第 12 章核酸與核苷類藥物

1、第 12 章 核酸與核苷類藥物1998年4月，大連珍奧核酸科技發(fā)展有限公司在大連開(kāi)發(fā)區(qū)建成一期工程。珍奧核酸說(shuō)明書(shū)摘錄 增強(qiáng)基因自我修復(fù)能力，顯著改善腦機(jī)能，促進(jìn)新陳代謝及細(xì)胞分裂，提高免疫力，美容養(yǎng)顏潤(rùn)膚。核酸具有抗病毒，抑腫瘤，抗衰老，健腦益智的功效。在臨床實(shí)驗(yàn)中，令醫(yī)學(xué)界十分驚奇的是：在糖尿病及并發(fā)癥，肝臟疾病，高脂血癥，腦血栓后遺癥等心腦血管疾病，老年癡呆癥，肢體震顫麻痹（帕金森氏?。P(guān)節(jié)炎，白細(xì)胞減少癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，性功能減退，肝腎受損等諸多方面，核酸都顯現(xiàn)出獨(dú)特的保健功效。方舟子：“核酸營(yíng)養(yǎng)是個(gè)商業(yè)大騙局”中國(guó)“人類基因組計(jì)劃”項(xiàng)目負(fù)責(zé)人楊煥明：“所謂核酸食品在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上和米粉

2、沒(méi)有太大的差別”州理工學(xué)院院長(zhǎng)戴維·巴爾的摩（1975年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）：“據(jù)我所知，沒(méi)有證據(jù)表明核酸是一種營(yíng)養(yǎng)物或有益健康。在我看來(lái)它不可能有任何益處?！钡谝还?jié) 概述一、基本概念核酸與核苷類藥物是指具有藥用價(jià)值的核酸、核苷酸、核苷或者堿基天然的、類似物、衍生物及其聚合物作用：影響生物的蛋白質(zhì)合成和脂肪、糖類的代謝恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝用途：放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮、腫瘤、病毒病 核酸是一種多聚體大分子，它的組成單元是核苷酸，將核苷酸中的磷酸基團(tuán)去掉，剩余部分稱核苷，核苷進(jìn)一步分解可生成戊糖和堿基。嘌呤核苷酸 AMP GMP嘧啶核苷酸

3、的結(jié)構(gòu)核酸類藥物分類具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+) 、CoII(NADP+) 。這類藥物有助于改善物質(zhì)代謝和能量平衡，修復(fù)受損組織，促使缺氧組織恢復(fù)正常生理機(jī)能。臨床上廣泛用于放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮等的治療。這些藥物多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質(zhì)，在具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小，它們的生產(chǎn)基本上都可以經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動(dòng)脈或冠狀動(dòng)脈硬化、肝炎等的治療或輔助治療。肌苷：用于急慢性肝炎、肝硬化、白細(xì)胞減少、血小板減少等。核酸類

4、藥物分類自然結(jié)構(gòu)核酸類物質(zhì)的類似物和聚合物它們是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨床藥物。主要有疊氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。它們大部分通過(guò)由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)進(jìn)行半合成為結(jié)構(gòu)改造物，或者采用化學(xué)一酶合成法。二、核苷酸的生產(chǎn)方法（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸1、酶解法制備脫氧核苷酸: 桔青霉產(chǎn)生5-磷酸二脂酶; 紅酵母產(chǎn)生3-磷酸二脂酶2、酶解法制備戊糖核苷酸 我國(guó)從60年代開(kāi)始使用核酸酶P1降解核糖核酸生產(chǎn)單核苷酸，日本年產(chǎn)呈味核苷酸（肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產(chǎn)的。酶解法生產(chǎn)5單核苷酸工藝流程3、雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和

5、鳥(niǎo)苷酸（IG）呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥(niǎo)苷酸鈉，商品名簡(jiǎn)稱為（IG），用核酸酶Pl降解RNA可獲得GMP和AMP，其中AMP經(jīng)脫氨生成IMP。雙酶法生產(chǎn)（I十G）工藝 。4菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸磷酸二酯酶在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生5-核苷酸。在國(guó)內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法生產(chǎn)5-核苷酸。（1）菌體自溶法生產(chǎn)核莆酸工藝流程：5堿水解法生產(chǎn)2，3-混合核苷酸 RNA結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵對(duì)于堿性條件不穩(wěn)定，很容易生成2，3-環(huán)狀磷酸酯，此環(huán)狀磷酸酯對(duì)堿更不穩(wěn)定，很易加水分解生成2，3-混合核苷酸。取RNA配成33.5%的水溶液，加氫氧化鈉達(dá)0.3molL濃度，升溫至38，保溫1620小

6、時(shí)，用6molL鹽酸中和至pH7.0，從RNA水解成2，3-核苷酸的降解率達(dá)95以上，將2，3-混合核苷酸制成每片含50100mg的片劑，經(jīng)臨床使用，對(duì)非特異性血小板減少癥、對(duì)白血球減少（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸1發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMP）2、發(fā)酵生產(chǎn)黃苷酸（XMP）及酶法轉(zhuǎn)化成鳥(niǎo)苷酸（三）半合成法制備核苷酸 由于發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高，核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化，從核苷生成5-核苷酸收率可達(dá)90%。 例一：肌苷2mmolL懸浮于5ml磷酸三乙酯中，溫度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmolL，反應(yīng)2h，5-IMP摩爾產(chǎn)率達(dá)91。 例二：鳥(niǎo)苷

7、2mmolL懸浮于5ml磷酸三甲酯中，溫度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmo/L，反應(yīng)6h，5-GMP摩爾產(chǎn)率達(dá)90%。第二節(jié) 核酸類物質(zhì)的生產(chǎn)一、RNA的提取與制備1. RNA的工業(yè)來(lái)源從微生物中提取RNA，是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法，一些最常見(jiàn)的菌體含有豐富的核酸資源。通常在細(xì)菌中RNA占5-25，在酵母中占2.715，在霉菌中占0.7%28%, 面包酵母含RNA4.17.2。 2. 高RNA含量酵母菌體的篩選酵母菌體收率高，易于提取RNA 。可以從自然界篩選并可用誘變育種的方法提高酵母的RNA含量。 發(fā)酵法生產(chǎn)高含量RNA酵母及其RNA提取工藝流程見(jiàn)圖2.RNA提取實(shí)例二、DN

8、A的提取與制備DNA，可以促進(jìn)細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)新陳代謝，延緩機(jī)體衰老，維護(hù)正常免疫功能有積極的作用。1工業(yè)用DNA的提取從冷凍魚(yú)精中提取。魚(yú)精中主要含有核蛋白、酶類以及多種微量元素。核蛋白的主要成分是脫氧核糖核酸(DNA)和堿性蛋白質(zhì)(魚(yú)精蛋白)，其中DNA 占大約23。2具有生物活性DNA的制備可從動(dòng)物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）中提取制備，操作條件03。動(dòng)物內(nèi)臟加4倍量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎1分鐘，勻漿于2500rpm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗滌后離心，將沉淀懸浮于20倍量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5十二烷基磺酸鈉，并攪拌23小時(shí)，在0 2500rpm離

9、心，在上層液中加入等體積的冷乙醇，離心即可得纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。三、核苷類藥物的制備核苷是多種核苷類藥物的原料，這些藥物通常是生物自身能夠合成的組成遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物，目前已用于臨床的此類藥物有幾十種另外，核苷的發(fā)酵法生產(chǎn)水平大大高于同類結(jié)構(gòu)核苷酸的發(fā)酵水平，因此肌苷酸鈉，鳥(niǎo)苷酸鈉可分別由肌苷和鳥(niǎo)苷經(jīng)化學(xué)磷酸化方法合成，ATP由腺苷酯法合成。發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域中的杰出成果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。用發(fā)酵法生產(chǎn)各種核苷的菌株有著許多共同特點(diǎn)：它們都使用磷酸單酯酶活力很強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿菌為誘變出發(fā)菌株；它們都是通過(guò)使用

10、物理或化學(xué)誘變方法選育出在遺傳性狀上具有特定標(biāo)記的誘變菌；它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)時(shí)必須提供限量的生長(zhǎng)因素，并且好氧，在某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。在右邊的合成途徑中，嘌呤核苷酸生物合成的第一個(gè)酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶受AMP、ADP、以及腺嘌呤衍生物的強(qiáng)烈抑制而受鳥(niǎo)嘌呤衍生物的抑制很弱。IMP脫氫酶受最終產(chǎn)物GMP及鳥(niǎo)嘌呤衍生物反饋抑制，SAMP合成酶受AMP反饋抑制的。枯草桿菌的腺嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量腺嘌呤時(shí)就累積肌苷。而枯草桿菌的腺嘌呤、黃嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量鳥(niǎo)嘌呤時(shí)就累積腺苷。ADPAMPGMPGTPGDPSAMPIMPXMPAMP脫氨酶IMP脫氫酶GMP還原酶SAMP合成酶PR

11、PPAICARSAICARPRPPATPSAMP裂解酶GMP合成酶 生產(chǎn)菌株：（1）酶6、7缺失（為腺嘌呤缺陷型）積累IMP-肌 苷（肝炎輔助藥）；（2）酶4缺失（為鳥(niǎo)嘌呤缺陷型）積累XMP-黃苷；（3）酶5缺失積累鳥(niǎo)苷。對(duì)5 -IMP的生物合成來(lái)說(shuō)，關(guān)鍵的酶是PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶，利用 產(chǎn)氨短桿菌直接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸的關(guān)鍵：使用腺嘌呤缺陷型菌株。提供亞適量腺嘌呤從而解除了對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活性影響。選育Mn2+不敏感性變異株菌本身的5 ' -核苷酸降解酶活力低（一）發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（I或Iou）肌苷生產(chǎn)菌（AJ11102）遺傳性狀：腺嘌呤缺陷型（A-）；GMP還原酶缺失（GMPred-）

12、；磺胺脒抗性（SGr）；精氨酸缺陷型（Arg-）。選育出從遺傳上解除正常代謝控制的理想菌株。肌苷產(chǎn)率達(dá)20g/L.發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（1）肌苷生產(chǎn)工藝（2）發(fā)酵工藝條件：碳源為葡萄糖保證充足的氮源磷酸鹽的影響Mg+、Ca+有促進(jìn)作用生長(zhǎng)因子腺嘌呤或酵母粉要亞適量最適發(fā)酵溫度為30-34，pH6.06.2需大風(fēng)量,高溶氧和低CO2（二）聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C）1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1967年美國(guó)人Field發(fā)現(xiàn)聚肌胞是干擾素誘導(dǎo)物，而且具有廣譜抗病毒作用。本品是人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。本品可溶于0.85氯化鈉溶液。2、生產(chǎn)工藝70年代中期我國(guó)開(kāi)始研制聚肌胞，其生產(chǎn)工藝如下： 1）底物5-核苷二磷酸吡啶鹽的制備2）固定化多核苷酸磷酸化酶的制備（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，將分離純化的酶液滴加入冰浴中的載體，得到共價(jià)結(jié)合的固定化多核苷酸磷酸化。3）Poly I：C制備（1）底物預(yù)處理：CDP吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，IDP轉(zhuǎn)成鈉鹽。（2）酶促反應(yīng)： （每毫升反應(yīng)液含molL數(shù)）IDP或 CDP 15；Tris 150；M