小鼠乙型肝炎e抗體HBeAb酶聯(lián)免疫分析ELISA

1、小鼠乙型肝炎e抗體(HBeAb)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中 乙型肝炎e抗體(HBeAb)的含量。實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠乙型肝炎e抗體(HBeAb)水平。用純化的小鼠乙型肝炎 e抗體(HBeAb)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次 加入乙型肝炎e抗體(HBeAb)，再與HRP標(biāo)記的乙型肝炎e抗體(HBeAb)抗體結(jié)合，形成 抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中

2、的乙型肝炎e抗體(HBeAb)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣 品中小鼠乙型肝炎 e抗體(HBeAb)濃度。試劑盒組成試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說(shuō)明書(shū)1份1份圭寸板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1X 481X 962-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品：2700ng/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶標(biāo)試劑3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 m

3、l X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存終止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml X 30 倍)X 1 瓶2-8 C保存注意事項(xiàng)：1. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。2. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被

4、板開(kāi)封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。5. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定，計(jì) 算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX 5）O6 底物請(qǐng)避光保存。7 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).&所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。樣本處理及要求 ：1. 血清： 室溫血液自然凝固 10-20 分鐘， 離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）

5、。仔細(xì)收集上 清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次 離心。3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分） 。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程 中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS （PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液

6、，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS, PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8 C的溫度。加入一定量的PBS （ PH7.4）,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分） 。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待 檢測(cè)，其余冷凍備用。6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上 進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20

7、C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 .7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 M,然后再加待測(cè)樣品10 d （樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。2. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 d，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100dl 分別加到第三孔和第四孔， 再在第三、 第四

8、孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50dl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50dl 棄掉，再各取 50dl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 d分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻后從第七、第八孔中分別取50dl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 dl ，混勻后從第九第十孔中各取50dl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50dl，濃度分別為 1800ng/L， 1200ng/L ， 600ng/L， 300ng/L，1 50ng/L ）。3. 溫育：用封板膜封板后置 3

9、7 C溫育30分鐘。4. 配液：將30 （48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 （48T的20倍）倍稀釋后備用。5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 溫育：操作同 3。7. 洗滌：操作同 5。8. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 4，再加入顯色劑 B50 d，輕輕震蕩混勻，37 C避光顯色15 分鐘 .9. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50 dl ，空白孔除外。10. 終止：每孔加終止液 50 4，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零， 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。試劑盒性能：1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為 0.95 以上。2. 批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于 9%和 11% 計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)