實驗三 瓊脂糖凝膠電泳

1、實驗二、瓊脂糖凝膠電泳實驗二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分子克隆的核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA片段。凝膠中DNA的位置可以用低濃度的熒光插入染料染色直接觀察。1、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法的原理和方法2、檢測質(zhì)粒、檢測質(zhì)粒DNA的純度、濃度和分子量的純度、濃度和分子量一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康膌 瓊脂糖瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，4545開始形成多孔性開始形成多孔性剛性濾孔，剛性濾孔，凝膠孔徑凝膠孔徑的大小決定于的大小決定于瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度。l DNADNA分子分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)

2、電荷，在外加電場作用下向正極泳動。在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNADNA分分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)與與分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。不同。不同DNADNA，其分，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離瓊脂糖凝膠電泳法分離DNADNA，主要是利用，主要是利用分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。量的對數(shù)值成反比關(guān)系。l 溴化乙錠溴化乙錠(EB)(EB)為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。為

3、扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EBEB可與可與DNADNA分分子形成子形成EB-DNAEB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EBEB發(fā)射的熒光強度發(fā)射的熒光強度大大1010倍以上，且熒光強度與倍以上，且熒光強度與DNADNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 5 ngng以上的以上的DNADNA。（GoldviewIGoldviewI的原理可能類似）的原理可能類似）l 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA有環(huán)狀有環(huán)狀超螺旋超螺旋、開環(huán)開環(huán)、和、和線性線性三種構(gòu)型，電泳時其遷移率各不三種構(gòu)型，電泳時其遷移率各不同同( (超螺旋超

4、螺旋 線性線性 開環(huán)開環(huán)) )。二、實驗原理二、實驗原理不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍1、0.8%：500bp-15kb2、1.0%：250bp-12kb3、 1.2%：150bp-6kb4、 1.5%： 80bp-4kb注意：高電壓影響凝膠的分離范圍，使分辨率下降！注意：高電壓影響凝膠的分離范圍，使分辨率下降！上次實驗提取的質(zhì)粒上次實驗提取的質(zhì)粒 pSK（3 kb） 和和MP3MP3 （6 kb） 三、實驗材料三、實驗材料關(guān)于質(zhì)粒大小在電泳中的鑒定：關(guān)于質(zhì)粒大小在電泳中的鑒定：酶切后線性化條帶電泳時所處的位置指示質(zhì)粒的大小。該質(zhì)粒載體用的是該質(zhì)粒載體用的是pUC的復(fù)

5、制子，拷的復(fù)制子，拷貝數(shù)能達到貝數(shù)能達到500-700個。個。四、儀器設(shè)備四、儀器設(shè)備五、實驗用具五、實驗用具微波爐微波爐 電泳儀電泳儀 微型電泳槽微型電泳槽 紫外透射檢測儀紫外透射檢測儀 凝膠成像儀凝膠成像儀移液器移液器 吸管頭若干吸管頭若干 加樣板加樣板量筒量筒100 ml 1 三角瓶三角瓶500 ml 1六、試劑六、試劑瓊脂糖 5TBE電泳緩沖液 10 載樣緩沖液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色劑 （10000 ） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA marker）：Marker III10 載樣緩沖液載樣緩沖液：10 mM EDTA，0.25%溴酚藍，50%蔗糖

6、 七、實驗步驟七、實驗步驟（一（一）制膠）制膠（1% 1% agarose gelagarose gel）（二（二）點樣）點樣（三（三）電泳）電泳（四）觀察（四）觀察1、稱取稱取1 g瓊脂糖加入盛有瓊脂糖加入盛有100 ml 0.5 TBE電泳緩沖液的電泳緩沖液的250 ml三角瓶中，三角瓶中，搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。在微波爐上加熱至瓊脂糖完全溶搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。在微波爐上加熱至瓊脂糖完全溶解，放在天平上加蒸餾水至原重量。冷卻到約解，放在天平上加蒸餾水至原重量。冷卻到約60后，加入后，加入10 l的的Goldview I，并搖勻。，并搖勻。2、將溶解的瓊脂糖將溶解的瓊

7、脂糖（約約50）倒入倒入制膠模具中制膠模具中，直至厚度為，直至厚度為4-6 mm，插插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，在室溫下冷卻凝固。入適當(dāng)?shù)氖嶙?，在室溫下冷卻凝固。3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。將凝膠置入電充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。將凝膠置入電泳槽中，加泳槽中，加0.5 TBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2 mm。（一（一）制膠）制膠（二）點樣（二）點樣 用微量取液器用微量取液器（P20）吸取吸取質(zhì)粒質(zhì)粒DNA樣品樣品2 l于點樣板小孔中，再加入于點樣板小孔中，再加入8 l TE及及1 l的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔，藍色樣品混

8、合物將沉的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。同時點入點樣孔下部。同時點5 l Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5 V/cm，可見到溴酚藍條帶由負(fù)極向正極移動，約一小時后即可觀察。（三）電泳（三）電泳（四）觀察（四）觀察將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到綠色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)和熒光強度，可粗略估計該樣品DNA的濃度。同時根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。1、用微波爐煮膠時，膠液的量不應(yīng)超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。2、煮好的膠應(yīng)冷卻至

9、50左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機會。3、倒膠注意厚度(4-6 mm)，充分凝固后充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10分鐘，以加速膠的凝固。4、加樣前趕走點樣孔中的氣泡，點樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。5、一般情況下不必每點一個樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液（正極）洗幾次即可再點下一個樣品。6、 凝膠中含有GoldViewI，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應(yīng)集中處理，勿亂丟。注意事項注意事項常用電泳緩沖液配方常用電泳緩沖液配方TAE是Tris-乙酸，緩沖容量小，但是溶解度大，易于儲存；TBE是Tris-硼酸，緩沖容量大，但是溶解度

10、小，不易長期儲存，易產(chǎn)生沉淀；分離大片段最好用TAE，小片段用TBE； TBE存在硼離子，會對一些酶的活性稍有影響。TAE和和TBE的主要區(qū)別的主要區(qū)別有的有的10 loading buffer中多了一樣中多了一樣SDS（1%），它會使酶類（如），它會使酶類（如Taq酶和限酶和限制性內(nèi)切酶）變性，有終止酶促反應(yīng)的作用。但在電泳時（以制性內(nèi)切酶）變性，有終止酶促反應(yīng)的作用。但在電泳時（以PCR產(chǎn)物為產(chǎn)物為例），在電泳泳道上會產(chǎn)生一片彌散，如果電泳跑的距離短，和多出來一例），在電泳泳道上會產(chǎn)生一片彌散，如果電泳跑的距離短，和多出來一條帶沒有什么區(qū)別（大概條帶沒有什么區(qū)別（大概1000 bp左右）。

11、不加左右）。不加SDS的凝膠加樣緩沖液只有的凝膠加樣緩沖液只有電泳指示劑和沉淀樣品的作用。電泳指示劑和沉淀樣品的作用。常用常用6凝膠加樣緩沖液配方凝膠加樣緩沖液配方Loading buffer的功能：的功能：第一、指示劑溴酚藍和二甲苯青起到指示的作用，顯示電泳的進程，以第一、指示劑溴酚藍和二甲苯青起到指示的作用，顯示電泳的進程，以便我們適時終止電泳；便我們適時終止電泳；第二、甘油或者蔗糖可以加大樣品密度，使樣品密度大于第二、甘油或者蔗糖可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE或或TBE，從，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。另外，有的另外，有的Buff

12、er是加有是加有SDS的，一般都會寫明。的，一般都會寫明。SDS主要是促使聚合酶變主要是促使聚合酶變性，因為沒有除盡的聚合酶會結(jié)合在性，因為沒有除盡的聚合酶會結(jié)合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。雙鏈上影響它的遷移速率。前沿指示劑溴酚藍溶液在酸性條件下為黃色，堿性條件下為藍色。因為前沿指示劑溴酚藍溶液在酸性條件下為黃色，堿性條件下為藍色。因為提取的核酸一般都是溶解在堿性的提取的核酸一般都是溶解在堿性的TE緩沖液里，所以與緩沖液里，所以與loading buffer混混合后變?yōu)樗{色。合后變?yōu)樗{色。Marker跟跟DNA用一樣的上樣緩沖液，跑出來的結(jié)果才好，如果用一樣的上樣緩沖液，跑出來的結(jié)果才好，

13、如果marker預(yù)預(yù)先混合了上樣緩沖液，先混合了上樣緩沖液，DNA樣品的上樣緩沖液還是盡可能找跟樣品的上樣緩沖液還是盡可能找跟marker預(yù)預(yù)混的上樣緩沖液一致?；斓纳蠘泳彌_液一致。EDTA 是螯合劑，可以螯合鈣和鎂等金屬離子，能夠使金屬依賴型核酸酶失是螯合劑，可以螯合鈣和鎂等金屬離子，能夠使金屬依賴型核酸酶失活，從而防止活，從而防止DNA和和RNA降解。降解。PCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物電泳一般用一般用6loading buffer就可以；就可以；酶切產(chǎn)物電泳和回收酶切產(chǎn)物電泳和回收一般用一般用10loading buffer以減少上樣體積。以減少上樣體積。在紫外照射透視下，與雙鏈在紫外照射透視下，與

14、雙鏈DNA 結(jié)合的結(jié)合的 吖啶橙呈現(xiàn)綠色吖啶橙呈現(xiàn)綠色熒光，而結(jié)合熒光，而結(jié)合RNA或單鏈或單鏈DNA 的吖啶橙則呈現(xiàn)紅色熒光。的吖啶橙則呈現(xiàn)紅色熒光。不同波長的紫外光不同波長的紫外光短波紫外光：短波紫外光：254nm中波紫外光：中波紫外光：302nm長波紫外光：長波紫外光：365nm1、為什么分光光度計測定的濃度很高，但電泳檢測濃度卻很低？、為什么分光光度計測定的濃度很高，但電泳檢測濃度卻很低？第一次電泳第一次電泳 第二次電泳第二次電泳第一次電泳第一次電泳 第二次電泳第二次電泳2011年結(jié)果年結(jié)果GoldViewI GoldViewII Plasmid DNA Line 1, -DNA Ec

15、oR I/Hind Marker; Line 2, PUC18 (2686bp); Line 3, EcoR I digestion of PUC18; Line 4, Cambia3301 (11220bp); Line 5, EcoR I digestion of Cambia3301 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA三種構(gòu)型三種構(gòu)型：環(huán)狀超螺旋、開環(huán)和線性。質(zhì)粒電泳三條帶質(zhì)粒電泳三條帶：超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即2個沒有復(fù)制完全的質(zhì)粒連在了一起）。同一種酶切后電泳譜帶的規(guī)律：同一種酶切后電泳譜帶的規(guī)律：從高分子量到低分子量條帶亮度逐漸減弱從高分子量到低分子量條帶亮度逐漸減弱由于由于DNA Marker與

16、酶切產(chǎn)物所含成分不同，因此遷移率不一定相同！與酶切產(chǎn)物所含成分不同，因此遷移率不一定相同！質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果的分析質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果的分析注意：如何判斷單酶切是否完全？注意：如何判斷單酶切是否完全？ 如何判斷雙酶切是否完全？如何判斷雙酶切是否完全？ 注意：同樣的注意：同樣的marker點在不同的膠孔中，電泳遷移率有差異。因為電泳點在不同的膠孔中，電泳遷移率有差異。因為電泳時有邊緣效應(yīng)，邊上的跑得快；跑膠時間長了會發(fā)熱，整快膠受熱不均時有邊緣效應(yīng)，邊上的跑得快；跑膠時間長了會發(fā)熱，整快膠受熱不均時也會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。時也會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。l但因為抽提質(zhì)粒時各人的操作差異,造成CCC/OC/L等多種構(gòu)型，

17、條帶多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三條：超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體。l如果RNaseA添加過少或者質(zhì)量不高，會導(dǎo)致RNA降解不完全，會有一條遠(yuǎn)離點樣孔跑的最快的殘余RNA條帶；根據(jù)RNA降解程度不同，條帶亮度會有很大差異。l提取過程中加溶液震蕩劇烈會導(dǎo)致基因組片段斷裂成很小的片段，因此質(zhì)粒中含有基因組的短片段會導(dǎo)致一些電泳條帶的出現(xiàn)。l還有電泳時間的長短造成各條帶的移動距離也不一，一般較難判斷是對是錯。電泳跑的時間較短，盡管能分出大小，但習(xí)慣上跑開點對分辨差別不大的條帶有好處，短膠容易出現(xiàn)誤判。堿裂解法抽提質(zhì)粒電泳會出現(xiàn)幾條帶？堿裂解法抽提質(zhì)粒電泳會出現(xiàn)幾條帶？1、對于反復(fù)使用的瓊脂糖凝膠，DNA的電泳效果有所降低，如要獲得最佳的電泳圖片，請使用新配置的凝膠和電泳緩沖液。2、膠厚度不宜超過0.5cm，膠太厚會影響檢測的靈敏度。3、加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復(fù)融化可能會對核酸檢測的靈敏度產(chǎn)生一定影響。4、電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。5、必須保證瓊脂糖充分完全熔解，否則，會造成電泳圖像模糊不清。6、電