凝膠層析法測(cè)蛋白質(zhì)分子量

1、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定凝膠層析法一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解凝膠層析的原理及其應(yīng)用。2. 通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，初步掌握凝膠層析技術(shù)。3. 了解洗脫曲線、選擇曲線的意義，并學(xué)會(huì)繪制洗脫曲線、選擇曲線。二、 實(shí)驗(yàn)原理（一） 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)是生命過(guò)程中最重要的物質(zhì)之一 , 近年來(lái)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)1 。分子量是蛋白質(zhì)的主要特征參數(shù)之一, 當(dāng)發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)時(shí), 首先應(yīng)準(zhǔn)確測(cè)定其分子量。蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法有多種, 如滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠層析法及聚丙烯酰胺凝膠電泳等2-4。（二） 凝膠層析法層析法，又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），在1903-

2、1906年由俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett首先提出。雖然近年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)日益成熟,靈敏度、精確度也為各種方法之首，但是目前在實(shí)驗(yàn)室中測(cè)量蛋白質(zhì)分子量應(yīng)用比較廣泛的還是凝膠層析等方法5。 凝膠層析法（gel filtration），又叫凝膠過(guò)濾法、凝膠滲透色譜法 (GPC )、排阻色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法(GFC)、分子篩層析法（molecular sieve chromatography）等6，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。 凝膠本身是一種分子篩，可以把分子按不同大小進(jìn)行分離，如同過(guò)篩可以把大顆粒與小顆粒分開一樣。但這種“過(guò)篩”與普通的過(guò)篩不一樣。將凝膠顆粒在適宜的溶劑中浸泡，使充

3、分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。 由于其分離條件溫和、 樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性高、設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，是目前最廣泛使用的生化物質(zhì)的分離方法之一，是所有色譜技術(shù)中最簡(jiǎn)單、條件最溫和的方法，且完全是基于樣品的分子量大小來(lái)進(jìn)行分離的。 雖然其分離效果不及高效液相色譜，但可作為一種初步的分離手段使下一步的純化達(dá)到更好的效果7。（三） 凝膠 凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，其內(nèi)部具有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀

4、結(jié)構(gòu)。常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝膠是葡聚糖（dextran，商品名為SePhadex），凝膠型號(hào)不同，孔隙度不同，但都不溶于水。 這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離物質(zhì)分子的大小有相應(yīng)的數(shù)量級(jí)。在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只有相應(yīng)的小分子可以通過(guò)，適于分離小分子物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大，適于分離大分子物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。（四） 測(cè)量方法 凝膠過(guò)濾層析, 是一種分離不同大小分子的分配層析, 被分離物質(zhì)的分子在溶劑和限定孔徑的凝膠固定相中被分配, 混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)層析柱時(shí), 各種物質(zhì)同時(shí)

5、進(jìn)行著垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng), 混合物中各物質(zhì)因相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同而被分離, 這種方法操作簡(jiǎn)便, 費(fèi)用較低, 重復(fù)性好8。因其能像篩子一樣篩分不同大小的分子，因此又稱為“分子篩”。其具有許多良好的性能，因此在蛋白質(zhì)的分離分析中被廣泛采用。經(jīng)過(guò)不少人的實(shí)際應(yīng)用和完善，該方法已經(jīng)變成一種可靠的測(cè)定高分子分子量的方法9。 將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt（total volume）表示。Vt由三部分組成，即Vt=Vo+Vi+Vg。Vo稱為“孔隙體積”或“外體積”（outer volume）又稱“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相當(dāng)于一般層析法中柱內(nèi)

6、流動(dòng)相的體積；Vi為內(nèi)體積（inner volume），又稱“內(nèi)水體積”，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積，相當(dāng)于一般層析法中的固定相的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水后的重量求得；Vg為凝膠本身的體積。而洗脫體積（Ve，elution Volume）與Vo及Vi之間的關(guān)系為： Ve=Vo+KdViVe是自加入樣品時(shí)起，到組分最大濃度（峰）出現(xiàn)時(shí)所流出的體積；本實(shí)驗(yàn)?zāi)z層析柱中填充的是交聯(lián)葡聚糖，含有蛋白的溶液通過(guò)管柱時(shí)，大分子的蛋白呈正態(tài)分布連續(xù)首先流出，會(huì)形成一個(gè)蛋白峰10。Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說(shuō)Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)，只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝

7、膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)無(wú)關(guān)。Kd可通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得： Kd=（Ve- Vo）/Vi 上式中Ve為實(shí)際測(cè)得的洗脫體積；Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（帶顏色為佳，便于觀察，如血紅蛋白、印度黑墨水等，分子量約200萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖-2000等）通過(guò)實(shí)際測(cè)量求出；Vi可由gWR求得（g為干凝膠重，單位為克；WR為凝膠的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，對(duì)一層析柱凝膠床來(lái)說(shuō)，只要通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知某一物質(zhì)的洗脫體積Ve，就可算出它的Kd值。三、實(shí)驗(yàn)器材1試劑 （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：藍(lán)色葡聚糖-2000（200KD），牛血清清蛋白（67KD），胰凝乳蛋白酶原（24.5KD），CytC（13

8、.7KD），均為分析純。 （2）洗脫液：0.2mol/L Tris-HCl-KCl,pH7.5 取0.5M KCl 20ml,0.2M Tris 25ml,0.1M HCl40.3ml,再加H2O定容至100ml （3）Sephadex G-75 2.器材 （1）層析柱：柱管1.250cm （2）紫外分光光度計(jì) （3）部分收集器（4） 刻度試管四、實(shí)驗(yàn)步驟1.凝膠的選擇與處理：本實(shí)驗(yàn)使用Sephadex G-75凝膠。商品凝膠一般是干燥的顆粒，使用前需在欲使用的洗脫液中充分溶脹。即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫至近沸，一般12h即可完成11。根據(jù)層析柱的體積和所選用的凝膠，膨脹后

9、床體積計(jì)算所需凝膠干粉的重量，然后傾入過(guò)量的洗脫液中，室溫吸水膨脹。凝膠顆粒最好大小均勻，這樣流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。2.裝柱：本實(shí)驗(yàn)所用層析柱的規(guī)格為1.250cm。（1）將層析柱垂直裝好，在柱內(nèi)先注入1/41/5的水，出口處接上一根長(zhǎng)約1.5m，直徑2細(xì)塑管，塑管另一端固定在柱的上端約45處。然后打開機(jī)器，排出氣泡。（2）隨著下面水的流出，上面不斷加凝膠，使形成的凝膠床面上有凝膠的連續(xù)下降。（3）當(dāng)凝膠沉積到柱的頂端約6處，可停止裝柱。 （4）用眼睛觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有否“紋路”或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。3.加樣：加樣之前先吸去柱管內(nèi)的上清液，然后加樣。等到所加的樣與凝膠界面相

10、平時(shí)，連接恒壓瓶、層析柱、部分收集器等裝置。4.洗脫：待上述工作做好之后，開始洗脫。洗脫時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制流速，以34分鐘收集3ml液體為宜。然后用部分收集器按每管3mL收集洗脫流出液，各收集管于280nm處檢測(cè)A280值。 5.洗脫曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 （1）按上述步驟依次加入藍(lán)色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清清蛋白（67KD）、胰凝乳蛋白酶原（24.5KD）和CytC（13.7KD），然后用50 mmol/l的KH2PO4-K2HPO4緩沖液溶液洗脫。待上一個(gè)樣品在管柱中行進(jìn)約1/3時(shí)再加下一個(gè)樣。用部分收集器收集流出液體，然后用紫外分光光度計(jì)于280nm處測(cè)定每管A值，以管號(hào)或者洗脫體

11、積為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪出洗脫曲線。 根據(jù)洗脫峰位置量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve。然后以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)（1gM）為橫坐標(biāo)，Ve為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了結(jié)果可靠，應(yīng)以同樣條件重復(fù)1-2次，取Ve的平均值作圖。五、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 洗脫曲線：本實(shí)驗(yàn)共依次加入4種分子量已知的蛋白質(zhì)，分別為A:藍(lán)色葡聚糖-2000（200KD）、B:牛血清清蛋白（67KD）、C:胰凝乳蛋白酶原（24.5KD）和D:CytC（13.7KD）。每34分鐘收集3ml液體為一管，共收集了25管，每管在280nm處測(cè)得的吸光度值A(chǔ)值（即OD值）見表1：表1：每管洗脫液對(duì)應(yīng)的OD值管號(hào)12345OD值0.020.0370

12、.0410.3180.14管號(hào)678910OD值0.0360.0060.3260.0890.053管號(hào)1112131415OD值0.0190.0240.060.2860.344管號(hào)1617181920OD值0.220.0780.0310.0240.105管號(hào)2122232425OD值0.1840.1340.0910.0470.023因此，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制的洗脫曲線見圖1：由表1算得4種樣品的洗脫體積分別為:Ve(A:藍(lán)色葡聚糖)=(3+0.5)3=10.5mlVe(B:牛血清清蛋白）=(8-3-0.5)3=13.5mlVe(C:胰凝乳蛋白酶原）=(15-7-0.5)3=22.

13、5mlVe(D:CytC)=(21-11-0.5)3=28.5ml2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)（1gM）為橫坐標(biāo)，Ve為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2:各樣品洗脫體積和lgM值樣品MlgMVeA2000005.301 10.5B670004.826 13.5C245004.351 22.5D137003.876 28.5圖1：加入的4種分子量已知的蛋白質(zhì)的洗脫曲線，由上圖可知：分別在第4、8、15和21管時(shí)出現(xiàn)峰值。圖2：加入的4種分子量已知的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線六、 分析討論蛋白質(zhì)是生命過(guò)程中最重要的物質(zhì)之一 , 早已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。而分子量是蛋白質(zhì)的主要特征參數(shù)之一,故準(zhǔn)確測(cè)定

14、其分子量意義重大。凝膠層析法在蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方面，雖然不及聚丙烯酰氨凝膠電泳的靈敏度及準(zhǔn)確度高，但因其操作簡(jiǎn)便、試劑價(jià)格較為便宜等優(yōu)勢(shì)而受到人們歡迎。影響分子量測(cè)定準(zhǔn)確性的因素眾多，有一定的局限性。如緩沖液的pH值、凝膠的型號(hào)、加樣時(shí)間間隔、順序，以及收集洗脫液的操作等等都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。緩沖液的pH值在6-8時(shí)，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較為良好，本實(shí)驗(yàn)所用的緩沖液的pH值為7.5，在該范圍之內(nèi)，故在其他操作良好的情況下所得的線性較為良好。凝膠的型號(hào)對(duì)分離的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。比如Sephadex G-100 和Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱, 前者可在前期去除相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜蛋

15、白，而后者的分離范圍只有1000-30000。我們的目標(biāo)蛋白相對(duì)分子 質(zhì)量在10000-200000左右, 故用Sephadex G-100或者Sephadex G-75 可得到較好的分辨率。 加樣時(shí)間間隔、順序?qū)Y(jié)果準(zhǔn)確性的影響。本實(shí)驗(yàn)采取加入單一樣品的方法，按分子量由大到小加入，并且待上一個(gè)樣品基本上快要走出柱管時(shí)才加下一個(gè)樣。分子量大的樣品不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，在凝膠顆粒之間的縫隙流出，因此速度最快。從大到小加樣，可以保證前一個(gè)樣品基本上被分離出來(lái)，確保了會(huì)出現(xiàn)峰值，能得出較為準(zhǔn)確的洗脫體積。 分光光度計(jì)使用波長(zhǎng)為280nm時(shí)，是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，260nm是核酸最高吸收峰

16、的吸收波長(zhǎng)。故本實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量使用280nm。七、 注意事項(xiàng)1. 加樣時(shí)按分子量由大到小加入，以便于出現(xiàn)峰值和計(jì)算洗脫體積。2. 洗脫液的pH值應(yīng)在6-8得范圍內(nèi)，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的良好線性。3. 加樣之前應(yīng)趕出管柱內(nèi)的氣泡，并在整個(gè)操作過(guò)程中都要保證不產(chǎn)生氣泡，否則洗脫速度很慢并且結(jié)果也不準(zhǔn)確。4. 收集洗脫液的速度應(yīng)嚴(yán)格控制在每34分鐘收集一管液體（約3m）。5. 分光光度計(jì)使用波長(zhǎng)為280nm。6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，及時(shí)清洗整理實(shí)驗(yàn)用品，經(jīng)指導(dǎo)老師同意后才能離開實(shí)驗(yàn)室。參考文獻(xiàn)：1 石磊， 季怡萍，蛋白質(zhì)分子量測(cè)定過(guò)程中的酸效應(yīng)J.分析化學(xué)，2002（8）：9389412孔毅，吳梧桐，吳

17、如金，蛋白質(zhì)分子量測(cè)定方法比較研究J.分析儀器，2003（2）：44463王雅, 蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的研究J.實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2005(4):58594 王玉賢, 相玉紅, 強(qiáng)洪, 儀器法測(cè)定蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究J.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2006(6):31325 Fenn JB,Mann M, Meng CK, Wong SF,Whitehouse CM，Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomoleculesJ. Science, 1 989,246( 4926)：64716黃明智，明膠化學(xué)基礎(chǔ)講座凝膠層析法J.明膠科學(xué)與技術(shù)，1982（3）：1481547于志鵬，趙文