多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件2014年3月

1、誰(shuí)是兇手？誰(shuí)是兇手？英國(guó)遺傳學(xué)家英國(guó)遺傳學(xué)家JefferysJefferys通過(guò)通過(guò)DNADNA分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲得了一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲得了一系列可以在膠片上看到的圖紋，這些圖紋極少有兩個(gè)人完全相同，與可以在膠片上看到的圖紋，這些圖紋極少有兩個(gè)人完全相同，與人的指紋一樣是每個(gè)人所特有的人的指紋一樣是每個(gè)人所特有的. .故稱為故稱為“DNA“DNA指紋指紋”1 1、將毛發(fā)、血痕、精斑、人體組織或白骨等所含的、將毛發(fā)、血痕、精斑、人體組織或白骨等所含的DNADNA提取出來(lái)提取出來(lái)2 2、將、將DNADNA樣品進(jìn)行樣品進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增。3 3、選用與探針配對(duì)的限制性核酸內(nèi)切酶，在長(zhǎng)

2、鏈、選用與探針配對(duì)的限制性核酸內(nèi)切酶，在長(zhǎng)鏈DNADNA位置上加以位置上加以切割，將分子量很大的切割，將分子量很大的DNADNA長(zhǎng)鏈切成許多長(zhǎng)度不同的小片段長(zhǎng)鏈切成許多長(zhǎng)度不同的小片段 。4 4、在膠板尺寸較長(zhǎng)的凝膠電泳儀中，對(duì)酶解完全后的在膠板尺寸較長(zhǎng)的凝膠電泳儀中，對(duì)酶解完全后的DNADNA片段進(jìn)行電片段進(jìn)行電泳，各酶切片段就會(huì)按其長(zhǎng)度大小在電場(chǎng)中進(jìn)行分離。泳，各酶切片段就會(huì)按其長(zhǎng)度大小在電場(chǎng)中進(jìn)行分離。5 5、先用堿性溶液使凝膠板中分離開(kāi)的雙鏈、先用堿性溶液使凝膠板中分離開(kāi)的雙鏈DNADNA片段變性為單鏈片片段變性為單鏈片段，然后將凝膠板夾在尼龍膜中，并永久性地固定在尼龍膜上。段，然后將

3、凝膠板夾在尼龍膜中，并永久性地固定在尼龍膜上。6 6、讓放射性、讓放射性DNADNA探針與尼龍膜上的單鏈探針與尼龍膜上的單鏈DNADNA片段進(jìn)行雜交。片段進(jìn)行雜交。5.2 5.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNADNA片段片段應(yīng)用：應(yīng)用： 的診斷、的診斷、 、 、 和和DNADNA 等各方面。等各方面。遺傳疾病遺傳疾病刑偵破案刑偵破案基因克隆基因克隆序列測(cè)定序列測(cè)定了解應(yīng)用了解應(yīng)用 理解原理理解原理放什么物質(zhì)？創(chuàng)設(shè)什放什么物質(zhì)？創(chuàng)設(shè)什么條件？為什么？么條件？為什么？古生物學(xué)古生物學(xué) PCRPCR美國(guó)科學(xué)家美國(guó)科學(xué)家以極少數(shù)的以極少數(shù)的DNADNA為模板，在幾小為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出

4、上百萬(wàn)份的時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNADNA。解決了因?yàn)闃悠分薪鉀Q了因?yàn)闃悠分蠨NADNA含量太含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題。低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題?？焖?、高效、靈活、易操作。快速、高效、靈活、易操作。特點(diǎn)：特點(diǎn)：Plymerase ChainDNADNA分子的分子的-OH-OH端為端為3 3/ / ; ; 磷酸基團(tuán)的末端為磷酸基團(tuán)的末端為5 5/ /3355一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）PCRPCR原理原理 1 1、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制（1 1）DNADNA由兩條由兩條反向反向平行平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤(pán)旋而成的。的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤(pán)旋而成的。？?jī)蓚€(gè)脫氧

5、核苷酸通過(guò)兩個(gè)脫氧核苷酸通過(guò)3-5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接連接識(shí)別識(shí)別解旋：解旋：形成子鏈形成子鏈:解旋酶催化，氫解旋酶催化，氫鍵斷裂鍵斷裂以母鏈為模板，在以母鏈為模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，利用游離的脫氧核的催化下，利用游離的脫氧核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)母鏈母鏈子鏈子鏈子代子代DNADNA1 1、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 （2 2）復(fù)制所需的物質(zhì)及作用：）復(fù)制所需的物質(zhì)及作用：方向？還需方向？還需什么物質(zhì)？什么物質(zhì)？DNADNA聚合聚合酶特性？作用？酶特性？作用？引物？引物？（）子鏈形成（）子鏈形成不能從頭開(kāi)始合成子鏈，只能催化不能從頭開(kāi)始合成子鏈，只能

6、催化從引物的游離從引物的游離33一一OHOH上連接脫氧核上連接脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵。苷酸形成磷酸二酯鍵。按按5353的的方向方向延長(zhǎng)。延長(zhǎng)。 一小段單鏈的一小段單鏈的DNADNA或或RNARNA，能，能與母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。與母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。通常為通常為20302030個(gè)核甘酸個(gè)核甘酸方向？方向？引物引物DNADNA聚合酶聚合酶1、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制（小結(jié)）的復(fù)制（小結(jié)）模板模板 親代親代DNADNA解開(kāi)雙鏈解開(kāi)雙鏈 解旋酶解旋酶子鏈形成子鏈形成 DNADNA聚合酶聚合酶 引物引物原料原料 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸能量能量 ATP 過(guò)程及需要的物質(zhì)？過(guò)程及需

7、要的物質(zhì)？高溫為什么能使高溫為什么能使DNADNA解旋？解旋？耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶如何篩選？聚合酶如何篩選？引物結(jié)合、引物結(jié)合、 DNADNA聚合酶最適溫度是多少聚合酶最適溫度是多少? ?體外合成體外合成DNADNA？需擴(kuò)增的需擴(kuò)增的DNADNA高溫高溫90959095DNADNA聚合酶聚合酶（耐高溫）（耐高溫）人工合成引物人工合成引物 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸ATPDNA雙鏈雙鏈單鏈單鏈變性（加熱變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）2 2、 DNADNA復(fù)制的人工控制復(fù)制的人工控制（1 1）DNADNA的熱變性的熱變性控制溫度控制解旋與結(jié)合控制溫度控制

8、解旋與結(jié)合 （2 2）耐高溫的耐高溫的TaqDNATaqDNA聚合酶從水生耐熱細(xì)菌中篩選。提聚合酶從水生耐熱細(xì)菌中篩選。提高了效率，高了效率，PCRPCR趨于自動(dòng)化趨于自動(dòng)化. .DNADNA聚合酶最適溫度是聚合酶最適溫度是70757075高溫為什么能使高溫為什么能使DNADNA解旋？解旋？引物結(jié)合、引物結(jié)合、 DNADNA聚合酶最適溫度聚合酶最適溫度? ?耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶如何篩選？聚合酶如何篩選？( (利于引物與母鏈結(jié)合，利于引物與母鏈結(jié)合，55 55 最好最好) )94 94 最好最好) )3.PCR3.PCR需要的物質(zhì)及條件需要的物質(zhì)及條件6 6）自動(dòng)調(diào)控控制溫度的儀）

9、自動(dòng)調(diào)控控制溫度的儀器，使器，使DNA DNA 變性（變性（90959095） 復(fù)性（復(fù)性（55 55 ） 延伸延伸72 72 。1 1）需擴(kuò)增的模板）需擴(kuò)增的模板DNADNA2 2）耐高溫的）耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶3 3）與兩條模板鏈互補(bǔ)的引物）與兩條模板鏈互補(bǔ)的引物4 4）原料（四種脫氧核苷酸）原料（四種脫氧核苷酸）5）一定的緩沖液）一定的緩沖液 放什么物質(zhì)？什么條件？為什么？放什么物質(zhì)？什么條件？為什么？什么是什么是PCRPCR的三步曲？的三步曲？（1）PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性9494變性變性（二）（二）PCR三步曲三步曲 條件及結(jié)果？條件及結(jié)果？（1）PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性

10、（1）PCR循環(huán)循環(huán)-變性變性9494變性變性（2）PCR循環(huán)循環(huán)復(fù)性（退火）復(fù)性（退火）5555復(fù)性復(fù)性（3）PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸（3）PCR循環(huán)循環(huán)延伸延伸PCR 預(yù)變性預(yù)變性變變 性性9430s延伸延伸 721min退火退火 5530s945min控制溫度控制溫度變化的溫變化的溫控設(shè)備控設(shè)備1 1）需擴(kuò)增的模板）需擴(kuò)增的模板DNADNA2 2）耐高溫的）耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶3 3）與兩條模板鏈互補(bǔ)的引物）與兩條模板鏈互補(bǔ)的引物4 4）原料（四種脫氧核苷酸）原料（四種脫氧核苷酸）5）一定的緩沖液）一定的緩沖液復(fù)制復(fù)制n n次，要放多少原次，要放多少原料和引物？引物特點(diǎn)？料和引

11、物？引物特點(diǎn)？形成多少產(chǎn)物？產(chǎn)物形成多少產(chǎn)物？產(chǎn)物完全相同嗎？完全相同嗎？第一次解旋高溫的時(shí)間長(zhǎng)？第一次解旋高溫的時(shí)間長(zhǎng)？模板鏈會(huì)結(jié)合嗎？模板鏈會(huì)結(jié)合嗎？MULLISMULLIS教授是個(gè)興趣廣泛，愛(ài)好戶外活動(dòng)、性格特殊的人，一次外出的返家教授是個(gè)興趣廣泛，愛(ài)好戶外活動(dòng)、性格特殊的人，一次外出的返家途中，他駕駛著汽車在一條彎曲的山路上，在汽車開(kāi)始駛?cè)肫教构P直的公路途中，他駕駛著汽車在一條彎曲的山路上，在汽車開(kāi)始駛?cè)肫教构P直的公路時(shí)，他突然聯(lián)想：已經(jīng)經(jīng)過(guò)的山路好像是折疊纏繞的時(shí)，他突然聯(lián)想：已經(jīng)經(jīng)過(guò)的山路好像是折疊纏繞的DNADNA雙螺旋，被熱變性成雙螺旋，被熱變性成兩條解開(kāi)的兩條解開(kāi)的5353的

12、單鏈就是山腳下平坦筆直的上車道，它們可以是的單鏈就是山腳下平坦筆直的上車道，它們可以是DNADNA合合成的模板，如果正在行駛的小汽車代表了一小段成的模板，如果正在行駛的小汽車代表了一小段DNADNA引物，加入的引物，加入的DNADNA聚合酶聚合酶和和4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸. .正是他開(kāi)汽車時(shí)的聯(lián)想，使他以后發(fā)明了正是他開(kāi)汽車時(shí)的聯(lián)想，使他以后發(fā)明了PCR.PCR.(1) (1) 在合適位置寫(xiě)出在復(fù)性步驟中另種引物。在合適位置寫(xiě)出在復(fù)性步驟中另種引物。HOAG5(2)(2)某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。引物引物II自身折疊后會(huì)

13、出現(xiàn)局自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物引物I I和引物和引物局部發(fā)生局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效(三）難點(diǎn)解析三）難點(diǎn)解析1 1、引物、引物引物之間及引物之間及引物內(nèi)部堿引物內(nèi)部堿基勿互補(bǔ)基勿互補(bǔ)特點(diǎn)？特點(diǎn)？種類？種類？書(shū)寫(xiě)？書(shū)寫(xiě)？2種種 從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A A的的DNADNA片段所占的片段所占的比例為比例為 。在第在第 輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的酸鏈等長(zhǎng)的DNADNA片段。片段。(三）難點(diǎn)解析三）難點(diǎn)解析 1 1、引物、引物2n n2n n

14、X22X22DNADNA的數(shù)量的數(shù)量= =需要需要引物的數(shù)量引物的數(shù)量= =15/163 3數(shù)量？數(shù)量？第幾次循環(huán)有短產(chǎn)物鏈？第幾次循環(huán)有短產(chǎn)物鏈？第幾次出現(xiàn)兩條均為短產(chǎn)物？第幾次出現(xiàn)兩條均為短產(chǎn)物？?jī)蓷l均為短產(chǎn)物的數(shù)量公式？?jī)蓷l均為短產(chǎn)物的數(shù)量公式？2；3；2n n2n2n；子代；子代DNADNA單鏈中只有兩條無(wú)單鏈中只有兩條無(wú)引物，其余均含引物。處于兩引物之引物，其余均含引物。處于兩引物之間的間的DNADNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)。序列呈指數(shù)增長(zhǎng)。達(dá)標(biāo)測(cè)評(píng)達(dá)標(biāo)測(cè)評(píng)1、關(guān)于、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A 古生物學(xué)、刑偵破案、古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定序列測(cè)定B

15、 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？伸？從子鏈的從子鏈的5端向端向3端延伸端延伸“X“X基因基因”是是DNADNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCRPCR技技術(shù)特異性地拷貝術(shù)特異性地拷貝“X X基因基因”，需在，需在PCRPCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)

16、合位置如圖引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1 1所示。經(jīng)所示。經(jīng)4 4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的五種不同的DNADNA分子，如圖分子，如圖2 2所示，其中第所示，其中第種種DNADNA分子有幾個(gè)：分子有幾個(gè)：A A、2 B2 B、4 C4 C、6 D6 D、8 8（2 2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量離心按配方在微量離心管中依次加入各組管中依次加入各組分（要更換槍頭）分（要更換槍頭）（3 3）蓋嚴(yán)）蓋嚴(yán)離心管離心管口口的蓋子，用手指輕的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（輕彈擊管壁（混合混合）（4 4）將微量離心管）將微量離心管放在放在離心機(jī)離心機(jī)上（上（離離心）心）（5 5）將離心管放入）將離心管放入PCRPCR儀儀上，設(shè)置好上，設(shè)置好PCRPCR儀的循環(huán)程序儀的循環(huán)程序（反應(yīng)反應(yīng)）三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1 1、原理：、原理：DNADNA在在260nm260nm的紫的紫外線