng)基選擇1640培養(yǎng)液(含20%小牛血清,以此為空白對(duì)照。標(biāo)本待檢時(shí)放入40C 冰箱中保存。所有標(biāo)本由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院提供。3.實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)方法將標(biāo)本解凍后,用2.5mL 一次性注射器取出,緩慢注入內(nèi)徑2mm

4、左右的玻璃管中,消除氣泡。將標(biāo)本固定在樣品架上,用LRS -III 型激光拉曼光譜儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)光源為半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為532nm 的單色光,功率為40mW ,功率波動(dòng)2%。散射光經(jīng)光學(xué)收集系統(tǒng)至單色儀的入射狹縫,入射狹縫寬度為0.07mm 。單色儀中光柵閃耀波長(zhǎng)為500nm ,1200L/mm 。將日產(chǎn)R6249 型光電倍增管放在單色儀的出射狹縫處探測(cè)不同波長(zhǎng)拉曼光的強(qiáng)度,出射狹縫寬度為0.07mm 。光譜信號(hào)通過光電倍增管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電脈沖,并輸入到光子記數(shù)器,由光子記數(shù)器放大、記數(shù),并輸出到計(jì)算機(jī),最后用儀器配套軟件處理并輸出結(jié)果。儀器掃描范圍200nm -800nm ,波

5、長(zhǎng)準(zhǔn)確度0.4nm ,波長(zhǎng)重復(fù)性0.2nm ,雜散光10-3。對(duì)標(biāo)本掃描時(shí),掃描間隔為0.1nm ,負(fù)高壓為7,域值為24,積分時(shí)間為200ms 。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在暗室中進(jìn)行。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.1血清標(biāo)本的激光拉曼光譜對(duì)15個(gè)胃癌患者血清標(biāo)本和7個(gè)非胃癌患者血清標(biāo)本進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同類標(biāo)本的拉曼光譜譜線形狀基本相同,各拉曼峰的波長(zhǎng)基本相同,強(qiáng)度略有變化。不同類標(biāo)本進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清的拉曼信號(hào)有明顯增強(qiáng)。如圖(1。 圖(1 藍(lán)色譜線為非癌癥患者血清標(biāo)本的拉曼光譜,棕色譜線為癌癥患者血清標(biāo)本的拉曼光譜考慮到標(biāo)本測(cè)試時(shí)實(shí)驗(yàn)條件不可能完全相同,比如激光的功率略有波動(dòng),裝標(biāo)本的試管本身

6、對(duì)入射和散射光的反射、折射以及吸收有細(xì)微差異,狹縫寬度存在誤差等,會(huì)影響檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度,使得譜線上下移動(dòng),因此采用拉曼峰強(qiáng)度與瑞利峰強(qiáng)度的比值進(jìn)行分類對(duì)比,結(jié)果如下:表一:胃癌患者血清標(biāo)本 表二:非胃癌患者血清標(biāo)本 把每一個(gè)拉曼峰光強(qiáng)與對(duì)應(yīng)的瑞利峰光強(qiáng)的比值放大一百倍,用常用統(tǒng)計(jì)軟件spss軟件進(jìn)行T檢驗(yàn),可得出以下結(jié)果(見表三。從分析結(jié)果來看,胃癌患者血清與非胃癌患者血清的拉曼光譜做類別對(duì)比,P值均小于0.01,根據(jù)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析理論,兩類血清的拉曼光譜存在顯著性差異?？梢?血清的拉曼光譜檢測(cè),對(duì)于胃癌診斷的初篩,具有一定的臨床實(shí)際意義。表三:兩種血清標(biāo)本比較Raman spectum cla

7、ss Number of samples Mean Std.Error Mean Sig.(2 tailed 583nmcancer 15 30.3790 7.8438 0.000normal 7 6.0432 2.2841 0.000 633nmcancer 15 45.6097 3.9662 0.000normal 7 19.6186 1.0486 0.000 656nmcancer 15 37.8056 3.6665 0.001normal 7 14.9583 0.9453 0.000 674nmcancer 15 37.0545 3.8382 0.001normal 7 13.6500

8、 1.1106 0.000 707nmcancer 15 73.9029 5.9931 0.000normal 7 27.9886 2.5406 0.000 773nmcancer 15 61.5062 5.5522 0.000normal 7 23.0100 1.8650 0.000 799nmcancer 15 277.3618 23.4804 0.000normal 7 112.9429 9.9810 0.000 4.2細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本與1460培養(yǎng)液標(biāo)本的拉曼光譜當(dāng)胃癌病癥發(fā)生后,患者的血液成份會(huì)發(fā)生某些變化,血清中必然含有胃癌細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證血清標(biāo)本拉曼峰的增強(qiáng)與胃癌病癥

9、的發(fā)生的關(guān)系,我們?cè)O(shè)計(jì)了細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本的拉曼光譜實(shí)驗(yàn)。以下是1460培養(yǎng)液標(biāo)本與胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 圖(2藍(lán)色譜線為1460培養(yǎng)液標(biāo)本拉曼光譜,棕色譜線是胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)3天后培養(yǎng)液標(biāo)本的拉曼光譜從1460培養(yǎng)液標(biāo)本的拉曼光譜與3天后胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本的拉曼光譜來看,光譜2的拉曼峰比光譜1的拉曼峰有明顯的增強(qiáng),特別是從600nm至700nm之間,1460培養(yǎng)液的譜線取100為最小峰高,計(jì)算機(jī)無法自動(dòng)讀取拉曼峰;而所有胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液的譜線,均可讀出拉曼峰,分別位于633nm、656nm、674nm處?？梢?胃癌患者血清標(biāo)本的拉曼峰比非胃癌患者血清標(biāo)本的拉曼光譜有明顯的增強(qiáng),確實(shí)是因?yàn)檠?/p>

10、中含有了某些胃癌細(xì)胞的代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致。至于胃癌細(xì)胞的代謝產(chǎn)物是使血液中的某些物質(zhì)含量增高,還是出現(xiàn)了一些新的物質(zhì),這需要做進(jìn)一步的深入研究,我們將另文發(fā)表。4.3胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本與裂解液標(biāo)本的拉曼光譜為了觀察胃癌細(xì)胞本身的拉曼光譜,我們將生長(zhǎng)相同時(shí)間的培養(yǎng)液分成兩份,一份加入胃癌細(xì)胞裂解物,另一份不加。共10個(gè)標(biāo)本,5組對(duì)比。圖(3是3天后培養(yǎng)液與裂解液的對(duì)比圖。 圖(3藍(lán)色譜線為胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本拉曼光譜,棕色譜線為裂解液標(biāo)本的拉曼光譜對(duì)每條譜線進(jìn)行讀數(shù),將拉曼峰值和對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)用spss軟件進(jìn)行P檢驗(yàn),結(jié)果如下: Raman spectum Mean Std.Error Mean Sig.

11、(2 tailed583nm 11.1072 3.2394 0.027633nm 5.0186 0.8752 0.029656nm 2.2479 0.4799 0.043674nm 0.9143 0.5636 0.180707nm 2.7382 1.4528 0.133773nm 0.8050 0.6717 0.297799nm 7.1454 6.7306 0.348統(tǒng)計(jì)結(jié)果說明,兩類標(biāo)本的拉曼峰在583nm、633、656nm處P值均小于0.05,存在明顯差異;在674nm、707nm、773nm、799nm處P值均大于0.05,認(rèn)為基本相同?？梢?胃癌細(xì) 胞的裂解物會(huì)使波長(zhǎng)為 583nm、

12、633、656nm 的拉曼信號(hào)增強(qiáng)。 大多數(shù)癌癥如果在早期能及時(shí)發(fā)現(xiàn)， 是可以治愈的。 本文從拉曼光譜輔助診斷的角度出 發(fā)，對(duì)多種標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果能相互佐證。希望能對(duì)胃癌快速、準(zhǔn)確的診斷有所幫助。 參考文獻(xiàn) 1 林三仁。熒光光譜檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。中華消化雜志，2003 年 1 月第 23 卷第 1 期 2 林三仁，李成剛等。血清內(nèi)源性熒光光譜在胃癌診斷中的應(yīng)用。北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997 年第四期 3 吳思誠(chéng)，王祖銓。 近代物理實(shí)驗(yàn) 。北京大學(xué)出版社 Study On Gastric Cancer Test By Raman Spectrum Taojiayou，Huang Ying Department of Optoelectronic Engineering of Huazhong University of Scince and Technology Abstract Using laser Raman spectrum ,primary study on Raman spectrum of gastric cancer specificity is made based on comparative test of gastric cancer pa