蛋白質相互作用組學分析技術

1、 為探究生物進程的分子機制，需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用。研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：一、酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子，啟動報道 基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化后則可用于大 規(guī)模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。Angermayr等設計了一個SOS蛋白介 導的雙雜交系統(tǒng)?？梢匝芯磕?/p>

2、蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統(tǒng)的功能。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。二、噬茵體展示技術在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體 特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用于研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混 合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優(yōu)點。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文 庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子

3、。三、等離子共振技術表 面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當待測蛋白與誘餌蛋白結合后，薄 膜的共振性質會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優(yōu)點是不需標記物或染料，反應過程可實時監(jiān)控。測定快速且安全，還可用于檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。四、熒光能量轉移技術熒 光共振能量轉移（FRET ）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋

4、白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態(tài)性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比 值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于GFP 的供體受體對。五、抗體與蛋白質陣列技術 蛋 白芯片技術的出現(xiàn)給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗 體芯片就是一個非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術上已經日益成熟。這些抗體芯片有的

5、已經在向臨床應用上發(fā)展，比如腫瘤標志物抗體 芯片等，還有很多已經應用再眼就的各個領域里。六、免疫共沉淀技術 免 疫共沉淀主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于 Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：“目的蛋白興趣蛋白抗興 趣蛋白抗體SPA|Pansobin”，因為SPA|Pansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物 四組分又被分開。然后經Western blotting法，用抗體

6、檢測目的蛋白是什么，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白 可信度高。但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇 最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。七、pull-down技術 蛋 白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉淀（Co-IP） 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或