結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（第...

1、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（第一次征求意見(jiàn)稿） 一、前言本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則是對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)

2、證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。二、適用范圍 中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者人數(shù)居世界第二位。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和非洲分枝桿菌等引起的慢性傳染性疾病，可累及全身各個(gè)器官，以肺結(jié)核最為多見(jiàn)。其中，結(jié)核病的病原菌主要是結(jié)核分枝桿菌，牛結(jié)核分枝桿菌次之。結(jié)核分枝桿菌主要是經(jīng)空氣傳播，大多數(shù)人在感染結(jié)核分枝桿菌后并無(wú)癥狀，稱(chēng)為潛伏感染。潛伏感染可持續(xù)幾十年，僅有5-10%的潛伏感染者發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核1，2。

3、在結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，通常將分枝桿菌分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex）和非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria, NTM）。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis）、牛結(jié)核分枝桿菌( M. bovis)、非洲分枝桿菌（M. africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti）。在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)各種中，除田鼠分枝桿菌對(duì)人無(wú)致病力外，其他三種菌均可對(duì)人致病，產(chǎn)生大致相同的臨床表現(xiàn)。因此，臨床上往往只做結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定而不進(jìn)行亞種水平的鑒定1，用于結(jié)核輔助診斷

4、的核酸檢測(cè)試劑也常采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的基因序列作為靶標(biāo)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。 核酸檢測(cè)是肺結(jié)核病原學(xué)診斷的重要參考。2009年，美國(guó)CDC更新了肺結(jié)核的診療指南，將核酸檢測(cè)作為肺結(jié)核的輔助診斷方法，明確：對(duì)所有疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)至少進(jìn)行一個(gè)呼吸道樣本的核酸檢測(cè)。我國(guó)臨床診療指南-結(jié)核病分冊(cè)也明確：結(jié)核分枝桿菌的DNA檢測(cè)可作為肺結(jié)核診斷的參考。與其他實(shí)驗(yàn)室檢查方法比較，核酸檢測(cè)的價(jià)值在于：（1）可快速鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌，提高涂片陽(yáng)性肺結(jié)核的診斷特異性；（2）與涂片比較，靈敏度較高，可提高涂片陰性肺結(jié)核的檢出率；（3）與培養(yǎng)相比，操作快速，可及早進(jìn)行正確的醫(yī)療處置。結(jié)核分枝桿菌

5、復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑是指：利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等，以特定的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的基因序列為檢測(cè)靶標(biāo)，對(duì)源于人呼吸道的臨床樣本（痰、支氣管肺泡灌洗液）中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑，用于肺結(jié)核的輔助診斷。本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對(duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。本指導(dǎo)原則適用于以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的基因序列作為靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的試劑，對(duì)于某些以結(jié)核分枝桿菌特有的基因序

6、列為靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。本指導(dǎo)原則適用于預(yù)期用途為肺結(jié)核輔助診斷的、以痰或支氣管肺泡灌洗液作為適用樣本類(lèi)型的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑。對(duì)于用途相同的其他呼吸道樣本類(lèi)型，或者預(yù)期用途為肺外結(jié)核輔助診斷的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。三、注冊(cè)申報(bào)資料要求（

7、一）綜述資料綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、最低檢測(cè)限及被測(cè)靶基因序列的特性等方面寫(xiě)明申報(bào)試劑與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若被測(cè)物為新的靶基因序列，則應(yīng)詳細(xì)論述作為檢測(cè)靶標(biāo)的基因序列的臨床意義，即其與臨床應(yīng)用（可用于肺結(jié)核輔助診斷）的相關(guān)性，并提供充分的支持資料。綜述資料應(yīng)符合體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)辦法）和體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求及說(shuō)明的相關(guān)要求。 （二）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則的要

8、求，境外試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。 結(jié)合體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則的要求，下面對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地編制說(shuō)明書(shū)?！绢A(yù)期用途】 應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：1試劑盒用于體外定性檢測(cè)人xx樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸。2簡(jiǎn)單介紹結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括哪些種的細(xì)菌、致病性、感染后的臨床表現(xiàn)，靶基因序列的特

9、征（靶基因在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的存在情況、基因位置、拷貝數(shù)等）及選擇依據(jù)，其他病原體（如：非結(jié)核分枝桿菌NTM）中是否存在靶基因。 3待測(cè)人群特征介紹：具有結(jié)核病相關(guān)體征/癥狀和X線檢查結(jié)果的疑似結(jié)核病患者、地域要求或年齡限制（如有）等。4強(qiáng)調(diào)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備相關(guān)的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序?！局饕M成成份】1說(shuō)明試劑盒包含組份的名稱(chēng)、數(shù)量、比例或濃度等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。2. 試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱(chēng)、貨號(hào)及其他相關(guān)信息。3. 如果試劑盒中

10、不包含用于核酸提取/純化的試劑組份，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸提取/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)以及產(chǎn)品貨號(hào)等詳細(xì)信息?！緳z驗(yàn)原理】1. 對(duì)試劑盒檢測(cè)的靶基因進(jìn)行詳細(xì)描述（長(zhǎng)度、基因位置及拷貝數(shù)等），對(duì)引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。2. 核酸提取/純化方法、原理等。3. 試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明?！緝?chǔ)存條件及有效期】 說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期?！緲颖疽蟆?重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：1. 樣本的收集：應(yīng)參照臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核

11、病分冊(cè)）（中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求，并詳細(xì)描述采樣步驟和注意事項(xiàng)。2. 臨床樣本的前處理（如適用）：應(yīng)參考臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）（中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法，尤其是痰標(biāo)本，如堿處理-直接法、N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）-NaOH法等，詳細(xì)描述具體的前處理方法。3. 樣本的其他處理、運(yùn)送和保存：明確核酸提取/純化前的其他處理（如離心、洗滌等）、保存條件及期限（短期、長(zhǎng)期）、運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，

12、凍融次數(shù)的限制?！具m用儀器】所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。 【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括： 1. 實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。 2. 試劑配制方法、注意事項(xiàng)。 3. 詳述待測(cè)樣本及相關(guān)對(duì)照（如適用）核酸提取/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)。 4. 擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。 5. PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。 6. 儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。 7. 基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法?！緳z驗(yàn)結(jié)果的解釋】結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性

13、對(duì)照、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）、核酸提取/純化對(duì)照（如適用）以及樣本管檢測(cè)結(jié)果的Ct值，以列表的形式對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。【檢驗(yàn)方法的局限性】1. 本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。2. 有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析（1）不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理、樣本中細(xì)菌含量過(guò)低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。（2）待測(cè)靶基因的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。（3）未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。3有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析

14、（如適用）除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群外，其他病原體可能含有待測(cè)基因，因而導(dǎo)致假陽(yáng)性，列出可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的病原體目錄?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】 詳述以下性能指標(biāo)：1. 對(duì)國(guó)家參考品檢測(cè)的符合情況，簡(jiǎn)要描述采用國(guó)家參考品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果（如適用）。2. 最低檢測(cè)限：說(shuō)明試劑的最低檢出濃度，簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的試驗(yàn)方法及結(jié)果。3. 企業(yè)陽(yáng)性、陰性參考品的檢測(cè)符合情況，簡(jiǎn)單介紹陰陽(yáng)性參考品的組成、濃度和符合率結(jié)果等信息。4. 精密度：精密度參考品的組成、濃度及結(jié)果。5. 分析特異性（1）交叉反應(yīng)：對(duì)出現(xiàn)在相應(yīng)臨床標(biāo)本中可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式明確經(jīng)過(guò)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體名稱(chēng)、菌株特

15、性、濃度等信息；（2）干擾物質(zhì)：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，如血液、粘液或藥物等；6. 對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。 7. 境外（如適用）和境內(nèi)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)?！咀⒁馐马?xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：1. 有關(guān)人源組份（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)xx組份可能含有人源物質(zhì)，雖已經(jīng)通過(guò)了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項(xiàng)目的檢測(cè)，但截至目前，沒(méi)有任何一項(xiàng)檢測(cè)可以確保絕對(duì)安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對(duì)待。2. 臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分

16、子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。 （三）產(chǎn)品技術(shù)要求產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合辦法和體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求及說(shuō)明的相關(guān)規(guī)定。申請(qǐng)人應(yīng)按照醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則的有關(guān)要求，編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求，內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法，并在附錄中明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。產(chǎn)品技術(shù)要求中的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)與說(shuō)明書(shū)保持一致。如申報(bào)試劑已有相應(yīng)的國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則產(chǎn)品技術(shù)要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。（四）產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)報(bào)告根據(jù)辦法要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類(lèi)產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測(cè)。如申報(bào)試劑有適用的國(guó)家參考

17、品，應(yīng)采用國(guó)家參考品進(jìn)行注冊(cè)檢驗(yàn)，并符合國(guó)家參考品的相關(guān)要求。（五）主要原材料的研究資料應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、酶、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及企業(yè)參考品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；如主要原材料購(gòu)自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告或性能指標(biāo)證書(shū)，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。申請(qǐng)人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)的制備過(guò)程，包括組成、來(lái)源、菌株特性（如名稱(chēng)、種屬、靶基因的拷貝數(shù)、濃度等）等信息。企業(yè)參考品的項(xiàng)目應(yīng)包括：陰性參考品、陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品、重復(fù)性參考品等。陽(yáng)性參考

18、品應(yīng)著重考慮結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的代表菌株，陰性參考品則主要涉及對(duì)分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗(yàn)證情況。建議采用滅活的菌株建立企業(yè)參考品，不宜采用質(zhì)粒、菌株的基因組提取/純化物或臨床樣本（如痰液）。申報(bào)試劑的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性、陰性、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）等各種對(duì)照來(lái)實(shí)現(xiàn)，需考慮對(duì)樣本核酸提取/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)量控制。陽(yáng)性對(duì)照的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測(cè)樣本的核酸性質(zhì)一致，如同為DNA或RNA。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種對(duì)照的Ct值做出明確的范圍要求。申報(bào)資料應(yīng)詳細(xì)描述對(duì)照的原料選擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料。本指導(dǎo)原則的技術(shù)

19、要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對(duì)于采用該方法學(xué)的結(jié)核核酸檢測(cè)試劑，建議至少設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)對(duì)照。 1內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）內(nèi)對(duì)照可對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能存在的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、儀器、試劑和操作等所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。內(nèi)對(duì)照可采用不含靶序列的質(zhì)?；蚓€性DNA、非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的病原體或克隆菌株（推薦），靶核酸為RNA時(shí)可采用包裝的RNA等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確的驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。2陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。陽(yáng)性對(duì)照可為：含有靶序列的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物菌株或其他病原

20、體（推薦）、含有靶序列且濃度在最低檢測(cè)限附近的核酸（如含有靶序列的質(zhì)粒、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株的基因組核酸提取/純化物，靶核酸為RNA時(shí)可采用包裝的RNA等）等。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種陽(yáng)性對(duì)照的Ct值做出明確的范圍要求。陽(yáng)性對(duì)照需參與樣本核酸的平行提取/純化（如有必要）。3陰性對(duì)照陰性對(duì)照對(duì)可能存在的交叉污染進(jìn)行假陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)控。陰性對(duì)照可以是空白對(duì)照。陰性對(duì)照需參與樣本核酸的平行提取/純化。由于申報(bào)試劑所適用的臨床樣本比較復(fù)雜，其中可能含有各種影響PCR反應(yīng)的抑制物，從而影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果，造成假陰性的可能性。因此，申報(bào)試劑應(yīng)充分考慮對(duì)樣本核酸提取/純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，通過(guò)設(shè)置各種對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。比如，采

21、用克隆菌株作為內(nèi)對(duì)照，或者采用菌株作為陽(yáng)性對(duì)照并參與樣本核酸的平行提取/純化，或者設(shè)置專(zhuān)門(mén)的核酸提取/純化對(duì)照（如菌株）等，以對(duì)樣本核酸提取/純化的質(zhì)量及效率進(jìn)行評(píng)估。4. 核酸提取/純化組分（如適用）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。5. PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶、內(nèi)標(biāo)及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：（1）脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對(duì)純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。（2）引物由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚

22、丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對(duì)序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。（3）探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進(jìn)行標(biāo)記，如熒光素報(bào)告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到高效液相色譜純。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明

23、，如HPLC分析圖譜；應(yīng)對(duì)探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。（4）PCR反應(yīng)所需酶DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對(duì)酶活性有合理驗(yàn)證；應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。 6. 核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（Dnase）或核糖核酸酶（Rnase）污染。（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料主要生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比

24、應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：1. 主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。2. 反應(yīng)原理介紹。3. 基因序列的選擇、PCR方法學(xué)特性介紹。4. 核酸提取/純化方法的優(yōu)化。 5. 確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度、樣本量及反應(yīng)體積等。6. 確定PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。7. 對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確

25、定的研究資料。（七）分析性能評(píng)估資料企業(yè)應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對(duì)申報(bào)試劑進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體的試驗(yàn)方法（操作步驟）、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸定性檢測(cè)試劑，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。1. 最低檢測(cè)限（分析靈敏度）（1）最低檢測(cè)限的確定建議使用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、牛結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或BCG標(biāo)準(zhǔn)菌株（如適用）的梯度稀釋液來(lái)確定最低檢測(cè)限。每個(gè)梯度進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，將具有95%陽(yáng)性檢出率的菌株濃度作為最低檢測(cè)限。應(yīng)明確每份菌株的來(lái)源、基因型特性、濃度、制備方法等信息。企業(yè)可采用鋪板計(jì)數(shù)細(xì)菌集落形成單位（colony for

26、ming unit，CFU）的方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國(guó)家參考品對(duì)菌株的濃度進(jìn)行標(biāo)定，以“個(gè)菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。為確定痰樣本的最低檢測(cè)限，建議將已知濃度的菌株與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性的痰樣本進(jìn)行混合，完全按照申報(bào)試劑的操作步驟對(duì)此“制備痰液”進(jìn)行樣本前處理、核酸提取/純化擴(kuò)增等。對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。最低檢測(cè)限的濃度應(yīng)是“制備痰液”的最終菌株濃度。（2）最低檢測(cè)限的驗(yàn)證應(yīng)在最低檢測(cè)限的菌株濃度對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株（如適用）進(jìn)行

27、至少20次的重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，每種菌株的陽(yáng)性檢出率應(yīng)至少為95%。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測(cè)限驗(yàn)證的各個(gè)菌株的來(lái)源、制備方法及濃度等信息?！白畹蜋z測(cè)限的驗(yàn)證”的試驗(yàn)方法可參考“最低檢測(cè)限的確定”。2. 分析特異性（1）交叉反應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類(lèi)主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。主要包括：非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（NTM）、常見(jiàn)的口腔和呼吸道共生的病原體等，具體目錄參見(jiàn)表1和表2。建議在病原體感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。建議進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的分枝桿菌、細(xì)菌或者真菌的最低濃度為106

28、CFU/mL；進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒的最低濃度為105 PFU/mL（plaque forming unit，PFU，空斑形成單位）。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體的制備方法、來(lái)源、種屬和濃度等信息。 對(duì)于某些難以培養(yǎng)或者因?yàn)樯锇踩詿o(wú)法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體核酸的來(lái)源、組成和濃度等信息。采用病原體核酸樣本進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)將核酸樣本視為實(shí)際使用過(guò)程中參與PCR反應(yīng)的核酸樣本，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)的要求配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中體現(xiàn)。表1用于交叉反應(yīng)性研究的其他分枝桿

29、菌（非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群）堪薩斯分枝桿菌蘇加分枝桿菌海分枝桿菌龜分枝桿菌土地分枝桿菌偶發(fā)分枝桿菌次要分枝桿菌恥垢分枝桿菌潰瘍分枝桿菌膿腫分枝桿菌戈登分枝桿菌胃分枝桿菌蟾蜍分枝桿菌胞內(nèi)分枝桿菌鳥(niǎo)分枝桿菌草分枝桿菌瘰疬分枝桿菌表2：用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體肺炎鏈球菌金黃色葡萄球菌流感嗜血桿菌巴西諾卡氏菌大腸桿菌綠膿桿菌表皮葡萄球菌白色念珠菌人類(lèi)副流感病毒（1,2,3型）鼻病毒人流感病毒（A型和B型）腺病毒風(fēng)疹病毒水痘-帶狀皰疹病毒隱球菌（2）干擾物質(zhì)潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（如血液、粘液、人細(xì)胞等）和外源性藥物。 建議使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，另外，建議申請(qǐng)人在每種干擾物

30、質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于常見(jiàn)藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。表5：建議用于干擾研究的外源性藥物異煙肼乙胺丁醇利福平吡嗪酰胺卡那霉素鏈霉素抗生素（如：阿莫西林、左氧氟沙星）抗病毒藥（如：扎那米韋）鼻腔噴霧劑或滴鼻劑(如：腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液)鼻腔糖皮質(zhì)激素（如：倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松）鼻用軟膏類(lèi)（如：莫匹羅星）3. 精密度 測(cè)量精密度的評(píng)價(jià)方法并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參

31、考相關(guān)的CLSI-EP文件或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì)申報(bào)試劑的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。（1）對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報(bào)試劑（包括提取/純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)不同的適用機(jī)型（如PCR分析儀）、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。（2）合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少12天的檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)（參考

32、FDA的指導(dǎo)原則）。 （3）建議采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（陰性樣本可能不適用）作為樣本，在以下3個(gè)濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證：陰性樣本：不含結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或者結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度低于最低檢測(cè)限的樣本，陰性檢出率應(yīng)為100%（n20）。弱陽(yáng)性樣本：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度略高于試劑盒的最低檢測(cè)限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)高于95%（n20）。中等陽(yáng)性樣本：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度約為最低檢測(cè)限的2倍或3倍，陽(yáng)性檢出率為100%且CV15%（n20）。4. 反應(yīng)性（包容性）應(yīng)證明申報(bào)試劑可以檢測(cè)代表不同基因多態(tài)性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株。應(yīng)至少對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株(如適用)、非洲分枝桿菌

33、和田鼠分枝桿菌進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)采用略高于最低檢測(cè)限濃度的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株進(jìn)行研究。應(yīng)提供各個(gè)菌株的來(lái)源、菌株特性及濃度等信息。應(yīng)證明所有采用的菌株含有目的基因。5.不同適用樣本類(lèi)型、核酸提取/純化方法、樣本前處理方法的分析性能資料的要求 由于痰和支氣管肺泡灌洗液樣本之間差異較大，如申報(bào)試劑同時(shí)包括這兩種樣本類(lèi)型，申請(qǐng)人應(yīng)提交每種樣本類(lèi)型的全項(xiàng)目分析性能評(píng)估資料。對(duì)于每種樣本類(lèi)型而言，申請(qǐng)人應(yīng)提供適用的核酸提取/純化方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的核酸提取/純化方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（至少包括最低檢測(cè)限和精密性項(xiàng)目），以證明不同的核酸提取/純化方法等效。對(duì)于每種適用樣本類(lèi)型而言，

34、申請(qǐng)人應(yīng)提交適用的樣本前處理方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的樣本前處理方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（最低檢測(cè)限項(xiàng)目），以證明不同的樣本前處理方法等效。如果申報(bào)試劑同時(shí)適用于幾種不同的臨床樣本類(lèi)型、樣本前處理方法和核酸提取/純化方法，每種樣本類(lèi)型應(yīng)明確其適用的樣本前處理方法（一種或幾種）和核酸提取/純化方法（一種或幾種）。如果申報(bào)試劑最終僅保留某種樣本類(lèi)型、某種樣本前處理方法和某種核酸提取/純化方法，分析性能評(píng)估資料應(yīng)采用該組合進(jìn)行。 6注意事項(xiàng)對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)【適用機(jī)型】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的至少三批全性能評(píng)估資料。 （八）陽(yáng)性判斷值或參考區(qū)間確定資料 對(duì)于

35、此類(lèi)試劑，陽(yáng)性判斷值或參考區(qū)間確定資料主要是指Ct值的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報(bào)試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考CLSI的GP10-A的文件：Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristics(ROC) Plots)。如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)上下限確定的詳細(xì)的研究資料。（九）穩(wěn)定性研究資料 穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效

36、期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇35個(gè)溫度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析性能驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類(lèi)型樣本的效期穩(wěn)定性。用于樣本穩(wěn)定性研究的樣本應(yīng)包括最低檢測(cè)限濃度的樣本。除了定性結(jié)果之外，還需要提供原始信號(hào)的分析，如Ct。適于冷凍

37、保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性?xún)刹糠謨?nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。（十）臨床試驗(yàn)1. 臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定開(kāi)展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局資質(zhì)認(rèn)可。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景、病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)必須具有與試驗(yàn)用體外診斷試劑相適應(yīng)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備，并能夠確保該項(xiàng)試驗(yàn)的實(shí)施。2臨床試驗(yàn)樣本的選擇和樣本量 臨床試驗(yàn)對(duì)象的選擇應(yīng)滿足如下條件：（1）具有肺結(jié)核癥狀/體征

38、的疑似肺結(jié)核患者病例，不建議選擇正常健康人群；（2）最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于350例，并且涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例應(yīng)不小于50%；（3）應(yīng)包括其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核），以對(duì)試驗(yàn)用體外診斷試劑的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，此部分病例不少于150例；（2）單份臨床樣本應(yīng)足量，以便同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)用體外診斷試劑、對(duì)比試劑和其他合理的方法等的檢測(cè)。鑒于痰和支氣管肺泡灌洗液樣本之間的差異較大，如試驗(yàn)用體外診斷試劑同時(shí)適用于兩種樣本類(lèi)型，則每種樣本類(lèi)型的例數(shù)不少于500例。臨床試驗(yàn)應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用凍存樣本應(yīng)另行說(shuō)明。臨床試驗(yàn)應(yīng)對(duì)不同的核酸提取/純化方法和樣本

39、前處理方法進(jìn)行驗(yàn)證。3對(duì)比試劑的選擇對(duì)于“已有同品種批準(zhǔn)上市”的試劑的臨床試驗(yàn)，可按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類(lèi)產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與對(duì)比試劑進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。同時(shí)，申請(qǐng)人還應(yīng)選擇一定數(shù)量的臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)用體外診斷試劑與培養(yǎng)鑒定方法的比較研究，每種樣本類(lèi)型不少于50例經(jīng)培養(yǎng)和菌種鑒定方法確定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的陽(yáng)性樣本。其中，培養(yǎng)方法可采用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)方法或臨床普遍認(rèn)可的液體培養(yǎng)方法，菌種鑒定方法可采用對(duì)硝基苯甲酸（p-methylbenzylsulfonyl，PNB）、測(cè)序、高性能的液相層析、質(zhì)譜

40、、或其他已上市的核酸檢測(cè)試劑盒方法。 對(duì)于無(wú)法選擇對(duì)比試劑的新研制的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑，其臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇培養(yǎng)鑒定和/或核酸序列測(cè)定方法作為對(duì)比方法，總例數(shù)不少于500例。用于核酸序列測(cè)定的引物序列應(yīng)不同于試驗(yàn)用體外診斷試劑中用于檢測(cè)靶基因的引物序列。如采用培養(yǎng)鑒定作為對(duì)比方法，考慮到檢測(cè)結(jié)果之間不具有直接的可比性，建議對(duì)所有陽(yáng)性病例采用其他分子生物學(xué)技術(shù)（如核酸序列測(cè)定）對(duì)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。如果試驗(yàn)用體外診斷試劑同時(shí)適用于幾種不同的臨床樣本類(lèi)型、樣本前處理方法和核酸提取/純化方法，每種樣本類(lèi)型應(yīng)明確規(guī)定其適用的樣本前處理方法（一種或幾種）和核酸提取/純化方法（一種或幾種）。如果試驗(yàn)用體

41、外診斷試劑最終僅保留某種樣本類(lèi)型、某種樣本前處理方法和某種核酸提取/純化方法，臨床試驗(yàn)應(yīng)采用該組合進(jìn)行。4. 臨床試驗(yàn)方法、臨床數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析（1）應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或者臨床試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)描述試驗(yàn)用體外診斷試劑和對(duì)比試劑的具體操作步驟。應(yīng)明確所有試驗(yàn)采用同一份樣本進(jìn)行。應(yīng)明確每個(gè)試驗(yàn)陰陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，特別應(yīng)明確何為培養(yǎng)鑒定的陰陽(yáng)性。（2）在臨床報(bào)告中，以列表的方式，明確：總樣本例數(shù)、涂片陽(yáng)性的總樣本例數(shù)、涂片陰性的總樣本例數(shù)、臨床診斷為肺結(jié)核的患者總例數(shù)、涂片陰性的肺結(jié)核患者例數(shù)、涂片陽(yáng)性的肺結(jié)核患者例數(shù)、非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者與易混淆疾病樣本例數(shù)，以判斷病例選擇的科學(xué)合理性。（3）臨床試驗(yàn)

42、數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括每個(gè)樣本的涂片結(jié)果、臨床診斷結(jié)果、試驗(yàn)用體外診斷試劑的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果。（4）對(duì)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測(cè)結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽(yáng)性符合率等。（5）除了對(duì)總樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析外，還應(yīng)對(duì)涂片陰性的樣本和涂片陽(yáng)性的樣本進(jìn)行分層統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法同總樣本的統(tǒng)計(jì)方法。（6）臨床試驗(yàn)中的某些樣本，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑檢測(cè)時(shí)為陽(yáng)性，采用培養(yǎng)鑒定方法檢測(cè)時(shí)為陰性，出現(xiàn)這種情況的原因有：（1）樣本前處理導(dǎo)致結(jié)核菌的培養(yǎng)受抑制；（2）樣本中結(jié)核菌的濃度過(guò)低。這可能導(dǎo)致試驗(yàn)用體外診斷試劑的特異性低。因此，在進(jìn)行（4）、（5）統(tǒng)計(jì)

43、分析的同時(shí)，建議補(bǔ)充進(jìn)行試驗(yàn)用體外診斷試劑與最終臨床診斷的對(duì)比統(tǒng)計(jì)分析，以客觀地反應(yīng)試驗(yàn)用體外診斷試劑的臨床特異性。對(duì)于試驗(yàn)用體外診斷試劑與對(duì)比試劑的等效性評(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)試驗(yàn)用體外診斷試劑與對(duì)比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。5. 結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)或其他合理的方法進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。6. 臨床

44、試驗(yàn)方案 臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究者應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。 試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分

45、析。另外，試驗(yàn)用體外診斷試劑的樣本類(lèi)型不應(yīng)超越對(duì)比試劑對(duì)樣本類(lèi)型的檢測(cè)要求，如果選擇了對(duì)比試劑適用樣本類(lèi)型以外的樣本，則應(yīng)選擇核酸測(cè)序或其他合理方法對(duì)額外的樣本類(lèi)型進(jìn)行驗(yàn)證。7. 臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫(xiě)根據(jù)體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床試驗(yàn)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。（1）臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期

46、選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。樣本類(lèi)型，樣本的收集、處理及保存；痰液的培養(yǎng)、鑒定方法；培養(yǎng)陰性、陽(yáng)性的具體涵義；鑒定陰性陽(yáng)性的具體含義；等。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。（2）具體的臨床試驗(yàn)情況 試驗(yàn)用體外診斷試劑和對(duì)比試劑的名稱(chēng)、批號(hào)、有效期及所用機(jī)型等信息。 對(duì)各試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)、年齡分布情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。 質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對(duì)檢測(cè)精密度、質(zhì)控品測(cè)量值的抽查結(jié)果評(píng)估。 具體試驗(yàn)過(guò)程，樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、樣本長(zhǎng)期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。（3）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測(cè)或其他合理方法的復(fù)核以及是否納入

47、最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、研究過(guò)程中是否涉及對(duì)方案的修改。 陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。 以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。（4）討論和結(jié)論 對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床試驗(yàn)有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。四、名詞解釋1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2. 熒光探