不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量研究

1、不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量研究        【摘要】     目的分析測(cè)定不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒和牛心樸子的總黃酮含量。方法采用分光光度法分別對(duì)不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒和牛心樸子的總黃酮含量進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果不同生長(zhǎng)期內(nèi)，瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量變化趨勢(shì)不同，但都是9月份總黃酮含量最高。瑞香狼毒總黃酮含量在7、8月份時(shí)明顯較低，分別為6.3 mg/g和7.8 mg/g，9月份最高，達(dá)到18.5 mg/g; 牛心樸子總黃酮含量在8月份時(shí)較低，為12.5 mg/

2、g，9月份最高，為16.3 mg/g。結(jié)論以黃酮類(lèi)化合物為有效成分的瑞香狼毒和牛心樸子的最佳采收期均為9月份。     【關(guān)鍵詞】  不同生長(zhǎng)期;瑞香狼毒;牛心樸子;總黃酮    瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.，又名斷腸草、紅狼毒，為瑞香科狼毒屬多年生根莖型草本植物，廣泛分布于東北、華北、西南、西北、內(nèi)蒙古、黑龍江等地的干草原、沙質(zhì)草原和典型草原的退化草地上1。牛心樸子Cynanchum komarovii Al.Ijirski為蘿科鵝絨藤屬多年生草本植物，俗稱(chēng)老瓜頭、蘆心草，主要

3、分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、陜西等地2。瑞香狼毒和牛心樸子均為草原退化植物，在內(nèi)蒙古地區(qū)的一些退化草場(chǎng)，瑞香狼毒或牛心樸子大面積連片生長(zhǎng)，已成為退化草場(chǎng)的建群種植物，導(dǎo)致草原質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力嚴(yán)重下降。瑞香狼毒和牛心樸子雖然具有一定毒性，牲畜不宜采食，但二者同時(shí)又是具有不同藥用價(jià)值的中草藥。如瑞香狼毒具有逐水、破積、祛痰、殺蟲(chóng)、止痛的功能1，35，在抗腫瘤、抗菌、抗病毒(尤其是艾滋病毒)、抗癲癇等方面有獨(dú)到之處1，6。牛心樸子具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌功效，對(duì)呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)病的咳、痰、喘癥狀可有緩解治療作用79，此外，牛心樸子還是一種很好的蜜源植物10，在西北草原養(yǎng)蜂業(yè)中占有重要地位。黃酮類(lèi)化合物是

4、瑞香狼毒和牛心樸子的主要有效成分之一，對(duì)其在兩種植物中的含量測(cè)定雖曾有報(bào)道1115，但不同生長(zhǎng)期黃酮含量的動(dòng)態(tài)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本文對(duì)內(nèi)蒙古鄂爾多斯草原不同生長(zhǎng)期的瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量分別進(jìn)行了分析測(cè)定并加以比較研究，以期為瑞香狼毒和牛心樸子的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料與儀器1.1材料瑞香狼毒和牛心樸子試樣分別于2008-0509每月上旬采自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯草原，經(jīng)鄂爾多斯市林業(yè)工作站鑒定。所有實(shí)驗(yàn)材料取地上部分，去除花、果實(shí)，去雜，自然晾干后備用。1.2試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、石油醚、正丁醇，AR，北京化工廠;亞硝

5、酸鈉，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.3儀器SP-2000型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。2方法2.1定性檢驗(yàn)稱(chēng)取粉碎20目的瑞香狼毒和牛心樸子各5 g，分別用95%乙醇于索氏提取器中回流提取2 h，提取液濃縮近干，用30%乙醇溶解。各取溶液1 ml于試管中，加適量鎂粉，再逐滴加入鹽酸，兩者反應(yīng)均呈現(xiàn)桃紅色，為黃酮類(lèi)化合物正反應(yīng)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱(chēng)取120干燥恒重的無(wú)水蘆丁(黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品)20 mg，用60%乙醇定容于100 ml容量瓶中，搖勻。精密量取25.0ml置于50 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度(0.1 mg蘆丁/m1)。精密量取上述溶液0.0，1.0，2.0，3.0

6、，4.0，5.0 ml分別置于10 ml容量瓶中，分別精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，再靜置6 min，加1 mol/l氫氧化鈉溶液4 ml，分別用30%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，置于比色皿中，用SP-2000型分光光度計(jì)，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以溶液濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并作線性回歸，求出回歸方程。2.3樣品總黃酮含量的測(cè)定精密稱(chēng)取粉碎20目的材料(不同生長(zhǎng)期的瑞香狼毒及牛心樸子)各5 g，分別用95%乙醇于索氏提取器中提取，至提取液無(wú)黃酮反應(yīng)為止。將提取液

7、濃縮近干，加10 ml蒸餾水溶解后，用石油醚萃取脫脂，棄去石油醚層。水層用正丁醇萃取，至水溶液無(wú)黃酮反應(yīng)為止。減壓回收正丁醇至近干，加適量30%乙醇溶液溶解，分別移至50 ml容量瓶中，用30%乙醇溶液稀釋至刻度。精密量取此溶液4.0 ml，分置于100 ml容量瓶中，用30%乙醇稀釋至刻度。精密量取上述樣品液3.0，4.0，5.0 ml，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，將樣品溶液顯色后測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程求出相應(yīng)的濃度，用下述公式分別計(jì)算瑞香狼毒及牛心樸子的總黃酮含量：總黃酮提取率(%)=c×10×100×504m×1 000×取樣毫升數(shù)&#

8、215;100%式中：m為樣品材料粉末的重量(g);c為樣品材料總黃酮的濃度(g/ml)。2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別取瑞香狼毒和牛心樸子樣品液，在不同時(shí)間內(nèi)按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法分別測(cè)定其吸光度。2.5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0ml，5份，置于10 ml容量瓶中，分別測(cè)定其吸光度。2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分別精密稱(chēng)取20目的樣品材料5份，每份5克，按樣品總黃酮含量的測(cè)定方法做平行試驗(yàn)，進(jìn)行樣品總黃酮含量的測(cè)定。2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取粉碎20目樣品材料5 g，5份，分別加一定量的標(biāo)準(zhǔn)蘆丁。按樣品總黃酮含量測(cè)定方法提取后測(cè)定其含量，用以下公式計(jì)算回收率：回收率(%)=混合后總黃酮量-樣品總黃酮量蘆丁加

9、入量×100%3結(jié)果3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁的回歸方程為：Y=9.531 4X-0.002 6，r=0.999 8結(jié)果表明在00.06 mg/ml的范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線3.2不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量的比較分析3.2.1瑞香狼毒總黃酮含量測(cè)定59月份瑞香狼毒總黃酮含量測(cè)定結(jié)果(各月份總黃酮含量均為5次平行試驗(yàn)的平均值)見(jiàn)圖2所示。結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒總黃酮含量不同，9月份含量最高，達(dá)1.85%(即18.5mg/g)，7、8月份含量明顯較低，分別為0.63%(即6.3mg/g)和0.78%

10、(即7.8mg/g);各月份含量高低順序?yàn)椋?月份>6月份>5月份>8月份>7月份。圖2不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒總黃酮含量比較3.2.2牛心樸子總黃酮含量測(cè)定59月份牛心樸子總黃酮含量測(cè)定結(jié)果(各月份總黃酮含量均為5次平行試驗(yàn)的平均值)見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)牛心樸子總黃酮含量變化趨勢(shì)與瑞香狼毒不同，但仍是9月份總黃酮含量最高，達(dá)1.63%(即16.3 mg/g)，7月份含量與9月份接近，為1.61%(即16.1 mg/g);各月份含量高低順序?yàn)椋?月份>7月份>5月份>6月份>8月份。圖3不同生長(zhǎng)期牛心樸子總黃酮含量比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整個(gè)生長(zhǎng)期

11、內(nèi)，瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量均是9月份含量最高，說(shuō)明瑞香狼毒和牛心樸子在9月份收獲，其有效成分黃酮類(lèi)化合物的含量較高，應(yīng)具有較強(qiáng)的藥效，若對(duì)其加以開(kāi)發(fā)利用將能獲得更好的利用價(jià)值。3.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果瑞香狼毒和牛心樸子樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(以9月份樣品為例)結(jié)果見(jiàn)圖4。樣品乙醇提取液加入顯色劑顯色后，顯色溶液在40 min內(nèi)穩(wěn)定，40 min后吸光度明顯下降。這是因?yàn)樘烊稽S酮類(lèi)化合物在結(jié)構(gòu)上往往存在有多個(gè)酚羥基，在強(qiáng)堿性條件下，黃酮母核上的酚羥基易被氧化而褪色。故顯色一定時(shí)間后，由于黃酮類(lèi)化合物被氧化，致使吸光度嚴(yán)重下降。因此，當(dāng)樣品溶液加入硝酸鋁顯色后，應(yīng)在40 min內(nèi)測(cè)定吸光度，否則顯色

12、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶液顏色變淡甚至消失，吸光度值減小至喪失。圖4顯色液的穩(wěn)定性曲線3.2.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，RSD為2.85%，小于5%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度良好。表1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，瑞香狼毒和牛心樸子各月份平均回收率均在97%以上，且RSD值均小于5%，說(shuō)明瑞香狼毒和牛心樸子試驗(yàn)的回收率均較高，試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說(shuō)明應(yīng)用此工藝提取、測(cè)定瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮含量是可取的。表3加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果本研究以乙醇為溶劑用索氏提取法提取不同生長(zhǎng)期瑞香狼毒和牛心樸子總黃酮，采用分光光度法進(jìn)行含量

13、測(cè)定。從實(shí)驗(yàn)的精密度、回收率、穩(wěn)定性和重復(fù)性等試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該項(xiàng)研究方法穩(wěn)定可靠，測(cè)定數(shù)據(jù)重復(fù)可信，且操作簡(jiǎn)便易行，不僅可以用于研究瑞香狼毒和牛心樸子的總黃酮含量，也為與之相似的草本植物總黃酮含量的測(cè)定提供借鑒。4結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9月份瑞香狼毒和牛心樸子的總黃酮含量均高于其他月份。黃酮類(lèi)化合物是植物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累與植物的生長(zhǎng)發(fā)育程度以及外界環(huán)境因素密切相關(guān)。9月鄂爾多斯草原已是仲秋時(shí)節(jié)，植物生長(zhǎng)進(jìn)入生長(zhǎng)末期，植物經(jīng)過(guò)一個(gè)生長(zhǎng)季的發(fā)育生長(zhǎng)，一些次生代謝產(chǎn)物有了較多的積累，這可能是兩種植物中黃酮類(lèi)化合物含量9月份要高于其他月份的原因。所以若作為藥用

14、或者在研究和利用瑞香狼毒和牛心樸子的黃酮類(lèi)化合物時(shí)，9月份是樣品采集的較好時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為草原退化有毒植物瑞香狼毒和牛心樸子的開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。黃酮類(lèi)化合物是藥用植物中主要活性成分之一，此類(lèi)化合物具有多種藥理作用。目前對(duì)牛心樸子的研究報(bào)道中，多為對(duì)其生物堿成分的研究。而實(shí)驗(yàn)研究表明，牛心樸子中總黃酮含量也較高，這為其開(kāi)發(fā)利用提供了新的理論依據(jù)。瑞香狼毒和牛心樸子在我國(guó)干旱沙質(zhì)草原、退化草場(chǎng)分布廣泛，資源豐富，除具有一定的經(jīng)濟(jì)效益外，在沙質(zhì)草原和嚴(yán)重退化草地上也具有一定的生態(tài)作用，應(yīng)加強(qiáng)和完善對(duì)其各部分的科學(xué)研究，以更好地實(shí)現(xiàn)綜合利用。   

15、0;【參考文獻(xiàn)】  1卓兆蓮，高英，李衛(wèi)民. 蒙藥瑞香狼毒化學(xué)成分研究進(jìn)展J.中國(guó)藥房，2007，18(27)：2152.2米海莉，張曦燕，李越鯤，等. 牛心樸子總生物堿提取及精制方法研究初報(bào)J.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(6)：464.3趙奎君，徐國(guó)鈞，金蓉鸞，等.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究(南方協(xié)助組第2冊(cè))M.福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1997：184.4金賢蘭.中藥狼毒的藥理作用及臨床應(yīng)用J.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24(20)：3101.5張國(guó)洲，王亞維. 瑞香狼毒殺蟲(chóng)活性成分的提取與分離(I)J.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，27(4)：340.6魏春雁. 瑞香狼毒化學(xué)成分與生物活性研究的回顧與展望J.中國(guó)中藥學(xué)雜志，2001，36(9)：577.7張永康，何生虎，李勇. 牛心樸子生物堿的鎮(zhèn)痛抗炎作用試驗(yàn)J.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27(11)：99.8祁利民，楊潔. 寧夏老瓜頭生物總堿的藥理活性初步研究J.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24 (6)：398.9呂燕萍，梁資福，宋京都，等. 老瓜頭的止咳、祛痰及平喘作用J.中國(guó)中藥雜志，1997，22(4)：242.10謝鶴. 談老瓜頭蜜源在西北地區(qū)養(yǎng)蜂業(yè)中的地位J.養(yǎng)蜂科技，2001，5：36.11曲玲，曹