當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后P57kip2蛋白表達(dá)的影響

1、當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后P57kip2蛋白表達(dá)的影響    作者：馮金彩 張端蓮 李培安    【摘要】 目的：觀察當(dāng)歸對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞內(nèi)P57kip2蛋白表達(dá)的影響，探討當(dāng)歸抗心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)理。方法:將35只SD大鼠隨機(jī)分成4組:正常對(duì)照組(n=5)；假手術(shù)組(n =10)；缺血再灌注組(n=10)；當(dāng)歸治療組(n=10) ,建立在體心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)完畢后，將各組動(dòng)物心肌組織做免疫組織化學(xué)染色，觀察各組動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)P57kip2蛋白表達(dá)的變化。利用HPIAS?20

2、00圖像分析系統(tǒng)測(cè)定P57kip2蛋白在以上各組中表達(dá)的平均光密度和平均陽(yáng)性面積率。結(jié)果：正常對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)P57kip2蛋白表達(dá)強(qiáng)，當(dāng)歸治療組心肌細(xì)胞內(nèi)P57kip2蛋白表達(dá)強(qiáng)，假手術(shù)組心肌細(xì)胞內(nèi)P57kip2蛋白表達(dá)較強(qiáng)，缺血再灌注損傷組P57kip2蛋白表達(dá)弱。圖像分析結(jié)果顯示：正常對(duì)照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間P57kip2蛋白的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0 05)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的增殖起著重要

3、的作用。    【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸注射液； 缺血再灌注； 心??； P57kip2蛋白 心肌缺血再灌注損傷( ischemia reperfusion injury, IRI )在急性心肌梗死再灌注治療的病理生理過(guò)程中起著重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。趙明中等1研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注可減少心肌缺血細(xì)胞凋亡,同時(shí)也能加速受損心肌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，且凋亡細(xì)胞主要位于心肌纖維收縮帶區(qū)域內(nèi)和心肌梗死區(qū)周?chē)?。心肌缺血再灌注后心肌?xì)胞凋亡隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增多。近年來(lái)凋亡機(jī)制參與心肌缺血再灌注損傷成為臨床研究的熱點(diǎn)。 

4、;   目前在研究藥物治療心肌缺血方面還沒(méi)有任何一種藥物能絕對(duì)減少心肌梗死,對(duì)抗心肌缺血。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性溫，能補(bǔ)血和血,調(diào)經(jīng)止痛,潤(rùn)燥滑腸。有文獻(xiàn)報(bào)道2, 當(dāng)歸對(duì)冠心病患者應(yīng)用當(dāng)歸注射液治療能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性ST?T 的變化, 是治療冠心病的有效藥物3。    P57kip2是細(xì)胞周期素依賴(lài)蛋白激酶抑制因子（CKI）中新發(fā)現(xiàn)的重要因子4，它能結(jié)合Cyclin?CDK復(fù)合物，抑制細(xì)胞

5、從G1期到S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是一種新型的腫瘤抑制基因5。    本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察當(dāng)歸注射液對(duì)缺血/ 再灌注過(guò)程心肌的保護(hù)作用,研究當(dāng)歸注射液抗心肌缺血/ 再灌注損傷的作用機(jī)理，旨在指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用當(dāng)歸治療心血管疾病,開(kāi)辟當(dāng)歸在體外循環(huán)手術(shù)前和術(shù)中應(yīng)用的新途徑。 1 材料與方法 1.1 動(dòng)物模型制備及分組    選用健康雄性Wistar大鼠（SPF級(jí)）35只,體重250300g左右。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg?(100 g)-1 ,麻醉動(dòng)物后行氣管切開(kāi)接微型呼吸機(jī)人工呼吸呼吸頻率6

6、0 次?min-1 ,潮氣量2ml?(100g) -1,沿胸骨左緣第4肋骨開(kāi)胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎/ 開(kāi)放左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動(dòng)物隨機(jī)分成4組: 正常對(duì)照組（不做任何處理）；假手術(shù)組（絲線(xiàn)穿過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎）；缺血再灌注損傷組(IR)（ 缺血/ 再灌注前靜脈注射生理鹽水0.8ml / kg，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45min ,再灌注120 min ）；當(dāng)歸注射液預(yù)處理組（在結(jié)扎前20min，靜脈注射當(dāng)歸注射液0.8ml/ kg , 其它處理同缺血/ 再灌注組）。 1.2 主要試劑    25%當(dāng)歸注射液(武漢大學(xué)

7、中南醫(yī)院制藥廠)；即用型兔抗鼠P57kip2單克隆抗體、即用型S?P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒及多聚賴(lài)氨酸（以上試劑均購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司）。 1.3 方法 1.3.1 常規(guī)HE染色 1.3.2 免疫組織化學(xué)S?P法檢測(cè)P57kip2相關(guān)抗原 主要步驟：5m組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，P57kip2采用高壓抗原修復(fù)，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4 孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白?過(guò)氧化物酶復(fù)合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透

8、明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，人乳腺癌作為P57kip2的陽(yáng)性對(duì)照組。 1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷    P57kip2以細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS?1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對(duì)P57kip2抗原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  

9、;  對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。 2 結(jié)果    2.1 HE染色    正常對(duì)照組：可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞界限清晰，結(jié)構(gòu)正常；假手術(shù)組：可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，但可見(jiàn)部分胞漿溶解，結(jié)構(gòu)基本上正常；缺血再灌注損傷組：可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，胞漿溶解呈空泡或網(wǎng)狀，細(xì)胞界限模糊，可見(jiàn)心肌細(xì)胞斷裂；當(dāng)歸治療組：可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，細(xì)胞核呈橢圓形位于中央，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本

10、正常。 2.2 P57kip2蛋白的表達(dá)    正常對(duì)照組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積，P57kip2蛋白表達(dá)強(qiáng)；假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，P57kip2蛋白表達(dá)較強(qiáng)；缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，P57kip2蛋白表達(dá)弱；當(dāng)歸治療組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積，P57kip2蛋白表達(dá)強(qiáng)。圖像分析結(jié)果見(jiàn)表1，經(jīng)單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P0.05)。經(jīng)q檢驗(yàn)，正常對(duì)照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間P57kip2蛋白的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對(duì)照

11、組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間P57kip2蛋白的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0 05)。    表1 當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后各組P57kip2蛋白表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（略） 注：*    正常對(duì)照組、假手術(shù)組、當(dāng)歸治療組與缺血再灌注損傷組比較，P0.001；# 當(dāng)歸治療組、假手術(shù)組與正常對(duì)照組比較，P0.05。    3 討論    細(xì)胞凋亡(apop tosis)是細(xì)胞死亡形

12、式之一,是有核細(xì)胞在一定條件下啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制,通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生自然死亡的過(guò)程。越來(lái)越多研究表明,心肌缺血/再灌注( I/R)損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。    當(dāng)歸含有阿魏酸、多種磷脂、人體必需氨基酸和微量元素等。目前已證明,當(dāng)歸對(duì)心血管系統(tǒng)、血液造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的藥理作用。在心血管疾病中,經(jīng)常發(fā)生缺血再灌注損傷,其機(jī)制可能是多因素的,但主要有3個(gè)環(huán)節(jié)，即能量代謝失常、鈣超載和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注損傷的直接原因6 。缺血再灌注過(guò)程中,機(jī)體可通過(guò)多種途經(jīng)產(chǎn)生氧自由基,氧自由基與生

13、物膜發(fā)生一系列反應(yīng),可破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、損傷心肌細(xì)胞膜, 產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷慨念以來(lái)，已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程。目前雖然對(duì)缺血或缺血再灌注損傷的確切機(jī)制還不十分清楚,但已經(jīng)知道損傷的臨床結(jié)局主要就是細(xì)胞死亡。已經(jīng)證實(shí),人類(lèi)心肌梗死除細(xì)胞壞死外,細(xì)胞凋亡也參與了梗死的病理過(guò)程,細(xì)胞凋亡不僅影響梗死面積,而且促成心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu),心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡現(xiàn)象79。缺血再灌注損傷對(duì)心肌組織的結(jié)構(gòu)

14、和功能的影響一直是研究的重點(diǎn)之一。    P57kip2對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有著極其重要的調(diào)控作用，主要通過(guò)抑制CDKs復(fù)合物和PCNA功能來(lái)實(shí)現(xiàn)其作用，一方面P57kip2蛋白通過(guò)其氨基末端形成二聚體后，與cyclinE?CDK2、cyclinA?CDK2和cyclinD?CDK2等G1期和S期激酶復(fù)合物結(jié)合，抑制其對(duì)Rb蛋白的磷酸化，E2F不能釋放而使細(xì)胞不能通過(guò)G1期10；另一方面,抑制CDK2 Thr160磷酸化而抑制CDK2的激活，還可通過(guò)羧基端與PCNA的結(jié)合，抑制細(xì)胞的增生11。P57kip2蛋白參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控，并與細(xì)胞凋亡有關(guān)。P57k

15、ip2陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞絕大部分為終末期分化的細(xì)胞，這說(shuō)明P57kip2在細(xì)胞分化過(guò)程中作用于細(xì)胞周期。P57kip2負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增生的生物學(xué)功能提示它可能具有腫瘤抑制作用，而成為一個(gè)候選抑癌基因。Nijjar等人在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，G0期或細(xì)胞周期中端粒酶地活性或無(wú)活性時(shí)，P57kip2蛋白有大量聚集，而當(dāng)細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)時(shí)則發(fā)現(xiàn)P57kip2蛋白明顯減少甚至消失12。以上研究表明P57kip2表達(dá)的下調(diào)與腫瘤的細(xì)胞增殖進(jìn)展有關(guān)。    本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察當(dāng)歸注射液對(duì)缺血/ 再灌注過(guò)程心肌組織中P57kip2蛋白的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照組、當(dāng)歸

16、治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間P57kip2蛋白的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0 05)。以往的相關(guān)研究顯示，P57kip2蛋白的表達(dá)水平受到多種因素的調(diào)控, 如泛素化降解、抗增殖信號(hào)因子、細(xì)胞因子及接觸抑制等15。Ioannis S. Pateras 等人16在對(duì)70例非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，P57kip2mRNA和P57kip2蛋白有明顯的相關(guān)性，提示P57kip2蛋白的表達(dá)可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)；啟動(dòng)子的甲基化是P57kip2mRNA水平降低的

17、主要原因；腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Skp2也促進(jìn)P57kip2蛋白的降解。Zhuo Chen等人17的研究表明TGF?能通過(guò)作用于P57kip2啟動(dòng)子附近的一段高度保守區(qū)域而顯著上調(diào)P57kip2 mRNA和P57kip2蛋白水平，而對(duì)KIP家族中的另兩個(gè)成員P21和P27卻無(wú)此作用。    缺血再灌注損傷本身是個(gè)多因素協(xié)同的過(guò)程,缺血再灌注組織發(fā)生細(xì)胞凋亡的機(jī)制也是一個(gè)多因素的過(guò)程,心肌細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡有著一些共同的始動(dòng)因素,如氧自由基、鈣離子超載、細(xì)胞因子的釋放、中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)等既可以引起細(xì)胞凋亡,也可以引起細(xì)胞壞死，無(wú)疑通過(guò)各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)抗細(xì)胞凋亡必然也會(huì)

18、對(duì)抗細(xì)胞的壞死起一定的作用。現(xiàn)在對(duì)心肌缺血再灌注引起細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚未闡明,對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡的治療也大多處于動(dòng)物試驗(yàn)階段。特別是基因治療離臨床應(yīng)用還有一段距離。    從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論來(lái)分析當(dāng)歸注射液為防治缺血再灌注損傷的應(yīng)用具有重要的研究意義，并且為加強(qiáng)心肌保護(hù)作用提供了重要的理論依據(jù)。 【參考文獻(xiàn)】 1 趙明中,陳運(yùn)貞. 大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化及意義. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2000,20(1):5255.2 魏蕾,歐陽(yáng)靜萍,王雄,等. 當(dāng)歸對(duì)高分子右旋糖酐誘導(dǎo)人紅細(xì)胞聚集性增強(qiáng)的影響. 微循環(huán)學(xué)雜志,2001 ,11 (1

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