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1、CYP27A1基因表達(dá)與肝癌患者臨床表型相關(guān)性及其預(yù)后作用瞿兵The prognostic relevance of CYP27A1 in patients with hepatocarcinoma Bing Qu摘要 目的：從基因表達(dá)水平探討肝癌患者的獨立預(yù)后因素，為開發(fā)新的治療肝癌靶向藥物奠定基礎(chǔ)。方法：本研究通過在GEO數(shù)據(jù)下載肝癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)GSE14520，分析CYP27A1與肝癌患者年齡、性別、 PRMS分類、血清ALT水平、腫瘤大小、結(jié)節(jié)數(shù)目、肝硬化、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期以及血清AFP水平等臨床表型的相關(guān)性，以及CYP27A1與肝癌患者臨床預(yù)后指標(biāo)（無進(jìn)展生存期

2、、總生存期）的關(guān)系，明確CYP27A1在對肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制。結(jié)果：相較于正常肝臟組織，CYP27A1在肝癌中表達(dá)明顯下調(diào)；CYP27A1高表達(dá)組和CYP27A1低表達(dá)組患者在年齡和性別分布上及血清ALT水平和肝硬化情況無明顯差異，CYP27A1高表達(dá)組患者中PRMS分類、腫瘤大小、腫瘤類型、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期、血清AFP水平等臨床表型均明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者，CYP27A1高表達(dá)組肝癌患者的無進(jìn)展生存期和總生存期明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)肝癌患者。CYP27A1可能在細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制及腫瘤增殖相關(guān)信號通路等生物學(xué)過程影響肝癌細(xì)胞增殖。結(jié)論：CYP27

3、A1或可作為肝癌患者獨立預(yù)后因素，高表達(dá)CYP27A1的肝癌患者的臨床預(yù)后明顯優(yōu)越與CYP27A1低表達(dá)肝癌患者。關(guān)鍵詞：肝癌；CYP27A1；臨床表型；預(yù)后；AbstractBackground: hepatocarcinoma is one of most common cancers worldwide, and the prognosis of patients with hepatocarcinoma remains poor. Investigating the independent prognostic factors of hepatocarcinoma at gene-ex

4、pression level might facilitate the development of novel agent for treating hepatocarcina. Methods: In the present study, we analyzed the correlation between the expression of CYP27A1 and the characteristics of hepatocarcina patients including age, gender, PRMS classification, ALT, main tumor size,

5、multinodular, cirrhosis, TNM staging, BCLC staging, CLIP staging and AFP. Meanwhile, the progression free survival and overall survival of hepatocarcina patients were also analyzed. Gene set enrichment analysis (GSEA) was conducted to characterize the potential mechanisms regarding the impact of CYP

6、27A1 on hepatocarcina cells. Results: Compared with normal liver tissues, the CYP27A1 was downregulated in tumor cells. No significant differences could be found between CYP27A1 high expression group and CYP27A1 low expression group regarding the age, gender and the serum ALT level of hepatocarcina

7、patients. Patients with higher expression of CYP27A1 turned out to have better PRMS classification, tumor size, tumor type, TNM staging, BCLC staging, CLIP staging and serum AFP level (P<0.0001, P=0.003, P=0.071, P=0.01, P=0.007, P=0.004 and P=0.009, respectively), and patients in CYP27A1 high ex

8、pression group proved to have better progression free survival and overall survival compared with patients in CYP low expression group. Our GSEA results suggested that CYP27A1 might influence the proliferation of hepatocarcinoma through participating the mitotic spindle, spermatogenesis, G2M checkpo

9、int, DNA repair, E2F target, MYC target, PI3K-AKT-mTOR signaling and unfolded protein response. Conclusions: CYP27A1 might be an independent prognostic factor for hepatocarcinoma patients, and patients with higher expression of CYP27A1were proved to have better survival than patients with lower expr

10、ession of CYP27A1, while the exact mechanisms regarding the impact of CYP27A1 on the hepatocarcinoma cells remained to be elucidated.Keywords: hepatocarcinoma; CYP27A1; clinical phenotype; prognosis原發(fā)性肝胞癌（primary liver cancer）是起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤。肝癌是當(dāng)前最為常見的惡性腫瘤之一 1-2，盡管近年來隨著治療策略的改善，肝癌患者的臨床治療效果有所提高，但總

11、體來說肝癌患者的臨床預(yù)后仍然較差 3,4。有研究報道，線粒體膽固醇27-羥化酶（CYP27A1）位于染色體3q33，包括9個外顯子，是一種多功能細(xì)胞色素P450羥化酶。 CYP27A1蛋白是一類單加氧酶，催化多種涉及藥物代謝、類固醇及其他脂類合成，CYP27A1在膽固醇的代謝平衡中起著重要作用，同時CYP27A1也被稱為維生素D3羥化酶。CYP27A1表達(dá)于肝臟和許多肝外組織，如腎臟、肺、巨噬細(xì)胞、腦組織、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚以及前列腺等；CYP27A1參與了許多膽固醇代謝平衡的生物過程，如膽汁酸的生物合成、膽固醇前驅(qū)物的形成以及膽固醇的轉(zhuǎn)運 5-9。有研究報道，由CYP27A1和其他酶催化的維

12、生素D3活性結(jié)構(gòu)對多種腫瘤細(xì)胞有明顯抗腫瘤和誘導(dǎo)分化作用。因此，有研究認(rèn)為CYP27A1可能作用抗腫瘤治療藥物靶點。此外有研究報道，多種激素能夠調(diào)節(jié)肝癌HepG2細(xì)胞中CYP27A1的表達(dá)。然而，目前關(guān)于CYP27A1與肝癌患者的臨床預(yù)后研究尚未見報道，本研究通過在GEO數(shù)據(jù)庫中下載肝癌患者和相應(yīng)的正常對照人群的肝組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，分析CYP27A1表達(dá)與肝癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。1材料與方法1.1材料 GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫是由NCBI建立的一個基因表達(dá)資源庫。截至2016年11月，該數(shù)據(jù)庫共儲存了4348個數(shù)據(jù)集，共1996317個基因表達(dá)樣本。肝癌

13、基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE14520，包含GPL571和GPL3921兩個平臺共488個正常肝組織和肝癌組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)，同時該數(shù)據(jù)集附帶有大量相關(guān)的肝癌患者臨床數(shù)據(jù)。因此本研究以GSE14520為分析主體，分析CYP27A1基因表達(dá)與肝癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。1.2方法下載經(jīng)審編和校對后的GSE1452010,11基因表達(dá)矩陣，根據(jù)該矩陣中CYP27A1基因（203979_at）的表達(dá)值的中位數(shù)，將該數(shù)據(jù)集中的肝癌臨床樣本分為CYP27A1高表達(dá)組和CYP27A1低表達(dá)組。以該分組為依據(jù)，分析CYP27A1與肝癌患者臨床表型的相關(guān)性。同時使用由博德研究所開發(fā)的GSEA 2.2.3軟件進(jìn)行GSEA分析

14、（gene set enrichment analysis），以hallmark基因集為參考基因集，置換次數(shù)為1000次，以P<0.05、FDR（false discovery rates）<0.25作為顯著性富集基因集篩選依據(jù)，通過GSEA，分析CYP27A1對肝癌患者臨床預(yù)后可能的作用機(jī)制。1.3統(tǒng)計方法使用兩獨立樣本T檢驗分析正常肝組織對照組和肝癌組CYP27A1表達(dá)差異，CYP27A1表達(dá)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差展現(xiàn)，使用卡方檢驗分析CYP27A1高表達(dá)組和CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者臨床表型差異情況，使用log-rank法對CYP27A1高表達(dá)組和CYP27A1低表達(dá)

15、組肝癌患者進(jìn)行生存分析。所有統(tǒng)計分析采用IBM SPSS 21.0完成，P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的判別依據(jù)。采用GraphPad 5.0作為繪圖工具。2結(jié)果2.1 CYP27A1在正常肝組織和肝癌組織中的表達(dá)情況。 GSE14520（GPL3921）共包含220例正常肝組織樣本，225例肝癌組織樣本，如圖1所示，正常肝組織中CYP27A1的表達(dá)明顯高于肝癌組織（9.557 ± 0.0237 VS 8.619 ± 0.07622, P<0.001）。圖1 正常肝組織和肝癌組織中CYP27A1表達(dá)情況2.2 CYP27A1表達(dá)與肝癌患者臨床表型相關(guān)性分析為

16、了進(jìn)一步探討CYP27A1表達(dá)對肝癌的發(fā)病、進(jìn)展的作用機(jī)制，我們分析了肝癌患者的性別、年齡、PRMS（predicted risk metastasis signature）分類、血清AKT水平、腫瘤大小、結(jié)節(jié)數(shù)目、肝硬化、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期以及血清AFP水平在CYP27A1高表達(dá)組和CYP27A1低表達(dá)組中的分布差異。如表1所示，CYP27A1高表達(dá)組和CYP27A1低表達(dá)組患者在年齡和性別分布上無明顯差異。兩組肝癌患者血清ALT水平及肝硬化情況無明顯差異，CYP27A1高表達(dá)組患者中PRMS分類低的患者數(shù)目明顯高于CYP27A1低表達(dá)組（P<0.0001），CYP

17、27A1高表達(dá)組的中腫瘤組織小于5cm的患者數(shù)明顯高于CYPA1低表達(dá)組（P=0.003），CYP27A1高表達(dá)組中患者腫瘤類型為單結(jié)節(jié)的肝癌患者數(shù)目有高于CYP27A1低表達(dá)組的趨勢（P=0.071），CYP 27A1高表達(dá)組肝癌患者的TNM分期、BCLC分期、CLIP分期、均明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者（相應(yīng)的P值分別為0.01、0.007及0.004），CYP27A1高表達(dá)組肝癌患者中AFP水平低于200 ng/ml患者數(shù)目明顯高于CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者。表1 CYP27A1基因表達(dá)與肝癌患者各臨床表型的關(guān)系臨床表型樣本量(n)CYP27A1卡方值P值高表達(dá)組(n=11

18、2)低表達(dá)組(n=113)性別 女3017130.6600.417 男1919398年齡(歲) 5515277750.1520.696 55693336PRMS分類 低114833149.9680.0001 高1072780ALT(U/L) 5013065650.0060.936 50914546腫瘤大小（cm） 514080608.890.003 5802951結(jié)節(jié)數(shù)目 單結(jié)節(jié)17693833.2530.071 多結(jié)節(jié)451728肝硬化 是2031031000.9290.335 否18711TNM分期 9352419.30.01 774235 491534BCLC分期 0/A期2092767

19、.1860.007 B/C期1481734CLIP分期 0期9960398.4170.004 1-5期745043AFP（ng/ml） 20011868506.7280.009 2001004060注：本文中臨床表型指肝癌患者的性別、年齡、PRMS分類、血清ALT水平、腫瘤大小、結(jié)節(jié)數(shù)目、肝硬化情況、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期、血清AFP水平2.3 CYP27A1對肝癌患者預(yù)后的影響為了進(jìn)一步明確CYP27A1與肝癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的關(guān)系，我們分析了GSE14520數(shù)據(jù)集中CYP27A1高表達(dá)組（n=112）和CYP27A1低表達(dá)組（n=113）患者無進(jìn)展生存期和總生存期

20、，如圖2A所示CYP27A1高表達(dá)組肝癌患者無進(jìn)展生存期明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)組（Log-rank P=0.023）。另一方面，如圖2B所示CYP27A1高表達(dá)組肝癌患者總生存期明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者（P=0.005）。以上結(jié)果提示CYP27A1高表達(dá)肝癌患者的臨床預(yù)后明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者。2.4 基于CYP27A1低表達(dá)的GSEA分析為了推測CYP27A1影響肝癌患者臨床預(yù)后可能的作用機(jī)制，我們以hallmark基因集為參考基因集，對CYP27A1進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果如表2所示，CYP27A1低表達(dá)組主要富集了有絲分裂紡錘體、精子發(fā)生、G2M檢查點、

21、DNA修復(fù)、E2F基因相關(guān)分子、MYC基因相關(guān)分子、PI3K_AKT_mTOR信號通路以及去折疊蛋白反應(yīng)，提示CYP27A1可能通過以上生物學(xué)過程促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，影響肝癌患者臨床以后。表2 GSEA分析CYP27A1低表達(dá)樣本富集基因集基因集富集分?jǐn)?shù)校正富集分?jǐn)?shù)P值錯誤發(fā)現(xiàn)率HALLMARK_MITOTIC_SPINDLE0.6153841.72346100.170068HALLMARK_SPERMATOGENESIS0.505821.6588960.0080970.175832HALLMARK_G2M_CHECKPOINT0.7305071.6404220.0019720.141426HA

22、LLMARK_DNA_REPAIR0.5250111.5887450.0230330.173313HALLMARK_E2F_TARGETS0.7700151.5831250.0078740.144518HALLMARK_MYC_TARGETS_V10.6306761.5713360.0256410.130406HALLMARK_PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING0.4059961.5251090.0196080.171762HALLMARK_UNFOLDED_PROTEIN_RESPONSE0.5022221.5185370.0525290.1613843討論如前所述，由于化療耐藥

23、等導(dǎo)致肝癌患者治療失敗的多種原因，目前肝癌患者臨床預(yù)后極差，因此，亟待開發(fā)新的靶向治療藥物，本研究提示，CYP27A1在的表達(dá)在肝癌組織相較于正常組織中表達(dá)明顯下調(diào)，CYP27A1高表達(dá)組肝癌患者在腫瘤大小、血清AFP水平、結(jié)節(jié)數(shù)目、PRMS分類、TNM分期、BCLC分期以及CLIP分期明顯優(yōu)于CYP27A低表達(dá)組肝癌患者，同時CYP27A1高表達(dá)肝癌患者的無進(jìn)展生存期和總生存期亦明顯優(yōu)于CYP27A1低表達(dá)組肝癌患者。提示CYP27A1表達(dá)水平可能是肝癌患者獨立預(yù)后因素，CYP27A1可能作為肝癌患者靶向治療的作用靶點。CYP27A1除了參與膽汁酸的生物合成、膽固醇轉(zhuǎn)運及維生素D3的代謝外，

24、另有研究報道CYP27A1在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、Norlin等報道JNK/c-jun參與了雄激素介導(dǎo)的上調(diào)CYP27A1作用12。Tokar等報道，在前列腺癌中，維生素D3通過上調(diào)CYP27A1基因的表達(dá)以抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和浸潤13。另有多篇研究報道，巨噬細(xì)胞通過高表達(dá)CYP27A1基因抑制體內(nèi)動脈粥樣斑塊形成14,15。CYP27A1基因突變使固醇27-羥化酶活性減低或喪失，使體內(nèi)的膽固醇不能有效的轉(zhuǎn)化為膽汁酸，引起膽固醇及膽甾烷醇在體內(nèi)異常聚集，從而導(dǎo)致腦腱黃瘤病的發(fā)生16。Nelson等和Mast等研究表達(dá)CYP27A1人乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，CYP27A1可能是靶向治療乳腺癌的

25、靶點，下調(diào)CYP27A1基因的表達(dá)或CYP27A1基因的使用能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮治療乳腺癌作用17,18。我們基于CPY27A1低表達(dá)的GSEA分析表明CYP27A1可能通過參與細(xì)胞有絲分裂、DNA修復(fù)、E2F信號通路、MYC信號通路、PI3K_AKT_mTOR信號通路以及去折疊蛋白反應(yīng)等生物學(xué)過程參與肝癌的發(fā)生和進(jìn)展?？梢奀YP27A1在不同組織、不同疾病中發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用，基于CYP27A1對肝癌患者作用的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1. 張文君,陳燕,潘勐,陳曉鵬. 原發(fā)性肝癌合并癌栓的研究進(jìn)展J. 中國普通外科雜志,2015,07:1017-1021.2. Pi

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