第八章 特殊毒性及其試驗與評價方法(1)

1、NoImageNoImage第八章第八章 特殊毒性試驗及其評價特殊毒性試驗及其評價第一節(jié)第一節(jié) 致突變作用及其試驗方法與評價致突變作用及其試驗方法與評價第二節(jié)第二節(jié) 生殖發(fā)育毒性作用及其試驗與評價生殖發(fā)育毒性作用及其試驗與評價第三節(jié)第三節(jié) 致癌作用及其試驗方法與評價致癌作用及其試驗方法與評價NoImageNoImageNoImage第一節(jié)第一節(jié) 致突變作用及其試驗與評價方法致突變作用及其試驗與評價方法一、一、 基本概念基本概念二、突變類型二、突變類型三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制四、致突變試驗與致突變作用評價四、致突變試驗與致突變作用評價NoImageNoImage 1DNA

2、與基因與基因DNA由脫氧核糖、磷酸及堿由脫氧核糖、磷酸及堿基組成，基本成分為四種核基組成，基本成分為四種核苷酸，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)苷酸，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 遺傳學(xué)基礎(chǔ)遺傳學(xué)基礎(chǔ)NoImageNoImage 基因（基因（gene）：）：DNA分子中最小的完整功分子中最小的完整功能單位，是生物遺傳信息的攜帶者能單位，是生物遺傳信息的攜帶者基因組（基因組（genome）：細(xì)胞或生物體的一套）：細(xì)胞或生物體的一套完整單體的遺傳物質(zhì)完整單體的遺傳物質(zhì)NoImageNoImageNoImage 2、染色質(zhì)與染色體、染色質(zhì)與染色體 在間期細(xì)胞的細(xì)胞核中，通在間期細(xì)胞的細(xì)胞核中，通過光鏡可見一種能被堿性染料著過光鏡

3、可見一種能被堿性染料著色的物質(zhì)，即染色質(zhì)。色的物質(zhì)，即染色質(zhì)。 它由它由DNA、組蛋白、非組蛋、組蛋白、非組蛋白及少量的白及少量的RNA組成，形似串珠組成，形似串珠狀的復(fù)合體。狀的復(fù)合體。NoImageNoImageNoImage在間期細(xì)胞核中，一般沒有在間期細(xì)胞核中，一般沒有染色體結(jié)構(gòu)，只有在細(xì)胞分染色體結(jié)構(gòu)，只有在細(xì)胞分裂時，染色質(zhì)才螺旋化并折裂時，染色質(zhì)才螺旋化并折疊成染色體，故染色質(zhì)與染疊成染色體，故染色質(zhì)與染色體是由相同物質(zhì)組成的；色體是由相同物質(zhì)組成的； 染色體存在于細(xì)胞中，通常染色體存在于細(xì)胞中，通常只有在細(xì)胞分裂時經(jīng)過特殊只有在細(xì)胞分裂時經(jīng)過特殊染色才能清楚地看到。染色才能清楚

4、地看到。NoImageNoImage2009-6-30 NoImage染色體可以在顯微鏡下看到。染色體可以在顯微鏡下看到。 染色體成對存在，基因也成對存染色體成對存在，基因也成對存在。在。 個體中成對的基因一個來自母本，個體中成對的基因一個來自母本，另一個來自父本。另一個來自父本。 不同對基因形成配子時的分離與不同對基因形成配子時的分離與不同對染色體在減數(shù)分裂期的分離，不同對染色體在減數(shù)分裂期的分離，都是獨立分配的。都是獨立分配的。NoImageNoImageNoImage3、基因型與表型、基因型與表型 基因型指控制生物性狀的基因組成，它是生物體的遺基因型指控制生物性狀的基因組成，它是生物體的

5、遺傳組成。基因型是性狀發(fā)育的內(nèi)因，是表型形成的根據(jù)。傳組成。基因型是性狀發(fā)育的內(nèi)因，是表型形成的根據(jù)。 表型指在發(fā)育過程中由基因所控制的生物性狀的具體表型指在發(fā)育過程中由基因所控制的生物性狀的具體表現(xiàn)。表現(xiàn)。 外界環(huán)境是基因型轉(zhuǎn)變成具體表型的必要條件。外界環(huán)境是基因型轉(zhuǎn)變成具體表型的必要條件。NoImageNoImageNoImage細(xì)胞周期指細(xì)胞一次分裂結(jié)束，并開始生長，到下一次分裂細(xì)胞周期指細(xì)胞一次分裂結(jié)束，并開始生長，到下一次分裂終了所經(jīng)歷的過程。終了所經(jīng)歷的過程。 G0 ：DNA合成前期；合成前期； G1 ：DNA合成期；合成期； S：完成：完成DNA復(fù)制；復(fù)制； G2：為有絲分裂做準(zhǔn)

6、備；：為有絲分裂做準(zhǔn)備； M：有絲分裂期：有絲分裂期 4、細(xì)胞周期、有絲分裂與減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、有絲分裂與減數(shù)分裂 NoImageNoImage 有絲分裂過程有絲分裂過程NoImage有絲分裂指細(xì)胞核分有絲分裂指細(xì)胞核分裂的過程，一個細(xì)胞裂的過程，一個細(xì)胞由此生成兩個子細(xì)胞，由此生成兩個子細(xì)胞，每個子細(xì)胞各具有與每個子細(xì)胞各具有與親代細(xì)胞完全相同的親代細(xì)胞完全相同的染色體。染色體。NoImageNoImageNoImage減數(shù)分裂過程減數(shù)分裂過程NoImageNoImageNoImageNoImage生物物種可以通過各種繁殖方式來保證世代間生生物物種可以通過各種繁殖方式來保證世代間生命的延續(xù)

7、，這個過程稱為命的延續(xù)，這個過程稱為遺傳遺傳。 遺傳的穩(wěn)定是相對的。遺傳的穩(wěn)定是相對的。 在親子之間或子代個體之間出現(xiàn)不同程度的差異，在親子之間或子代個體之間出現(xiàn)不同程度的差異，這種差異稱為這種差異稱為變異。變異。一、基本概念一、基本概念NoImageNoImageNoImage造成生物變異的原因有：造成生物變異的原因有： 親代個體雜交產(chǎn)生子體，由于重組而發(fā)生；親代個體雜交產(chǎn)生子體，由于重組而發(fā)生； 由于基因突變而發(fā)生，它是新基因產(chǎn)生的根本由于基因突變而發(fā)生，它是新基因產(chǎn)生的根本來源；來源；由于生物的染色體組成或細(xì)胞質(zhì)發(fā)生變化而產(chǎn)由于生物的染色體組成或細(xì)胞質(zhì)發(fā)生變化而產(chǎn)生。生。NoImageN

8、oImageNoImage自發(fā)突變自發(fā)突變 (spontaneous mutation) 是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然條件下是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然條件下發(fā)生的突變。發(fā)生的突變。 特點：自發(fā)突變的發(fā)生過程長，頻率極低特點：自發(fā)突變的發(fā)生過程長，頻率極低 , 與物種與物種的進(jìn)化有關(guān)。的進(jìn)化有關(guān)。誘發(fā)突變誘發(fā)突變 (induced mutation) 是指人為的造成突變是指人為的造成突變 。它已被農(nóng)、林、牧、漁業(yè)和。它已被農(nóng)、林、牧、漁業(yè)和園藝學(xué)家利用來培育和選擇新種或良種。園藝學(xué)家利用來培育和選擇新種或良種。 特點：發(fā)生過程短，頻率高，既可被人類利用，也特點：發(fā)生過程短，

9、頻率高，既可被人類利用，也可能對人類產(chǎn)生危害?？赡軐θ祟惍a(chǎn)生危害。遺傳物質(zhì)發(fā)生變化引起遺傳信息的改變，并發(fā)生遺傳物質(zhì)發(fā)生變化引起遺傳信息的改變，并發(fā)生新的表型效應(yīng)稱為突變。新的表型效應(yīng)稱為突變。NoImageNoImage突變的分類突變的分類v基因突變基因突變 (gene mutation)：一個或幾個一個或幾個DNA 堿基堿基對的改變。用光學(xué)顯微鏡觀察不到，必須通過生長對的改變。用光學(xué)顯微鏡觀察不到，必須通過生長發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變來判斷。發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變來判斷。v染色體畸變?nèi)旧w畸變 (chromosome aberration)：染色體的結(jié)染色體的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變，可用光學(xué)

10、顯微鏡進(jìn)行觀察。構(gòu)及數(shù)目改變，可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。 染色體結(jié)構(gòu)改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)改變 染色體數(shù)目改變?nèi)旧w數(shù)目改變NoImageNoImageNoImage二、突變類型二、突變類型遺傳毒理學(xué)家主要關(guān)注兩類遺傳學(xué)損傷：遺傳毒理學(xué)家主要關(guān)注兩類遺傳學(xué)損傷： 基因突變基因突變 染色體畸變?nèi)旧w畸變NoImageNoImage基因突變基因突變一個或幾個一個或幾個DNADNA堿基對的改變。堿基對的改變。 染色體畸變?nèi)旧w畸變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變。染色體的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變。 端粒端粒姊姊妹妹染染色色單單體體著絲粒著絲粒組組 蛋蛋 白白雙雙 螺螺 旋旋堿基對堿基對端粒端粒NoImageNoImageNoIm

11、age這些損傷多因這些損傷多因DNA受損所致，也可能因受損所致，也可能因DNA以外的靶組織受損所致。以外的靶組織受損所致。 基因突變、染色體畸變及染色體數(shù)目變化的本基因突變、染色體畸變及染色體數(shù)目變化的本質(zhì)是相同的，其區(qū)別在于受損程度。質(zhì)是相同的，其區(qū)別在于受損程度。NoImageNoImageNoImage通常以光學(xué)顯微鏡的分辨率通常以光學(xué)顯微鏡的分辨率0.2 m來區(qū)來區(qū)分基因突變和染色體畸變。分基因突變和染色體畸變。 基因突變是用光學(xué)顯微鏡觀察不到的，基因突變是用光學(xué)顯微鏡觀察不到的，須通過生長發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改須通過生長發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變來判斷，而染色體畸變可用光學(xué)顯微變來

12、判斷，而染色體畸變可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。鏡進(jìn)行觀察。NoImageNoImage1. 基因突變基因突變基因突變指基因中基因突變指基因中DNA序列的變化。序列的變化。 因基因突變限制在一特定的部位，故稱為點突變。因基因突變限制在一特定的部位，故稱為點突變。NoImageNoImage堿基置換堿基置換 指指DNA序列上的某個堿基被其他堿基取代。首序列上的某個堿基被其他堿基取代。首先在先在DNA復(fù)制時會使互補(bǔ)鏈的相應(yīng)位點配上一個復(fù)制時會使互補(bǔ)鏈的相應(yīng)位點配上一個錯誤的堿基，即發(fā)生錯誤配對。這一錯誤配上的錯誤的堿基，即發(fā)生錯誤配對。這一錯誤配上的堿基在下一次堿基在下一次DNA復(fù)制時卻能按正常規(guī)律配對

13、，復(fù)制時卻能按正常規(guī)律配對，于是一對錯誤的堿基置換了原來的堿基對，亦即于是一對錯誤的堿基置換了原來的堿基對，亦即最終產(chǎn)生堿基對置換或簡稱堿基置換。最終產(chǎn)生堿基對置換或簡稱堿基置換。 NoImageNoImageNoImageNoImage移碼突變移碼突變 移碼是移碼是DNA中增加或減少了一對或幾對不等于中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數(shù)的堿基對所造成的突變。的倍數(shù)的堿基對所造成的突變。NoImageNoImage整碼突變整碼突變 指在指在DNA中增加或減少的堿基對為一中增加或減少的堿基對為一個或幾個密碼子。個或幾個密碼子。片斷突變片斷突變 指基因中某些小片斷核苷酸序列發(fā)生指基因中某些小片斷

14、核苷酸序列發(fā)生改變。這種損傷有時可跨越兩個或數(shù)個基改變。這種損傷有時可跨越兩個或數(shù)個基因。片斷突變包括缺失、重復(fù)、重組、重因。片斷突變包括缺失、重復(fù)、重組、重排。排。NoImageNoImage2. 染色體畸變?nèi)旧w畸變指染色體的指染色體的結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常，它是，它是指遺傳物質(zhì)大的改變，一般可用光學(xué)顯指遺傳物質(zhì)大的改變，一般可用光學(xué)顯微鏡檢查適當(dāng)細(xì)胞有絲分裂中期的染色微鏡檢查適當(dāng)細(xì)胞有絲分裂中期的染色體來發(fā)現(xiàn)。體來發(fā)現(xiàn)。NoImageNoImageNoImage（1）染色體結(jié)構(gòu)異常）染色體結(jié)構(gòu)異常 有些畸變是穩(wěn)定的，可通過重復(fù)細(xì)胞分裂傳給子代。這些有些畸變是穩(wěn)定的，可通過重

15、復(fù)細(xì)胞分裂傳給子代。這些畸變?nèi)缛笔А⒌刮?、重?fù)及平衡易位等，多數(shù)為染色體重排，畸變?nèi)缛笔?、倒位、重?fù)及平衡易位等，多數(shù)為染色體重排，可在機(jī)體或細(xì)胞群傳遞?？稍跈C(jī)體或細(xì)胞群傳遞。NoImageNoImage容易觀察到的畸變有容易觀察到的畸變有染色單體斷裂、染色染色單體斷裂、染色體斷裂、無中心粒片段、染色單體交換、體斷裂、無中心粒片段、染色單體交換、雙中心粒染色體、環(huán)狀染色體及某些相互雙中心粒染色體、環(huán)狀染色體及某些相互易位易位。NoImageNoImage染色體畸變?nèi)旧w畸變裂隙裂隙(gap) 斷裂斷裂(break) 斷片斷片(fragment)和缺失和缺失(deletion) 微小體微小體(m

16、inute body) 無著絲點環(huán)無著絲點環(huán)環(huán)狀染色體環(huán)狀染色體 雙著絲點染色體雙著絲點染色體 倒位倒位(inversion) 易位易位(translocation) 插入插入(insertion)和重復(fù)和重復(fù)(duplication) 輻射體輻射體 NoImageNoImage染色體結(jié)構(gòu)變異類型染色體結(jié)構(gòu)變異類型染色體染色體缺失缺失,如果蠅的缺刻翅如果蠅的缺刻翅染色體染色體重復(fù)重復(fù),如果蠅的棒狀眼如果蠅的棒狀眼染色體染色體倒位倒位染色體染色體易位易位, 如夜來香的變異如夜來香的變異 NoImageNoImage在染色體上出現(xiàn)無染色質(zhì)的區(qū)域，但該區(qū)域兩端的在染色體上出現(xiàn)無染色質(zhì)的區(qū)域，但該區(qū)域

17、兩端的染色體仍保持線狀連接者為裂隙。染色體仍保持線狀連接者為裂隙。 指染色體上指染色體上狹窄的非染色帶，狹窄的非染色帶，無線狀連接者為無線狀連接者為斷裂。帶寬超過斷裂。帶寬超過染色單體寬度。染色單體寬度。裂隙裂隙（gap）和）和斷裂斷裂（break）NoImageNoImage一個染色體發(fā)生一次或多次斷裂而不重接，并且這一個染色體發(fā)生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節(jié)段遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開，常將無著絲粒斷片簡稱些已斷裂的節(jié)段遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開，常將無著絲粒斷片簡稱為斷片。有著絲粒的部分稱為缺失，缺失有末端缺為斷片。有著絲粒的部分稱為缺失，缺失有末端缺失和中間缺失。失和中間缺失。無著絲粒斷片無著絲粒斷片（fr

18、agment）、）、缺失缺失（deletion）NoImageNoImage染色體兩臂各發(fā)生一次斷裂，其帶有著絲粒染色體兩臂各發(fā)生一次斷裂，其帶有著絲粒的節(jié)段的兩斷端連接形成一個環(huán)時，稱為環(huán)的節(jié)段的兩斷端連接形成一個環(huán)時，稱為環(huán)狀染色體。狀染色體。環(huán)狀染色體環(huán)狀染色體（ring chromosome）NoImageNoImage當(dāng)某一染色體發(fā)生兩次當(dāng)某一染色體發(fā)生兩次斷裂后，其中間節(jié)段倒斷裂后，其中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)180 再重接，稱為再重接，稱為 倒倒位。位。倒位倒位（inversion）NoImageNoImage當(dāng)一個染色體發(fā)生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插當(dāng)一個染色體發(fā)生三處斷裂，帶有兩斷端的

19、斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來，稱為插入。來，稱為插入。 如果此時有缺失的染色體和插如果此時有缺失的染色體和插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發(fā)生入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發(fā)生于同一位點，則插入將使該染色體連續(xù)出現(xiàn)兩段完于同一位點，則插入將使該染色體連續(xù)出現(xiàn)兩段完全相同的節(jié)段，此時稱為重復(fù)。全相同的節(jié)段，此時稱為重復(fù)。插入插入（insertion）和）和重復(fù)重復(fù)（duplication）NoImageNoImage兩個非同源染色體斷裂后，從某個染色體斷下的兩個非同源染色體斷裂后，從某個染色體斷下的節(jié)段接到另

20、一染色體上稱為易位。節(jié)段接到另一染色體上稱為易位。易位易位（translocation）NoImageNoImage（2） 染色體數(shù)目異常染色體數(shù)目異常 整倍性畸變：整倍性畸變：單、三、四、多倍體單、三、四、多倍體 非整倍性畸變：非整倍性畸變：2倍體多一條或少一條或多多條或少倍體多一條或少一條或多多條或少多條多條 2n-1,2n-2, 2n+1,2n+2, NoImageNoImage類型類型公式公式染色體組染色體組整倍體整倍體單倍體單倍體n(ABCD)二倍體二倍體2n(ABCD) (ABCD)三倍體三倍體3n(ABCD) (ABCD) (ABCD)四倍體四倍體4n(ABCD) (ABCD)

21、(ABCD) (ABCD)非整倍體非整倍體單體單體2n-1(ABCD) (ABC)三體三體 2n+1(ABCD) (ABCD) (A)四體四體2n+2(ABCD) (ABCD) (AA)雙三體雙三體2n+1+1(ABCD) (ABCD) (AB)缺體缺體2n-2(ABC) (ABC)染色體數(shù)目異常的基本類型染色體數(shù)目異常的基本類型注：A、B、C、D代表非同源染色體NoImageNoImageDNA修復(fù)修復(fù)直接修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)切除修復(fù)O6甲基鳥嘌呤修復(fù)甲基鳥嘌呤修復(fù)光修復(fù)光修復(fù)錯配堿基修復(fù)錯配堿基修復(fù)堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)復(fù)制后修復(fù)復(fù)制后修復(fù)呼救性修復(fù)呼救性修復(fù)

22、三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制 外源化學(xué)物引起外源化學(xué)物引起基因突變和染色基因突變和染色體突變的靶部位體突變的靶部位主要是主要是DNA，而，而導(dǎo)致染色體數(shù)目導(dǎo)致染色體數(shù)目異常的靶部位主異常的靶部位主要是有絲分裂和要是有絲分裂和減數(shù)分裂器，如減數(shù)分裂器，如紡錘絲。紡錘絲。NoImageNoImage致突變作用致突變作用（mutagenesis）：是指外來因素特別是）：是指外來因素特別是化學(xué)因子引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力，化學(xué)因子引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力，而且此種改變可隨同細(xì)胞分裂過程而傳遞。而且此種改變可隨同細(xì)胞分裂過程而傳遞。致突變物致突變物：凡能引起生

23、物體遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的化：凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的化學(xué)物質(zhì)或任何環(huán)境因子，又稱誘變劑。又稱為遺傳學(xué)物質(zhì)或任何環(huán)境因子，又稱誘變劑。又稱為遺傳毒物。毒物。四、致突變試驗與致突變作用評價四、致突變試驗與致突變作用評價NoImageNoImageNoImage觀察化學(xué)毒物致突變作用一般通過致突變試驗來觀察化學(xué)毒物致突變作用一般通過致突變試驗來進(jìn)行。主要目的：進(jìn)行。主要目的：檢測外源化學(xué)物的致突變性，預(yù)測其對哺乳動檢測外源化學(xué)物的致突變性，預(yù)測其對哺乳動物和人的致癌性；物和人的致癌性；檢測外源化學(xué)物對哺乳動物生殖細(xì)胞的遺傳毒檢測外源化學(xué)物對哺乳動物生殖細(xì)胞的遺傳毒性，預(yù)測其對人體的遺傳危害性。

24、性，預(yù)測其對人體的遺傳危害性。NoImageNoImage觀察項目的選擇觀察項目的選擇基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映化學(xué)物的致基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映化學(xué)物的致突變性，是評價化學(xué)物致突變性唯一可靠方法。突變性，是評價化學(xué)物致突變性唯一可靠方法。但是還有許多試驗所觀察到的現(xiàn)象并不直接反映基因但是還有許多試驗所觀察到的現(xiàn)象并不直接反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，僅反映致突變突變、染色體畸變和染色體分離異常，僅反映致突變過程中發(fā)生的其他事件。將試驗觀察到的現(xiàn)象所反映過程中發(fā)生的其他事件。將試驗觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱為的各種事件統(tǒng)稱為遺傳學(xué)終點遺傳學(xué)終點(gene

25、tic mdpoint)。NoImageNoImage正常正常DNADNA損傷損傷DNA修復(fù)過程修復(fù)過程未修復(fù)的未修復(fù)的DNA損傷表達(dá)損傷表達(dá)斷裂的斷裂的DNA分子分子染色體結(jié)染色體結(jié)構(gòu)異常構(gòu)異?；蚧蛲蛔兺蛔兗?xì)胞細(xì)胞死亡死亡 非整倍體非整倍體 多倍體多倍體重組事件重組事件 SCE 有絲分裂性交換有絲分裂性交換染色體分染色體分離異常離異常細(xì)胞屏障細(xì)胞屏障遺傳毒物遺傳毒物無誤無誤修復(fù)修復(fù)易錯易錯修復(fù)修復(fù)細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂突變發(fā)生中的事件及遺傳學(xué)終點的關(guān)系突變發(fā)生中的事件及遺傳學(xué)終點的關(guān)系NoImageNoImageNoImage常用的致突變試驗常用的致突變試驗1、細(xì)菌回復(fù)突變試驗、細(xì)菌回復(fù)突變試

26、驗（Ames試驗）試驗） 2、哺乳動物細(xì)胞基因突變、哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗試驗3、果蠅伴性隱性致死試驗、果蠅伴性隱性致死試驗4、染色體畸變分析、染色體畸變分析 5、微核試驗、微核試驗 6、姐妹染色單體交換試驗、姐妹染色單體交換試驗 7、顯性致死試驗、顯性致死試驗 8、小鼠可遺傳易位試驗、小鼠可遺傳易位試驗9、細(xì)菌、細(xì)菌DNA修復(fù)試驗修復(fù)試驗10、程序外、程序外DNA合成實驗合成實驗11、精子畸形試驗、精子畸形試驗12、小鼠特異基因座試驗、小鼠特異基因座試驗NoImageNoImageNoImageNoImageNoImage致突變試驗組合的原則致突變試驗組合的原則一組可靠的試驗系統(tǒng)應(yīng)包括每一

27、類型的遺傳學(xué)終點。一組可靠的試驗系統(tǒng)應(yīng)包括每一類型的遺傳學(xué)終點。如細(xì)菌回復(fù)突變試驗、微核試驗、染色體畸變分析如細(xì)菌回復(fù)突變試驗、微核試驗、染色體畸變分析和姐妹染色單體交換試驗，這一組試驗包括主要類和姐妹染色單體交換試驗，這一組試驗包括主要類型遺傳學(xué)終點。型遺傳學(xué)終點。體內(nèi)試驗與體外試驗配合。體內(nèi)試驗與體外試驗配合。一般體內(nèi)試驗和體外試一般體內(nèi)試驗和體外試驗各有其優(yōu)缺點，應(yīng)取長補(bǔ)短，綜合考慮。驗各有其優(yōu)缺點，應(yīng)取長補(bǔ)短，綜合考慮。配套實驗應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種。配套實驗應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種。如原核如原核細(xì)胞、低等和高等真核細(xì)胞，這樣更加具有說服力。細(xì)胞、低等和高等真核細(xì)胞，這樣更加

28、具有說服力。NoImageNoImage以營養(yǎng)缺陷的突變體菌株為試驗系統(tǒng)，觀察受以營養(yǎng)缺陷的突變體菌株為試驗系統(tǒng)，觀察受試物引起其回復(fù)突變的作用。試物引起其回復(fù)突變的作用。 試驗菌株：試驗菌株：鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌Ames試驗試驗 大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌回復(fù)試驗大腸桿菌回復(fù)試驗 1、細(xì)菌回復(fù)突變試驗、細(xì)菌回復(fù)突變試驗NoImageNoImageAmes試驗原理：試驗原理： 檢測受試物誘發(fā)檢測受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株養(yǎng)缺陷型突變株(his-)回復(fù)突變成野生型回復(fù)突變成野生型(his+)的能力。的能力。 試驗菌株都有組氨酸突變試驗菌株都有組氨酸

29、突變(his-)，不能自行，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養(yǎng)瓊脂平合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養(yǎng)瓊脂平板上不能生長。板上不能生長。NoImageNoImage鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌原養(yǎng)型原養(yǎng)型(his+)組氨酸營養(yǎng)缺陷型組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株突變株(his-)正向突變正向突變回復(fù)突變回復(fù)突變代謝活化系統(tǒng)代謝活化系統(tǒng)受試物受試物NoImageNoImage有點試驗和摻入試驗兩種。應(yīng)分別進(jìn)行不加及加代謝活化系統(tǒng)的試驗，常用為S9混合液，即用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿經(jīng)9000g離心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等輔助因子。NoImageNoImagevAmes試驗

30、標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株有四種：試驗標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株有四種：TA97和和TA98檢檢測移碼突變，測移碼突變，TA100檢測堿基置換突變，檢測堿基置換突變，TA102對對醛、過氧化物和醛、過氧化物和DNA交聯(lián)劑較敏感。交聯(lián)劑較敏感。v這四個試驗菌株除了含有這四個試驗菌株除了含有his-突變，還有一些附突變，還有一些附加突變，檢測時提高試驗敏感性。加突變，檢測時提高試驗敏感性。vAmes試驗的方法有平板摻入法，點試法及預(yù)培試驗的方法有平板摻入法，點試法及預(yù)培養(yǎng)法等。養(yǎng)法等。NoImageNoImage 突變型試驗菌株可被各種誘變因素誘導(dǎo)，回復(fù)突變突變型試驗菌株可被各種誘變因素誘導(dǎo)，回復(fù)突變成野生型成野生型(his

31、+) ，即恢復(fù)了合成組氨酸的能力，可在此，即恢復(fù)了合成組氨酸的能力，可在此平板上生長成可見菌落。平板上生長成可見菌落。 如果受試物處理組回變菌落數(shù)顯著超過陰性對照組；如果受試物處理組回變菌落數(shù)顯著超過陰性對照組；并有劑量反應(yīng)關(guān)系，即可判定受試物為鼠傷寒沙門菌的并有劑量反應(yīng)關(guān)系，即可判定受試物為鼠傷寒沙門菌的致突變物。致突變物。NoImageNoImage結(jié)果判斷v只要一種試驗菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是只要一種試驗菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是致突變物。致突變物。v僅四種菌株均得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致僅四種菌株均得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致突變物。突變物。v不加不加S9混合液

32、得到陽性結(jié)果，說明受試物是直接致混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物是直接致突變物。突變物。v加加S9混合液才得到陽性結(jié)果，說明受試物是間接致混合液才得到陽性結(jié)果，說明受試物是間接致突變物。突變物。NoImageNoImage哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗是利用嚙齒類和人體外培哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗是利用嚙齒類和人體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變試驗。養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變試驗。 常用細(xì)胞株常用細(xì)胞株 選用的基因座選用的基因座 小鼠淋巴瘤細(xì)胞（小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y ） TK、HPRT 中國倉鼠卵巢組織細(xì)胞（中國倉鼠卵巢組織細(xì)胞（CHO） HPRT 中國倉鼠肺組織細(xì)胞（中國倉鼠肺組織細(xì)胞（V79） HPR

33、T 人淋巴細(xì)胞人淋巴細(xì)胞 HPRT 2. 哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(mammalian cell gene mutation assay)NoImageNoImageTK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脫氧核苷：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脫氧核苷ATP 胸苷酸。胸苷酸。 存在嘧啶類似物存在嘧啶類似物5-溴脫氧尿苷時，產(chǎn)生溴脫氧尿苷時，產(chǎn)生異常核苷酸使細(xì)胞死亡。異常核苷酸使細(xì)胞死亡。 受試物存在時若細(xì)胞不死亡說明受試物存在時若細(xì)胞不死亡說明TK發(fā)發(fā)生突變。生突變。（1）TK基因座基因座NoImageNoImage次黃嘌呤、鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶：催化次次黃嘌呤、鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶：催

34、化次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖焦磷酸黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖焦磷酸 核苷核苷-5-單磷酸（單磷酸（NMP），補(bǔ)充途徑。如存在堿），補(bǔ)充途徑。如存在堿基類似物，生成相應(yīng)的基類似物，生成相應(yīng)的NMP，摻入到，摻入到DNA中可致死。中可致死。 加入受試物后能存活的細(xì)胞表示發(fā)生基加入受試物后能存活的細(xì)胞表示發(fā)生基因突變因突變HPRT-。（2）HPRT基因座基因座NoImageNoImage制備細(xì)胞分裂中期相染色體標(biāo)本，在光鏡下可制備細(xì)胞分裂中期相染色體標(biāo)本，在光鏡下可直接觀察染色體的數(shù)目和形態(tài)的改變。直接觀察染色體的數(shù)目和形態(tài)的改變。 染染色體畸變試驗也常稱為色體畸變試驗也常稱為細(xì)胞遺傳學(xué)試驗細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(c

35、ytogenetic assay)。 染色體畸變試驗可為體外試驗，也可為體染色體畸變試驗可為體外試驗，也可為體內(nèi)試驗，包括對體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的分析。內(nèi)試驗，包括對體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的分析。3. 染色體畸變試驗染色體畸變試驗NoImageNoImage體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗：多觀察：多觀察骨髓細(xì)胞骨髓細(xì)胞，其分裂旺，其分裂旺盛、易于獲得和制備，優(yōu)勢在于可體現(xiàn)盛、易于獲得和制備，優(yōu)勢在于可體現(xiàn)哺乳動物的代謝過程、哺乳動物的代謝過程、DNA修復(fù)和藥物修復(fù)和藥物動力學(xué)特征。但應(yīng)注意受試物或其活性動力學(xué)特征。但應(yīng)注意受試物或其活性代謝產(chǎn)物有可能不易在骨髓中達(dá)到足夠代謝產(chǎn)物有可能不易在骨髓中達(dá)到足夠的濃度。的濃度

36、。NoImageNoImage體外試驗體外試驗：常用：常用中國倉鼠肺細(xì)胞中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)，以及中國倉鼠卵巢細(xì)胞以及中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和和V79等細(xì)胞等細(xì)胞系系，但任何細(xì)胞系的染色體皆不穩(wěn)定，不，但任何細(xì)胞系的染色體皆不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確地觀察非整倍體，故在體外試驗中能準(zhǔn)確地觀察非整倍體，故在體外試驗中，如考慮進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，應(yīng)當(dāng)使用，如考慮進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，應(yīng)當(dāng)使用原代或早代細(xì)胞。原代或早代細(xì)胞。 NoImageNoImage2009-6-30 NoImageNoImageNoImage試驗步驟v染毒：健康成年染毒：健康成年ICR小鼠，實驗前小鼠，實驗前24小時予環(huán)磷酰胺小時

37、予環(huán)磷酰胺40mg/kg體重腹腔注射。體重腹腔注射。v收獲細(xì)胞：處死動物前收獲細(xì)胞：處死動物前24h，秋水仙堿，秋水仙堿4mg/kg腹腔注射。小腹腔注射。小鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)后肢股骨，紗布擦去多余肌肉和血污，鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)后肢股骨，紗布擦去多余肌肉和血污，剪去兩端骨垢，用注射器吸剪去兩端骨垢，用注射器吸NS約約5 ml插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，吸管吹打骨髓團(tuán)塊混勻，以入離心管，吸管吹打骨髓團(tuán)塊混勻，以1500 r/min離心離心10min，棄上清液。棄上清液。v低滲：打散沉淀物，加入預(yù)溫低滲：打散沉淀物，加入預(yù)溫37的的 0.075 mol/L KCl約

38、約6ml，混勻，于混勻，于37低滲低滲1520min，再加固定液，再加固定液 l2 ml混勻，立即以混勻，立即以1000r/min離心離心10min，棄上清液。，棄上清液。NoImageNoImagev 固定：重懸細(xì)胞，加入固定液固定：重懸細(xì)胞，加入固定液4ml混勻，放置室溫混勻，放置室溫1020min，然后然后1000r/min離心離心10min，去上清液。同樣方法再固定一次，去上清液。同樣方法再固定一次，棄上清液，留約棄上清液，留約0.5ml。v 制片染色：使細(xì)胞懸浮，用吸管吸取細(xì)胞懸液，距預(yù)冰凍的制片染色：使細(xì)胞懸浮，用吸管吸取細(xì)胞懸液，距預(yù)冰凍的載波片載波片1015Cm高處滴片，干燥，

39、用高處滴片，干燥，用10Giemesa染色液染染色液染色色1020min，輕微沖洗，自然晾干。，輕微沖洗，自然晾干。v 閱片計數(shù)。閱片計數(shù)。NoImageNoImagev染色體數(shù)目改變包括：染色體數(shù)目改變包括：整倍體變異：原先整倍體變異：原先2n的染色體變?yōu)槎啾扼w如的染色體變?yōu)槎啾扼w如3n或或4n等。等。非整倍體變異：染色體組中的個別染色體增加或減少。非整倍體變異：染色體組中的個別染色體增加或減少。v染色體結(jié)構(gòu)改變包括：裂隙染色體結(jié)構(gòu)改變包括：裂隙(G)、斷裂、斷裂(B)、碎片、碎片(F)、環(huán)、環(huán)形形(r)、交換、交換(E)以及復(fù)合性斷裂等。以及復(fù)合性斷裂等。v小鼠和大鼠的染色體核型都為近端著

40、絲點型。小鼠的染小鼠和大鼠的染色體核型都為近端著絲點型。小鼠的染色體數(shù)為色體數(shù)為40條，大鼠的染色體數(shù)為條，大鼠的染色體數(shù)為42條。條。v讀片時每張標(biāo)本片至少要分析讀片時每張標(biāo)本片至少要分析100個中期分裂細(xì)胞。個中期分裂細(xì)胞。NoImageNoImage%100%分析染色體的細(xì)胞數(shù)有染色體畸變細(xì)胞數(shù)）細(xì)胞畸變率（%100%分析染色體的總數(shù)染色體畸變總數(shù)）染色體畸變率（NoImageNoImage染色體的斷片或遲滯的染色體染色體的斷片或遲滯的染色體在細(xì)胞分裂后期，由在細(xì)胞分裂后期，由于不能進(jìn)入子細(xì)胞的核中而在間期的于不能進(jìn)入子細(xì)胞的核中而在間期的子細(xì)胞胞漿內(nèi)子細(xì)胞胞漿內(nèi)形成的游離團(tuán)塊物質(zhì)，它與

41、細(xì)胞形成的游離團(tuán)塊物質(zhì)，它與細(xì)胞主核著色一致主核著色一致，圓，圓形或橢圓形。形或橢圓形。4、微核（、微核（micronucleus）試驗）試驗NoImageNoImageNoImageNoImage無核細(xì)胞無核細(xì)胞紅細(xì)胞紅細(xì)胞有核細(xì)胞中有核細(xì)胞中微核難與正常核分葉微核難與正常核分葉及核突出物區(qū)別及核突出物區(qū)別微微核核試試驗驗NoImageNoImage常用嚙齒類動物常用嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)或或外周血細(xì)胞外周血細(xì)胞進(jìn)行微核試驗。進(jìn)行微核試驗。PCE是紅細(xì)胞成熟的一個階段，此時紅細(xì)是紅細(xì)胞成熟的一個階段，此時紅細(xì)胞的主核已排出，微核容易辯認(rèn)，胞的主核已排出，微核容易

42、辯認(rèn)，PCE胞胞質(zhì)含質(zhì)含RNA染色與成熟紅細(xì)胞易于區(qū)別，故染色與成熟紅細(xì)胞易于區(qū)別，故為骨髓微核試驗的首選細(xì)胞群。為骨髓微核試驗的首選細(xì)胞群。一般采用多次染毒后一般采用多次染毒后24 h采樣。采樣。NoImageNoImage紅細(xì)胞的分化成熟過程NoImageNoImageNoImageNoImageNoImageNoImageMNNCEIllustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus (arrow). Nuclear material appears in yellow, cytoplasm in r

43、ed. Acridin-Orange staining, fluorescence microscopy, enlargement 1000 fold NoImageNoImage試驗步驟試驗步驟v健康成年健康成年ICR小鼠，實驗前小鼠，實驗前24 h予環(huán)磷酰胺予環(huán)磷酰胺40 mg/kg腹腹腔注射染毒。腔注射染毒。v小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)后肢股骨雙側(cè)后肢股骨，紗布擦去多余，紗布擦去多余肌肉和血污，剪去兩端骨垢，用注射器吸取小牛血清，肌肉和血污，剪去兩端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，然后用吸管吹打骨插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，然后用吸管吹打

44、骨髓團(tuán)塊混勻。髓團(tuán)塊混勻。v以以 1000r/min速度離心速度離心 10 min，棄上清液，留下約，棄上清液，留下約0.5 ml沉淀物混勻后，滴片兩張，推片。沉淀物混勻后，滴片兩張，推片。v將推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定將推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾，取出晾干。干。v將固定晾干后的骨髓片，用將固定晾干后的骨髓片，用Giemsa應(yīng)用液染色應(yīng)用液染色1015min，輕微沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾，輕微沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。干。v顯微鏡觀察并計數(shù)微核率。顯微鏡觀察并計數(shù)微核率。NoImageNoImagev PCE呈灰藍(lán)色，成熟呈灰藍(lán)色，成熟RBC呈粉

45、紅色，呈粉紅色，NC呈藍(lán)紫色。呈藍(lán)紫色。v PCE中含有的微核大小為細(xì)胞直徑的中含有的微核大小為細(xì)胞直徑的1/20-1/5，呈圓形或，呈圓形或橢圓形，邊緣光滑整齊，染色性與細(xì)胞核一致，呈紫紅色橢圓形，邊緣光滑整齊，染色性與細(xì)胞核一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。一個細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個或多個微核。每張片或藍(lán)紫色。一個細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個或多個微核。每張片計數(shù)計數(shù)1000個個PCE中含微核的中含微核的PCE數(shù)。數(shù)。 微核率（微核率（）= =含微核含微核PCEPCE細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)PCEPCE細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞總數(shù)1000NoImageNoImageGiemsa染色染色vPCE胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，染色呈灰藍(lán)色；MCN多數(shù)為

46、圓形，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色vNCE的核糖體已消失，被染成淡桔紅色。NCE PCE & MCNNoImageNoImage結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價v本試驗中只計數(shù)本試驗中只計數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。中微核，微核率以千分率表示。vPCE/NCE為評價細(xì)胞毒性的指標(biāo)：為評價細(xì)胞毒性的指標(biāo)：F正常正常PCE/NCE比值約為比值約為l（正常范圍為（正常范圍為0.61.2）；）；F如如PCE/NCE0.1，則表示，則表示PCE形成受到嚴(yán)重形成受到嚴(yán)重抑制；抑制；F如如PCE/NCE0.05，則表示受試化學(xué)毒物的劑，則表示受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗結(jié)果不可靠。量過大，試驗結(jié)果

47、不可靠。NoImageNoImage77結(jié)果示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中一個微核（胞中一個微核（MN）示小鼠骨髓正常嗜多示小鼠骨髓正常嗜多染紅細(xì)胞（染紅細(xì)胞（NCE）NoImageNoImage78示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中兩個微核（示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中兩個微核（MN）NoImageNoImage79示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中多個微核（示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中多個微核（MN）NoImageNoImage 顯性致死指發(fā)育中的精子或卵子細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)顯性致死指發(fā)育中的精子或卵子細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)損傷，導(dǎo)致受精卵或發(fā)育中的胚胎死亡。損傷，導(dǎo)致受精卵或發(fā)育中的胚胎死亡。一般認(rèn)為顯一般認(rèn)為顯

48、性致死主要是由于染色體損傷的結(jié)果。性致死主要是由于染色體損傷的結(jié)果。顯性致死試驗顯性致死試驗以以胚胎死亡胚胎死亡為觀察終點，為觀察終點，用于檢測受試物對動物性細(xì)用于檢測受試物對動物性細(xì)胞的染色體損傷作用。胞的染色體損傷作用。 一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接觸受試物，一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接觸受試物，然后使之與未染毒的雌性交配，觀察胚胎死亡情況。然后使之與未染毒的雌性交配，觀察胚胎死亡情況。計算出受孕率、總著床數(shù)、早期和晚期胚胎死亡率予計算出受孕率、總著床數(shù)、早期和晚期胚胎死亡率予以評價。以評價。5. 顯性致死試驗顯性致死試驗(dominant lethal assay)NoImageNoImage6. 程序外程序外DNA合成試合成試驗驗(unscheduled DNA synthesis test，UDS) 當(dāng)當(dāng)DNA受損后，受損后，DNA的修復(fù)合成可發(fā)生在正常復(fù)制合成期的修復(fù)合成可發(fā)生在正常復(fù)制合成期(S期期)以外的其他時期，稱為程序外以外的其他時期，稱為程序外DNA合成。用同步培養(yǎng)將合成。用同步培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于細(xì)胞阻斷于Gl期，并將正常的期，并將正常的DNA半保留復(fù)制阻斷，然后用半保留復(fù)制阻斷，然后用受試物處理細(xì)胞，并在加有受試物處理細(xì)胞，并在加