RNA干擾技術(shù)在抗病毒性疾病中的應(yīng)用

1、RNA干擾技術(shù)在抗病毒性疾病中的應(yīng)用    nbsp;nbsp;nbsp;RNA干擾（RNAnbsp;interference，RNAi）是多種生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)的同源mRNA降解現(xiàn)象。它首先是在1990年由Jor-gensannbsp;R等nbsp;1nbsp;在矮牽牛花的研究中發(fā)現(xiàn)的。他將紫色色     胡毅 綜述，袁仕善     The use of RNAi technology against cirosis.HU Yi，YUAN Shi-shan.   （D

2、epartment of Biochemistry of Hu-nan Normal University Medical Collge，Changsha410006，Hunan，P.R.China）          RNA干擾（RNA interference，RNAi）是多種生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)的同源mRNA降解現(xiàn)象。它首先是在1990年由Jor-gensan R等 1 在矮牽?；ǖ难芯恐邪l(fā)現(xiàn)的。他將紫色色素合成酶基因?qū)氚珷颗；ㄒ约由罨ㄉY(jié)果不僅未加深顏色，反而使許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。Jorgensan把這種

3、現(xiàn)象稱為“共抑制”（Cosuppression）。隨后人們?cè)谝跃€蟲為材料的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈而且特異的基因表達(dá)抑制是由dsRNA介導(dǎo)產(chǎn)生的 2 。由于當(dāng)時(shí)不清楚為何dsRNA會(huì)產(chǎn)生此作用，所以Fire等 3，4 將這種由dsRNA引發(fā)的特定基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象稱為RNAi。隨著研究的逐步深入，人們認(rèn)識(shí)到RNAi是自然界普遍存在的一種古老的保護(hù)機(jī)制。它是生物體在基因水平上的一道防線，使基因組免受核酸“侵略者”如病毒、轉(zhuǎn)座因子等的損害 5 。因此，可以說(shuō)RNAi是基因組的免疫系統(tǒng)。     RNA干擾技術(shù)具有高效性和高度的特異性 6 ，因此，它在基因治療方面的應(yīng)用具有很大

4、的潛力，尤其是在抗病毒感染方面。而病毒性疾病是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的疾病。傳統(tǒng)的病毒性疾病治療多采用接種疫苗或以病毒特意性蛋白為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物治療，但是這些方法并不能直接清除體內(nèi)的病毒，而且許多病毒具有高度變異性，這給病毒性疾病的防治帶來(lái)了很大的困難。     近年來(lái)，RNA干擾機(jī)制的研究進(jìn)展迅速，使RNA干擾技術(shù)作為一種臨床治療手段成為可能，從而為各種病毒性疾病的治療開辟了一條嶄新的途徑。   1 RNAi的作用機(jī)制     RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，導(dǎo)入的dsRNA首先在Dicer酶的降解下形成21

5、23核苷酸長(zhǎng)度的小干擾RNAs（siRNAs），每個(gè)siRNA的3'端都有2個(gè)堿基突出。在RNAi效應(yīng)階段，siRNA結(jié)合到核糖核苷酸酶復(fù)合物上形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。該復(fù)合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC，激活的RISC通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3'端12個(gè)堿基的位置切割mRNA，導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)。     2 siRNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建     2.1 siRNA的設(shè)計(jì) 研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)哺

6、乳動(dòng)物細(xì)胞最有效的siR-NAs是2123個(gè)堿基大小且3'端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA;而對(duì)非哺乳動(dòng)物，比較有效的是長(zhǎng)片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì) 顯著削弱基因沉默的效果。在選擇靶位點(diǎn)時(shí)，不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（Untranslated regions，UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的干擾效果。     2.2 siRNA的構(gòu)建 構(gòu)建siRNA的方法有很

7、多，主要包括5種:體外化學(xué)合成。在體外合成相應(yīng)序列的RNA片段，退火形成雙鏈，轉(zhuǎn)入體內(nèi)。盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的研究人員幾乎不需要做什么工作。許多生物技術(shù)公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)是價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)。體外轉(zhuǎn)錄法。即合成相應(yīng)的DNA鏈，在體外轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的RNA。這樣的成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，是一種性價(jià)比較高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。用RNase III消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA。其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的s

8、iRNA。而用這種方法制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”就可以避免這個(gè)缺陷。這個(gè)方法是選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA，然后用RNase III（or Dicer）在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢。不過這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能

9、引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞或體內(nèi)表達(dá)成小發(fā)夾RNA（shRNA），在Dicer酶的作用下形成siRNA。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于這是眾多方法中唯一可以進(jìn)行長(zhǎng)期研究的方法帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對(duì)轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題。PCR法。利用PCR的方法是特異性啟動(dòng)子與表達(dá)目的片段連接，直接將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)此產(chǎn)物可以直接轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的siRNA或者shRNA。此種方法比較經(jīng)

10、濟(jì)便捷。     沉默效果地評(píng)價(jià)，一方面需通過基因功能地改變來(lái)評(píng)價(jià)，另一方面需檢測(cè)基因表達(dá)水平。常規(guī)地RT-PCR，Northern blot，免疫組化，及Western blot等方法用于目的基因mRNA和蛋白水平表達(dá)抑制地檢測(cè)，但在定量檢測(cè)上仍有一定地局限性。于是人們進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR，流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry）和激光共聚焦等方法進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了結(jié)果地客觀真實(shí)性。     3 RNA干擾技術(shù)在抗病毒方面的研究     目前，RNA干擾技術(shù)在抗病毒方面的研究主要集中在抗

11、HIV，HBV，HCV的研究上，也有一些抗植物病毒方面的報(bào)道。最近，將RNA干擾技術(shù)用于對(duì)SARS病毒的防治的研究也獲得了突破性進(jìn)展。     3.1 RNA干擾技術(shù)在抗HIV方面的研究 HIV基因組中的許多位點(diǎn)都可以作為siRNA作用的靶位點(diǎn)，目前的研究主要集中在nef、tat基因及HIV-1的輔助分子的相應(yīng)基因。Omoto S和Fujii Yr 7 利用HIV-1感染的細(xì)胞直接制備nef miRNA并將其導(dǎo)入受HIV-1感染的人T細(xì)胞，結(jié)果使HIV-1基因組的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。Ming-Ta M.Lee等 8 構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)HIV-1tat基因的siRNA的載體

12、，并將其導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果證明，這些載體可使細(xì)胞選擇性的降解病毒mRNA從而使細(xì)胞免于HIV-1的感染。Anderson J等 9 構(gòu)建了可表達(dá)針對(duì)CXCR4和CCR5的兩個(gè)小發(fā)卡siRNA的載體。CXCR4的載體中有U6啟動(dòng)子，CCR5的載體中有H1啟動(dòng)子，然后導(dǎo)入細(xì)胞。結(jié)果使目的細(xì)胞獲得了對(duì)X4和R5HIV-1的抗性。因此穩(wěn)定而長(zhǎng)期的使細(xì)胞表面受體分子下調(diào)可作為一種有效的抗HIV-1的基因療法。Suhasini Modem等 10 研究發(fā)現(xiàn)Sam68在功能上補(bǔ)充并加強(qiáng)HIV-1Rev蛋白在Rev介導(dǎo)的基因表達(dá)和病毒的復(fù)制中的作用。他們將siRNA導(dǎo)入Hela細(xì)胞從而得到了Sam68穩(wěn)定敲除

13、的Hela細(xì)胞（SSKH），同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的HIV-1的復(fù)制也得到了抑制。     最近研究發(fā)現(xiàn)，HIV等反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制與生物體內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有關(guān)（比如酵母的Ty反轉(zhuǎn)座子）。酵母的Ty反轉(zhuǎn)座子是通過形成套索樣中間體的方式來(lái)進(jìn)行cDNA的復(fù)制的。Ying Ye等 11 假設(shè)HIV-1也會(huì)形成一個(gè)套索樣中間體，因此用siRNA抑制人的RNA套索樣中間體去分枝酶（RNA lariat de-branching enzyme，DBR1）同時(shí)可以抑制HIV的復(fù)制。他們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)針對(duì)DBR1的siRNA，導(dǎo)入細(xì)胞后使DBR1的表達(dá)降低了80%。在對(duì)宿主細(xì)胞沒有明顯影響的情

14、況下抑制了HIV-1的復(fù)制。因此，編碼DBR1的序列可用作抗HIV-1的研究。     應(yīng)該注意的是，在HIV感染的細(xì)胞過程中發(fā)揮輔助作用的細(xì)胞因子往往在正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及免疫調(diào)節(jié)中也由重要作用。因此在選擇HIV-1的輔助分子作為siRNA的靶位點(diǎn)是應(yīng)衡量其利弊。     3.2 RNA干擾抗HBV的研究進(jìn)展 Zhu C等 12 設(shè)計(jì)了pSi-lencer3.1-H1hygro質(zhì)粒載體用以表達(dá)針對(duì)HBV S基因的siR-NA。通過脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。通過檢測(cè)HbsAg和HbeAg來(lái)確定病毒的表達(dá)情況，并通過FQ-PCR（f

15、luorogenic quantitative PCR）方法和半定量RT-PCR法分別對(duì)病毒基因組DNA和S-mRNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)HBV S-siRNA導(dǎo)入量分別是1g，2g和4g時(shí)，HbsAg的表達(dá)量降低了75%， 82%，89%;HbeAg的表達(dá)量降低了32%，38%，43%;HBV DNA的復(fù)制產(chǎn)物降低了30%，43%，49%;HBV S-mRNA含量降低了30%，70%，90%。結(jié)果說(shuō)明RNAi可有效的抑制HBV在感染細(xì)胞中的復(fù)制和其抗原的表達(dá)，而且抑制效果和siRNA的量呈正相關(guān)。在HBV引起肝癌的研究中Chan DW，Oi-Lin Ng I 13 構(gòu)建了可表達(dá)針對(duì)HBV

16、X（HBx）的shRNA的表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入PLC/PRF/5HCC細(xì)胞中。結(jié)果顯示RNAi可有效的降低HBx mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)而且PLC/PRF/5HCC細(xì)胞的分裂也被很大程度的抑制了。進(jìn)一步試驗(yàn)證明針對(duì)HBx的RNA干擾治療可抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)的增長(zhǎng)。     3.3 RNA干擾抗HCV的研究進(jìn)展 Prabhu R等 14 分別構(gòu)建了三個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體，可表達(dá)針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)基因（E2），非結(jié)構(gòu)基因（NS3，NS5B）的siRNA。通過Western blot和Immunocyto-chemical staining分析，這三個(gè)siRNA都可有效的抑制H

17、CV核蛋白和NS5A蛋白的表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明RNAi是一種有效的抑制HCV表達(dá)和復(fù)制的方法，而且此方法具有選擇性。     3.4 RNA干擾技術(shù)在抗SARS方面的研究 目前SARS的陰云已經(jīng)退去，已經(jīng)沒有必要再用疫苗或特殊的抗病毒療法來(lái)對(duì)付SARS了。但是為人們公認(rèn)的是應(yīng)該有一種對(duì)付SARS冠狀病毒的特效藥物以預(yù)防SARS將來(lái)可能對(duì)人類的突然襲擊 15 。目前SARS病毒致病的分子機(jī)制尚不清楚，從而阻礙了SARS特異防治的深入研究。由于siRNA在干擾病毒復(fù)制的同時(shí)并不會(huì)導(dǎo)致感染細(xì)胞發(fā)生明顯的損傷，因此siRNA有望成為抗SARS病毒感染的新工具。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生

18、物流行病研究所的趙慧等 16 針對(duì)BJ01株SARS冠狀病毒復(fù)制酶基因（Pol）和刺突蛋白基因（S）設(shè)計(jì)了4個(gè)siRNA，并用間接免疫熒光法及實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)所設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)SARS冠狀病毒復(fù)制的抑制作用。結(jié)果表明針對(duì)Pol基因的siRNA在Vero細(xì)胞中可阻斷BJ01株SARS病毒的復(fù)制及其蛋白的表達(dá)。     中國(guó)工程院院士鐘南山近期宣布，有關(guān)SARS特效藥的研究取得令人振奮的突破性進(jìn)展，目前已在恒河猴（俗名獼猴）身上試驗(yàn)并獲得成功，證明小干擾核酸藥物對(duì)SARS冠狀病毒具有明顯的治療和預(yù)防作用。研究人員選取了5組共20只恒河猴進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，先通過滴鼻

19、方式讓它們感染SARS病毒，再用同樣方式輸入藥物。在恒河猴出現(xiàn)SARS的典型癥狀:高熱、食欲不振等后，接受siRNA藥物治療。治療后，恒河猴病毒復(fù)制量減少了75%，病猴肺部的損傷明顯減輕，而且隨劑量增加，療效進(jìn)一步改善。而在感染前接受藥物預(yù)防的猴子，體溫上升和肺部損傷均明顯減輕，證明藥物預(yù)防起效。目前研究結(jié)果表明，siRNA藥物對(duì)SARS冠狀病毒具有明顯的治療和預(yù)防作用，而且沒有明顯副作用 17 。     3.5 RNA干擾技術(shù)在抗其他病毒性疾病的研究 A型流感病毒是在人群中流行最為廣泛的一種。目前疫苗是我們采取的主要預(yù)防措施，但只能使70%90%的小于65歲的

20、健康成人免于感染。對(duì)于老人，兒童和免疫力低下的人這種概率要低很多。目前有4種藥物被FDA批準(zhǔn)用于流感的預(yù)防和治療，但是這些藥物副作用大而且容易是使病毒產(chǎn)生抗性。Thomas M等 18 利用針對(duì)流感病毒保守區(qū)的siRNA抑制了流感病毒在雞胚和細(xì)胞中的復(fù)制。Zhou Y等 19 利用轉(zhuǎn)基因煙草得到了針對(duì)流感病毒H1N1亞型非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的mRNA的siRNA，用其轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使病毒的復(fù)制得到了顯著得抑制。     Li YC等 20 構(gòu)建了三個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體，可以表達(dá)針對(duì)流感病毒H5N1型的編碼核蛋白的基因序列。根據(jù)siRNA阻止目的基因的表達(dá)和抑制病毒導(dǎo)致的

21、細(xì)胞凋亡效果，來(lái)評(píng)價(jià)siRNA的作用。通過Northern blot and western blot分析，結(jié)果顯示，從三種質(zhì)粒得到的shRNA對(duì)病毒核蛋白基因的表達(dá)有明顯的抑制作用，同時(shí)可以阻止病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。說(shuō)明RNAi療法作為治療禽流感的一種新方法具有很大的潛力。     人類皰疹病毒感染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，同時(shí)也是HIV感染的一個(gè)協(xié)同因素。Palliser D等 21 用針對(duì)HSV-2的UL27和UL29基因的siRNA與脂質(zhì)的混合物，灌注小鼠陰道，使小鼠免于致死性感染，說(shuō)明siRNA可作為殺菌劑用于防止病毒的轉(zhuǎn)播。   

22、60; 4 問題與展望     首先，并不是所有的病毒RNA都適合作為siRNA的作用靶。一些病毒RNA可形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)從而使siRNA無(wú)法起到干擾作用。還有一些病毒RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，同樣可使靶序列被封閉。     其次，在我們應(yīng)用siRNA進(jìn)行治療時(shí)，病毒會(huì)產(chǎn)生大量的變異體以逃避siRNA的干擾作用。Atze T.Das等 22 在研究中發(fā)現(xiàn)，針對(duì)HIV-1nef的siRNA在長(zhǎng)期的治療中未必有效。他們把針對(duì)nef序列的siRNA導(dǎo)入HIV-1感染的可大量繁殖的Sup T1細(xì)胞株，培養(yǎng)8個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明胞內(nèi)HIV-1的

23、拷貝數(shù)沒有明顯的減少。進(jìn)一步研究表明胞內(nèi)HIV-1的nef序列發(fā)生了突變，從而使siRNA起不到干擾作用。因此，這就要求我們?cè)趹?yīng)用RNAi方法時(shí)要采用針對(duì)病毒保守區(qū)的多個(gè)siRNA同時(shí)進(jìn)行作用。另外，一些細(xì)胞因子對(duì)病毒抗RNAi作用也有貢獻(xiàn)。ADAR1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RNAi調(diào)控因子。因?yàn)閟iRNA可以作為一些細(xì)胞正常基因的小分子抑制物，細(xì)胞要維持生存必須發(fā)展一種機(jī)制以抵抗RNAi的負(fù)作用 23 。     最后，機(jī)體對(duì)外來(lái)基因干預(yù)的排斥以及siRNA本身的毒性也時(shí)RNAi用于臨床的一大障礙。因此，要將RNAi技術(shù)真正用于臨床疾病的治療，還需要進(jìn)一步的研究。 &#

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