蛋白電泳及Western blot

1、蛋白電泳及Western blot：一、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1. 按電泳槽說(shuō)明書(shū)安裝玻璃板2.根據(jù)玻璃板凝膠模具的體積確定需配制凝膠的量，再分別按上表（摘自TAKARA目錄附錄部分）配制分離膠和濃縮膠溶液。3.將分離前膠丙烯酰胺溶液灌至兩塊玻璃板中間的間隙中，給濃縮膠留出足夠空間(梳齒長(zhǎng)再加1 cm)。在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層雙蒸水。將凝膠垂直放置于室溫下。4.待聚合完成(30 min)，倒掉覆蓋水層，可用干凈濾紙小心吸干殘存的水層，將配制好的濃縮膠溶液直接灌至聚合好的分離膠上，立即在其中插入梳齒，注意不要混入氣泡，將凝膠垂直放置于室溫下。（配制好的凝膠可在4冰箱中放置備用）5. 將蛋白樣

2、品與等體積的2×蛋白上樣緩沖液混勻后沸水浴5 min，12, 000 r/min離心1 min，離心后取上清點(diǎn)樣到SDS聚丙烯酰胺凝膠，連接電源后電泳，濃縮膠時(shí)用8 V/cm電壓，待染料前沿進(jìn)入分離膠后將電壓提高到15 V/cm繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)染料到達(dá)分離膠的底部，關(guān)掉電源。取出凝膠，準(zhǔn)備染色。二、SDS聚丙烯酰胺凝膠的染色1. 配制好考馬斯亮藍(lán)R-250染液，將膠做好記號(hào)區(qū)別正反面放入染液中，在搖床慢搖1 h左右。2. 移出并回收染液以備后用，將凝膠浸泡于脫色液中，平緩搖動(dòng)4-8小時(shí)，其間應(yīng)更換脫色液三四次。試劑配方：摘自TAKARA目錄附錄三、Western印跡1將蛋白質(zhì)樣品

3、進(jìn)行SDS-PAGE，待溴酚藍(lán)跑出膠后（一般80V濃縮膠，120V 分離膠）停止電泳?；蜾宸铀{(lán)跑至底部邊緣時(shí)停止電泳；2剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號(hào)。切除含溴酚藍(lán)凝膠；3載手套剪2張定性濾紙和一張PVDF(NC)膜，它們的大小應(yīng)與凝膠的大小相同（略大）。在膜的一（左）角作一記號(hào)（或剪角），與濾紙和海綿（纖維）墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸濕即可；4. 次序：負(fù)極（黑孔板）> 纖維墊->13張濾紙->凝膠->PVDF（NC）膜->1-3張濾紙->纖維墊->正極板（白孔板）>扣上吊扣>插進(jìn)預(yù)先注入轉(zhuǎn)移液的轉(zhuǎn)膜槽中。（各層間不得有氣泡） 按

4、上示意圖，接上電源（凝膠一邊接負(fù)極，PVDF（NC）膜一邊接正極）（200 mA， 1h； 150 mA，2 h； 26 V過(guò)夜； 4）轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)你目的蛋白大小和經(jīng)驗(yàn)來(lái)定。 關(guān)閉電源，將膜取出，用水洗3次，置塑料平板中用1 ml麗春紅S染色約5分鐘（至清楚看到條帶），去掉麗春紅S，用鉛筆標(biāo)記蛋白Marker條帶的位置，然后用蒸餾水洗去背景染料顏色；6. 將膜放入塑料平板中，加入封閉液（量根據(jù)所用的容量而定，以很好的蓋住膜為準(zhǔn)），置脫色搖床中緩慢搖動(dòng)，室溫1小時(shí)；7棄去封閉液，用適量封閉液按照一抗的說(shuō)明稀釋一抗，將膜放入含一抗的封閉液中，室溫平緩搖動(dòng)溫育1-2小時(shí)。然后盡量回收抗體溶液，- 2

5、0 保存，可重復(fù)使用。 用TBST室溫洗膜3次，每次用20 mL TBST，每次10 min；8. 同樣將用封閉液稀釋好的二抗加入加入容量中，每張膜約510 mL, 室溫?fù)u1小時(shí)；9. 盡量回收二抗，20ºC保存或不用回收；10. 將膜用TBST洗3次，每次用20mL TBST，每次10min.（可直接用TBS溶液，因?yàn)門ween-20可能將抗體洗掉）；11. 提前配制好ECL或DAB顯色液，如用ECL檢測(cè)，需在暗房里，紅燈下操作，將ECL顯色液均勻加至洗好的膜上，溫室放置3-5分鐘（可用移液槍將顯色液來(lái)回吸打至膜上），然后用保鮮膜包好，置于壓片夾中，在膜上加X(jué)光片，壓片（時(shí)間根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定，如肉眼都可看見(jiàn)，測(cè)1分鐘即可，如看不見(jiàn)，測(cè)3-5分鐘，甚至30 min ）