訶子提取物含藥血清對乳鼠心肌細胞損傷的保護作用

1、訶子提取物含藥血清對乳鼠心肌細胞損傷的保護作用                            作者：張東 鄔國棟 張述禹 王玉華 楊玉梅【摘要】  目的：研究訶子提取物含藥血清對H2O2所致心肌細胞損傷的保護作用。方法：采用H2O2處理培養(yǎng)心肌細胞，造成氧化應(yīng)激模型，通過檢測細胞培養(yǎng)液中LDH、CK漏出量、MD

2、A含量和SOD活性反映訶子提取物含藥血清對H2O2氧化模型的影響。結(jié)果：與模型組比較，訶子提取物含藥血清能顯著減少LDH、CK漏出量（P0.05,P0.01）；降低培養(yǎng)液中MDA含量（P0.05,P0.01），升高SOD活性（P0.01）。結(jié)論:訶子提取物含藥血清可減輕H2O2對心肌細胞的損傷程度，對心肌細胞具有保護作用，其機制可能與穩(wěn)定細胞膜和抗氧化有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  訶子;過氧化氫;心肌細胞培養(yǎng)；血清藥    Abstract  Objective: To investigate the protective effects of the

3、 Terminalia chebula extract serum on myocardial cells injury in cultured rats induced by H2O2. Methods: Oxidative damage model were induced by H2O2, the leakage level of lactidehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), the content level of methylenedioxyamphetamine (MDA),the activity of superoxide di

4、smutase (SOD) were measured in medium to observe the effects of the Terminalia chebula extract serum on myocardial cells injury in cultured  rats induced by Hydrogen peroxide(H2O2). Results: Compared with the model control, the content of LDH, CK, MDA decreased significantly（P0.05,P0.01） and th

5、e activity of SOD increased significantly（P0.01）. Conclusion: the Terminalia chebula extract serum can mitigate injury of Hydrogen peroxide(H2O2) on myocardium ,it has protecting effect on damaged myocardium. It is suggested that the protecting  mechanism may be related to stabilizing  mem

6、brane and its antioxidant properties.    Key words  Terminalia chebula; Hydrogen peroxide; Cardiac myocyte culture; Serum pharmacology    訶子又名訶黎、訶黎勒、隨風子，為使君子科植物訶子（Terminalia chebula Retz.）或絨毛訶子（Terminalia chebula Retz.Var.tomentella Kurt.）的干燥成熟果實。訶子常應(yīng)用在藏醫(yī)學(xué)、蒙藥中，是蒙藥中

7、應(yīng)用比例最大、功用最廣泛的藥物,被稱之蒙藥之王1。訶子果實含鞣質(zhì)，其成分為訶子酸、訶黎勒酸、1，3，6-三沒食子酰葡萄糖等，此外還含有阿拉伯糖、訶子素、三萜類等，具有抗菌、抗氧化、抗誘變、抗動脈粥樣硬化、強心等作用,但其對心臟的作用機制現(xiàn)未完全清楚。本實驗采用血清藥理學(xué)方法，在細胞水平利用H2O2損傷培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，探討訶子對心肌細胞損傷的保護作用。1  材料與方法1.1  實驗動物Wistar大鼠乳鼠（14 d）,Wistar大鼠（體重200±20 g）,均購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。1.2  主要藥品與試

8、劑 訶子購自呼和浩特市凱蒙大藥房，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院植化教研室龐秀生教授鑒定為使君子科植物訶子（Terminalia chebula Retz.）或絨毛訶子（Terminalia chebula Retz.Var. tomentella Kurt.）的干燥成熟果實。RPMI-1640、胎牛血清購自Gibco公司，過氧化氫（22）購自Sigma公司，乳酸脫氫酶試劑盒、肌酸激酶試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司，丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所。1.3  主要儀器 MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)，CJ-2F型醫(yī)用凈化工作臺

9、(蘇州市金燕凈化設(shè)備有限公司)，SCOUT-型半自動生化分析儀（意大利MENARINI公司）。1.4  方法1.4.1  訶子提取物的制備 訶子果實粉碎后用70 %丙酮提取3次，濾液合并后減壓回收丙酮，用乙醚和乙酸乙酯分別萃取，揮干2。1.4.2  乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 無菌迅速取出出生14 d的Wistar乳鼠的心臟，用PBS液充分洗凈血液并去除多余組織，將心臟剪成約1 mm3的小塊，加入5 mL 37 孵育的0.08 %胰蛋白酶，在恒溫磁力攪拌器上、37 水浴消化8 min；首次消化所得的消化液棄之不用，再加入8 mL胰蛋白酶，依上述條件消

10、化；將消化液轉(zhuǎn)移入50 mL離心管中，并加入等量培養(yǎng)基以終止消化，余下的組織塊中再加入8 mL新的胰酶繼續(xù)消化，重復(fù)多次，直至心肌組織全部消化；消化液以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，再加入3 mL培養(yǎng)基混懸細胞沉淀，離心后棄上清液，再加培養(yǎng)基混懸；將此細胞懸液轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶中，于37 、5 % CO2孵箱中靜置120 min，差速貼壁以減少成纖維細胞的污染；收集培養(yǎng)瓶中的上清液，計數(shù)后稀釋，接種入96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)3。1.4.3  含藥血清的制備 將體重200±20 g Wistar大鼠按體重分層隨機分成5組，每組5只。第1組為對照組，灌胃蒸

11、餾水1 mL/100 g體重;第25組為訶子提取物、組，灌胃劑量分別為90.0 mg/100 g體重、60.0 mg/100 g體重、30.0 mg/100 g體重、6.0 mg/100 g體重；以上各組每日灌胃2次，連續(xù)3天。末次給藥前12 h禁食、不禁水。末次給藥后1 h無菌腹主動脈取血，靜置過夜后，于次日3 000 r/min離心15 min，分離含藥血清，-20 冰箱保存?zhèn)溆?。1.4.4  損傷模型的建立和實驗分組 細胞培養(yǎng)實驗中，每隔48 h換液一次，待有大部分心肌細胞搏動時開始實驗。按隨機原則分為6組：對照組：在培養(yǎng)基中加入對照血清，使對照血清的體積百分比含量

12、為15 %，用溶有對照血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞30 h；模型組：方法同對照組，用含15 %對照血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后加入H2O2，使其終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h；訶子提取物、血清組：在培養(yǎng)基中加入含藥血清，使含藥血清的體積百分比含量為15 %，用溶有含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，然后加入H2O2，使其終濃度為2 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6 h。1.4.5  乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的測定 均參照試劑盒說明書操作，測定波長分別為440 nm、340 nm、532 nm、550 nm。1.4.6

13、60; 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計  數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行方差齊性檢驗、單因素方差分析（one-way-ANOVA）,組間比較用LSD法，實驗結(jié)果以x±s表示。1         2  結(jié)果2.1  提取物含藥血清對H2O2損傷心肌細胞LDH、CK的影響 與對照組相比，模型組的心肌細胞LDH、CK漏出量顯著增多（P0.01）；與模型組比較，含藥血清、組可以顯著減少LDH漏出量（P0.05，P0.01），同時含藥血清、組還可以顯著減少CK漏出量（P0.05，P0.0

14、1）。結(jié)果見表1。表1  提取物含藥血清對H2O2損傷心肌細胞LDH、CK的影響（略）2.2  提取物含藥血清對H2O2損傷心肌細胞MDA、SOD的影響 與對照組比較，模型組MDA生成顯著增多、SOD活性顯著降低（P0.01）；與模型組比較，含藥血清、組可以減少心肌細胞培養(yǎng)液中MDA的含量（P0.05或P0.01），含藥血清、組顯著升高SOD的活性（P0.01）。結(jié)果見表2。表2  提取物含藥血清對H2O2損傷心肌細胞MDA、SOD的影響（略）3  討論    中藥血清藥是近10余年來才興起的一種實驗方法，它是將中

15、藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動物灌服一定時間后采集動物血液，分離血清，用此含有藥物成分的血清進行體外實驗的方法。由于它同用中藥粗制劑直接進行的體外實驗相比，既具有體外實驗條件可控性強、藥物效應(yīng)易于檢測、可深入揭示藥物作用機理的優(yōu)點，又能夠防止中藥粗制劑本身的理化性質(zhì)對實驗的干擾5，而且比較接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程，其原有成分或在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分，或通過第二信使而間接起作用等都可以通過血清藥理學(xué)反映出來，理論上更具備性、真實性6。本實驗將血清藥理學(xué)方法引入了蒙藥藥理的研究中，探討蒙藥訶子提取物的含藥血清對損傷心肌細胞的影響。    22是體內(nèi)氧化代謝的中間

16、產(chǎn)物,同時又是一種活性氧。22濃度積累到一定程度會對機體細胞產(chǎn)生損傷作用,如22可誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使生成增多,質(zhì)膜通透性增加，引起細胞損傷和細胞死亡等7。    本實驗利用外源性H2O2直接處理原代培養(yǎng)心肌細胞,建立氧化損傷模型，以心肌細胞培養(yǎng)基中LDH、CK漏出量作為心肌細胞損傷的指標。LDH、CK是心肌細胞胞內(nèi)酶，少量漏出即提示細胞膜通透性增高，漏出量的多少反映細胞膜的受損程度8。本實驗結(jié)果提示，訶子提取物含藥血清可顯著減少H2O2損傷心肌細胞培養(yǎng)基中LDH、CK漏出量，說明提取物含藥血清可減輕細胞膜的損傷程度，降低細胞膜通透性，具有膜穩(wěn)定作用。 

17、;   MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，它的含量可間接反映機體細胞受自由基損傷的程度8。SOD是一種存在于細胞液中的抗氧化酶，它可清除超氧陰離子，保護機體免受超氧陰離子損傷，其值高低間接反映了機體清除氧自由基的能力9。本實驗結(jié)果提示，訶子提取物含藥血清可明顯降低MDA含量、升高SOD活性，說明提取物含藥血清可能通過增強機體對氧自由基的清除能力，減輕細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，從而發(fā)揮對心肌細胞膜的保護作用。上述實驗結(jié)果說明訶子提取物含藥血清對損傷心肌細胞的保護作用可能與抗氧自由基損傷有關(guān)系。    綜上所述,訶子提取物含藥血清對H2O2損傷心肌細胞具

18、有保護作用,其機制可能與穩(wěn)定細胞膜和抗氧化有關(guān)。【】  1 趙麗娟，杜遵義.訶子在藏蒙藥中應(yīng)用研究的概述J.民族醫(yī)藥雜志,2007，4（4）：31-32.2 李景榮，王明時，趙守訓(xùn)，等.鞣質(zhì)的研究（）初試、分離、提取方法J.國外醫(yī)藥.植物藥分冊，1990，5（5）：195-197.3 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理試驗方法學(xué)M.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：567-568.4 史丙俊，陳德宇.中藥血清藥理學(xué)研究初探J.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，26（3）：272-273.5 徐海波，吳清和.中藥血清藥理學(xué)實驗方法的探討J.中國中醫(yī)藥科技，2000，7（1）：43-44.6 張群豪，陳可冀.血清藥理學(xué)在中藥及復(fù)方研究中應(yīng)用的評價J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（3）：131.7 余衛(wèi)平,錢之玉,緒廣林，等.西紅花酸對心肌細胞氧化應(yīng)激性損傷的作用J.中國藥科大學(xué)