液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC_MS)的各種模式探索

1、下載可編輯實驗七液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （ LC-MS ）的各種模式探索093858張亞輝一、實驗?zāi)康?、了解 LC-MS 的主要構(gòu)造和基本原理 ；2、學(xué)習(xí) LC-MS 的基本操作方法 ；3、掌握 LC-MS 的六種操作模式的特點及應(yīng)用。二、實驗原理1、液質(zhì)基本原理及模式介紹液 相 色 譜 - 質(zhì) 譜 法 （ LiquidChromatography/MassSpectrometry，LC-MS）將應(yīng)用范圍極廣的分離方法 液相色譜法與靈敏 、專屬、能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法結(jié)合起來，必然成為一種重要的現(xiàn)代分離分析技術(shù)。但是，LC 是液相分離技術(shù) ，而 MS 是在真空條件下工作的方法，因

2、而難以相互匹配 。 LC-MS 經(jīng)過了約30 年的發(fā)展 ，直至采用了大氣壓離子化技術(shù)（ Atmosphericpressure ionization ， API）之后，才發(fā)展成為可常規(guī)應(yīng)用的重要分離分析方法 ?，F(xiàn)在 ，在生物 、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等各個領(lǐng)域中均得到了廣泛的應(yīng)用 ，在組合化學(xué) 、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究工作中， LC-MS已經(jīng)成為最重要研究方法之一。質(zhì)譜儀作為整套儀器中最重要的部分，其常規(guī)分析模式有全掃描模式（ Scan）、選擇離子監(jiān)測模式 （SIM）。.專業(yè) .整理 .下載可編輯（一）全掃描模式方式 （ Scan）：最常用的掃描方式之一，掃描的質(zhì)量范圍覆蓋被測化合物的分子

3、離子和碎片離子的質(zhì)量，得到的是化合物的全譜，可以用來進(jìn)行譜庫檢索，一般用于未知化合物的定性分析。實例 ：（ Q1=100-259m/z ）（二）選擇離子監(jiān)測模式 （SelectiveIon Monitoring，SIM ）：不是連續(xù)掃描某一質(zhì)量范圍 ，而是跳躍式地掃描某幾個選定的質(zhì)量，得到的不是化合物的全譜 。 主要用于目標(biāo)化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析。實例：（ Q1 = 259m/z）本實驗采用三重四極桿質(zhì)譜儀（ Q1 ：質(zhì)量分析器 ； Q2 ：碰撞活化室 ；Q3：質(zhì)量分析器 ），由于多了 Q2 、Q3 的存在，在分析測試的模式上又多了四種選擇：（三）子離子掃描模式 （ Produ

4、ct Scan）：第一個質(zhì)量分析器固定掃描電壓，選擇某一質(zhì)量離子 （母離子 ）進(jìn)入碰撞室 ，發(fā)生碰撞解離產(chǎn)生碎片離子，第二個質(zhì)量分析器進(jìn)行全掃描，得到的所有碎片離子都是由選定的母離子產(chǎn)生的子離子 ，沒有其它的干擾。主要用于化合物結(jié)構(gòu)分析。實例：（ Q1=259m/z ；Q3 = 100-259m/z ）（四）母離子掃描模式 （Precursor Scan）：第一個質(zhì)量分析器掃描電壓選擇母離子 （如分子離子 ），進(jìn)入碰撞室碰裂后 ，第二個質(zhì)量分析器固定掃描電壓，只選擇某一特征離子質(zhì)量 ，該特征離子是由所選擇的母離子產(chǎn)生的，由此得到所有能產(chǎn)生該子離子的母離子譜 。 主要用于同系物的分析 。 實例：

5、（ Q1= 100-300m/z ；Q3 = 259m/z）（五）中性丟失掃描模式（ Neutral Loss）：第一個質(zhì)量分析器掃描所有.專業(yè) .整理 .下載可編輯離子，所有離子進(jìn)入碰撞室碎裂后，第二個質(zhì)量分析器以與第一個質(zhì)量分析器相差固定質(zhì)量聯(lián)動掃描，檢測丟失該固定質(zhì)量中性碎片（如質(zhì)量數(shù)15 、 18、45 ）的離子對 ，得到中性碎片譜 。 主要用于中性碎片的分析。實例：（ Q1 =100-300m/z ； Q3 = 82-282m/z）（六）多反應(yīng)監(jiān)測模式（ MRM ）： 第一個質(zhì)量分析器選擇一個（或多個）特征離子 ，經(jīng)過碰撞解離 ，到達(dá)第二個質(zhì)量分析器再進(jìn)行選擇離子檢測，只有符合特定條

6、件的離子才能被檢測到，因為是兩次選擇 ，比單四極質(zhì)量分析器的 SIM 方式選擇性 、排除干擾能力 、專屬性更強 ，信噪比更高 。主要用于定量分析 。 實例：（ Q1 = 259m/z；Q3 = 138m/z）2、實驗內(nèi)容簡介鄰苯二甲酸酯 (簡稱 PAEs)是一類重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，常被用作塑料的增塑劑 ，也可用作農(nóng)藥載體 。 近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品的廣泛使用，鄰苯二甲酸酯不斷進(jìn)入環(huán)境，普遍存在于土壤 、底泥、大氣、水體和生物體等環(huán)境樣品中 ，成為環(huán)境中無所不在的污染物。據(jù)報道，鄰苯二甲酸酯類具有較弱的環(huán)境雌激素成分，具有影響生物體內(nèi)分泌和導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖的作用。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指能

7、改變機體內(nèi)分泌功能，并對機體 、后代或（亞）種群產(chǎn)生有害效應(yīng)的環(huán)境物質(zhì)。由于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對人和動物有種種不良影響，對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究已成為國際關(guān)注的焦點。我國也正在逐漸重視有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究。三、儀器與試劑1、儀器液相系統(tǒng) ： Varian Pro Star ；.專業(yè) .整理 .下載可編輯自動進(jìn)樣器 ：Varian 410 自動進(jìn)樣器 ；質(zhì)譜儀：Varian 310 LC-MS/MS三重四極桿質(zhì)譜儀 （ESI離子源）；色譜柱：Varian Inertsil 3 ODS-3（150mm2mm，3m）。2、試劑甲醇：HPLC 色譜純；超純水：Millipore Express超純

8、水系統(tǒng)制備 ；標(biāo)準(zhǔn)溶液 ：用甲醇配制鄰苯二甲酸二甲酯(DMP) 、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯 (DBP)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 （ 0.1ppm ）。四、實驗步驟1、條件設(shè)置色譜 條件 ： 流動 相（ 100% 甲 醇） ；流速（ 0.2ml/min ）； 掃描 時間（ 7min ）；離子源模式 ：電噴霧電離 （ ESI），正離子模式 ；掃描條件 ： Detector ： 1000V ； Needle ： 5000V ； Shield ： 600V ； SprayChamber Temperature： 50 ；Nebulizing Gas Pressure： 55psi ；Dryin

9、g GasPressure ： 18psi ， Drying Gas Temperature( ) ：250 ， CapilaryVoltage30(V)， Coll.Energy 30(v) ；質(zhì)量分析器 ：三重四極桿 ；進(jìn)樣體積 ： 10ul 。2、實驗測定按實驗操作規(guī)程完成儀器開機、參數(shù)設(shè)置及測定 。.專業(yè) .整理 .下載可編輯根據(jù)表 1 中的數(shù)據(jù) ，設(shè)置 m/z ，選擇各種掃描模式 （全掃描、選擇離子掃描、子離子掃描 、母離子掃描 、多反應(yīng)監(jiān)測模式 ）進(jìn)行測定 。表 1 待測物質(zhì)的母離子和主要子離子母離子（ m/z ）子離子（ m/z ）五 .數(shù)據(jù)處理1. 全掃描模式方式 （ Scan

10、）DMPDEPDBP195.1223.1279.1163.1149.1149.1.專業(yè) .整理 .下載可編輯從圖中可以看出 ，各峰沒有很好的分開，峰形也過寬 。一方面是由于色譜柱壞掉了，另一方面色譜流動相為100% 甲醇，極性變小 ，峰流出時間變快 ，導(dǎo)致沒有很好的分開 。該表為理論推測出的質(zhì)荷比DMPDEPDBP加 H+（m/z ）195223279加 Na+（m/z ）217245301由該表可知 ,上圖中出現(xiàn)的 217 為 DEP 加 Na 后的質(zhì)荷比 ， 301 為 DBP 加 Na 后的質(zhì)荷比 。對于全掃描 ，掃描范圍要包括所有離子的質(zhì)量數(shù)。質(zhì)荷比最小為195 ，故下限設(shè)定為 100

11、，若太低則信號很弱 ；上限設(shè)定到 350，因為 DBP 加 Na+ 質(zhì)荷比是301，在此基礎(chǔ)上加 50，設(shè)定 350.2.選擇離子監(jiān)測模式 （Selective Ion Monitoring，SIM ）.專業(yè) .整理 .下載可編輯從全掃描模式方式 （ Scan）知道有質(zhì)荷比223、 279 、195 的離子出現(xiàn) ，故圖2、3、4 分別為選定質(zhì)荷比223 、279 、195 得到的色譜圖 ，該圖可用于目標(biāo)化合物檢測及定量分析3.子離子掃描模式 （Product Scan ）.專業(yè) .整理 .下載可編輯選定質(zhì)荷比為 223 的母離子 ，得到由其產(chǎn)生的質(zhì)荷比為149 、 177 的子離子 。1）下面

12、為 223 的母離子變成 177 的子離子可能的反應(yīng)過程：OOOOHOOOO.專業(yè) .整理 .下載可編輯2）下面為 223 的母離子變成 149 的子離子可能的反應(yīng)過程：OOOOO4.母離子掃描模式 （Precursor Scan ）由圖可知質(zhì)荷比為149 的子離子不僅是由質(zhì)荷比為223 的母離子產(chǎn)生的 ，而且是由質(zhì)荷比為 279 的母離子產(chǎn)生的 。.專業(yè) .整理 .下載可編輯下面為 279 的母離子變成 149 的子離子可能的反應(yīng)過程：OHOCC4H9OOC4H9OHCOO5.多反應(yīng)監(jiān)測模式 （MRM ）.專業(yè) .整理 .下載可編輯由于質(zhì)荷比為149 的子離子也可能是由質(zhì)荷比為279 的母離

13、子產(chǎn)生的 ，而質(zhì)荷比為 177 的子離子只可能是由質(zhì)荷比為223 的母離子產(chǎn)生的 。 故先選擇質(zhì)荷比223 的特征離子 ，再選擇質(zhì)荷比177 的特征離子 ，這樣經(jīng)過兩次選擇 ，比單四極質(zhì)量分析器的SIM 方式選擇性 、排除干擾能力 、專屬性更強 ，信噪比更高 。比較這五組圖的信噪比可以看出，全掃描的信噪比最弱為18 ，而 MRM 的信噪比最強，為 5990 ，是全掃描的 300 多倍 。五、思考題1、比較各模式的測定結(jié)果 ，討論各模式在測定中的作用。全掃描模式方式一般用于未知化合物的定性分析選擇離子監(jiān)測模式主要用于目標(biāo)化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析子離子掃描模式主要用于化合物結(jié)構(gòu)分析母離子掃描模式主要用于同系物的分析中性丟失掃描模式主要用于中性碎片的分析多反應(yīng)監(jiān)測模式主要用于定量分析。2、結(jié)合 HPLC 等其它色譜分析技術(shù)及實驗，討論 LC-MS 的優(yōu)勢及在社會中所能起到的作用 。LC-MS 把液相色譜和質(zhì)譜法的優(yōu)勢合二為一，具有靈敏度高 ，分析速度快，圖譜解析簡單等