生物分離工程精品課程

1、http:/ 胞胞 破破 碎碎http:/ (離心，過濾離心，過濾) )細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線一路線二路線二細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產(chǎn)物清液胞外產(chǎn)物粗分離粗分離( (鹽析、萃取、超過濾等鹽析、萃取、超過濾等) )純化純化( (層析、電泳層析、電泳) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超過濾凝膠過濾、超過濾) )濃縮濃縮( (超過濾超過濾) )精制精制( (結(jié)晶、干燥結(jié)晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復(fù)性復(fù)性細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述http:/ 述述細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述 一些微生物在代謝過程中將產(chǎn)物分泌到細(xì)

2、一些微生物在代謝過程中將產(chǎn)物分泌到細(xì)胞之外的液相中（稱胞外酶），這些產(chǎn)品主要為醫(yī)藥胞之外的液相中（稱胞外酶），這些產(chǎn)品主要為醫(yī)藥和保健產(chǎn)品，如和保健產(chǎn)品，如胰島素、某些細(xì)胞因子和疫苗亞單位胰島素、某些細(xì)胞因子和疫苗亞單位成分等成分等。 這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，提取過程只需直接采用過濾和離心進(jìn)行到培養(yǎng)液中，提取過程只需直接采用過濾和離心進(jìn)行固液分離，然后將獲得的澄清濾液再進(jìn)一步純化即固液分離，然后將獲得的澄清濾液再進(jìn)一步純化即可。其后續(xù)分離和純化都相對(duì)簡(jiǎn)單?？伞Ｆ浜罄m(xù)分離和純化都相對(duì)簡(jiǎn)單。http:/ 述述細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述但由于一些

3、重組但由于一些重組DNADNA（rDNArDNA）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須在細(xì)必須在細(xì)胞內(nèi)組裝來獲得生物活性胞內(nèi)組裝來獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞，如果在培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類rDNArDNA產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，然破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，然后再進(jìn)行提純，為后續(xù)的分離純化做好準(zhǔn)備工作。后再進(jìn)行提純，為后續(xù)的分離純化做好準(zhǔn)備工作。http:/ 述述細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述細(xì)胞破

4、碎（細(xì)胞破碎（cell rupturecell rupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。隨著隨著重組重組DNADNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。http:/ 述述細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述 微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層

5、均為細(xì)胞壁，細(xì)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜和它所包圍的細(xì)胞漿合稱胞壁里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜和它所包圍的細(xì)胞漿合稱原原生質(zhì)體生質(zhì)體。動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁。細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁。 基于遺傳和環(huán)境等因素，不同類型生化物質(zhì)基于遺傳和環(huán)境等因素，不同類型生化物質(zhì)其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程

6、度也就不同。此外，不同的度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。此外，不同的生化物質(zhì)其穩(wěn)定性有較大差別，在破碎過程中應(yīng)防止變生化物質(zhì)其穩(wěn)定性有較大差別，在破碎過程中應(yīng)防止變性和被胞內(nèi)的酶水解，因此，破碎方法的選擇和操作條性和被胞內(nèi)的酶水解，因此，破碎方法的選擇和操作條件的優(yōu)化是十分必要的。件的優(yōu)化是十分必要的。http:/ 核核 細(xì)細(xì) 胞胞概述細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎http:/ 幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖肽聚糖（peptidoglycanpeptidoglycan）組成，它是難溶性的）組成，它是難溶性的聚糖鏈聚糖鏈（glycanglycan chain chain），借助

7、短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。 短肽一般由四或五個(gè)氨基酸組成，如短肽一般由四或五個(gè)氨基酸組成，如L-L-丙氨丙氨酰酰- -D-D-谷氨酰谷氨酰- -L-L-賴氨酰賴氨酰- -D-D-丙氨酸。而且短肽中常有丙氨酸。而且短肽中常有D-D-氨基酸與二氨基庚二酸存在。氨基酸與二氨基庚二酸存在。http:/ (eichoiceichoic acid)acid)。而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，僅。而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2 23 3nmnm，占細(xì)，占細(xì)胞壁成分的胞壁成分的1010左右，

8、由于肽聚糖之間僅由四肽側(cè)鏈直接連左右，由于肽聚糖之間僅由四肽側(cè)鏈直接連接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖居于細(xì)胞壁最內(nèi)接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖居于細(xì)胞壁最內(nèi)層，緊貼在細(xì)胞膜上，在層，緊貼在細(xì)胞膜上，在肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層( (約約8 81010nm)nm)，主要成分為脂蛋白、脂多糖和其它脂類，主要成分為脂蛋白、脂多糖和其它脂類，因因此，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂類含量較高。此，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂類含量較高。http:/ 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述 破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的

9、致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。 http:/ 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述http:/ 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖如圖酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖如圖15152 2所示，細(xì)所示，細(xì)胞壁的胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白

10、纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是最外層是甘露聚糖甘露聚糖，由由1,61,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)部，有部，有甘露聚糖甘露聚糖- -酶酶的復(fù)合物，它可以共價(jià)連接到網(wǎng)狀的復(fù)合物，它可以共價(jià)連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。 與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。http:/ (Neurospora crassaNeurospora crassa) )的細(xì)胞壁的細(xì)胞壁 結(jié)構(gòu)示意圖結(jié)構(gòu)示意圖紅

11、面包霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖紅面包霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述http:/ (a)a)是是-和和-葡聚糖的混合物，第葡聚糖的混合物，第2 2層層( (b)b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，第構(gòu)，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，第3 3層層( (c)c)主要是蛋主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層白質(zhì)，最內(nèi)層( (d)d)主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還

12、含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。http:/ 15.1.2 植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎概述對(duì)于已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和對(duì)于已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。次生壁兩部分。初生壁是細(xì)胞生長(zhǎng)期形成的。初生壁是細(xì)胞生長(zhǎng)期形成的。次生壁是細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，在初生壁內(nèi)部形成次生壁是細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，在初生壁內(nèi)部形成的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。http:/ 1，4 4D D葡聚糖葡聚糖半纖維素半纖維素木葡聚糖木葡聚糖 甘露聚糖甘露聚糖 木聚糖木聚糖( (包括阿拉伯木聚糖和包括阿拉伯木聚糖和4-

13、4-0-0-甲基甲基- -葡萄糖醛酸木聚糖）葡萄糖醛酸木聚糖）果膠物質(zhì)果膠物質(zhì)半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白 各種酶類各種酶類 凝集素凝集素細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎http:/ 目前，較流行的初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是由目前，較流行的初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是由LampertLampert等人提出的等人提出的“經(jīng)緯經(jīng)緯”模型，依據(jù)這一模型，模型，依據(jù)這一模型，纖維素的纖維素的微纖絲以平行于細(xì)胞壁平面的方向一層一層敷著在上微纖絲以平行于細(xì)胞壁平面的方向一層一層敷著在上面，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層

14、次上則面，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層次上則排列方向不同，互成一定角度，形成獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)排列方向不同，互成一定角度，形成獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的成了細(xì)胞壁的“經(jīng)經(jīng)”，模型中的模型中的“緯緯”是結(jié)構(gòu)蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白（富含羥脯氨酸的蛋白），它由細(xì)胞質(zhì)分泌，垂直于（富含羥脯氨酸的蛋白），它由細(xì)胞質(zhì)分泌，垂直于細(xì)胞壁平面排列，并由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)，細(xì)胞壁平面排列，并由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)，徑向的微纖絲網(wǎng)和緯向的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)之間又相互交聯(lián)，徑向的微纖絲網(wǎng)和緯向的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)之間又相互交聯(lián)，構(gòu)成更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。構(gòu)成更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。半纖維素和果膠等膠體則填半纖維素和果膠等膠體則填充

15、在網(wǎng)絡(luò)之中，從而使整個(gè)細(xì)胞壁既具有剛性又具有充在網(wǎng)絡(luò)之中，從而使整個(gè)細(xì)胞壁既具有剛性又具有彈性。彈性。http:/ 某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生細(xì)胞壁某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生細(xì)胞壁之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚(4(4mm以上以上) )，常，常有三層組成。有三層組成。在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了（酚類組

16、分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。http:/ 15.2 細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎技術(shù) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。不同類型的細(xì)胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。http:/ grindingfine grinding）超聲波破碎法（超聲波破碎法（ultrasonicationultrasonication）http:/ sho

17、ckosmotic shock）凍融破碎法（凍融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化學(xué)破碎法（化學(xué)破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢劑破碎法（去垢劑破碎法（detergentsdetergents）http:/ pressure homogenizerHigh pressure homogenizer）細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎http:/ Manton GaulinManton Gaulin高壓勻漿器是常用的設(shè)

18、備，它高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵排代泵（positive displacenemtpositive displacenemt pump pump）和和排出閥排出閥（discharge valvedischarge valve）組成，排出閥具有狹窄的?。┙M成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。圖孔，其大小可以調(diào)節(jié)。圖15-515-5為高壓勻漿器的排出閥結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)為高壓勻漿器的排出閥結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖，圖，細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和出閥的小孔中高

19、速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速?zèng)_擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎高速?zèng)_擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式。在操作方式上，可以采用上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在度，使出口溫度調(diào)節(jié)在2020左右。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，左右。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。采用多次循環(huán)的

20、操作方法。http:/ WABWAB公司的公司的AVP GaulinAVP Gaulin 31MR 31MR型型最大操作壓力為最大操作壓力為2424MPaMPa最大處理量為為最大處理量為為100100dmdm3 3/h/hBran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型最大操作壓力為最大操作壓力為20-6320-63MPaMPa最大處理量為為最大處理量為為2.6-34 2.6-34 m m3 3/h/hhttp:/ lnln1/(1-R)=KNP1/(1-R)=KNP (15-1) (15-1) 式中式中 R R 破碎率，為破碎率，為N N次循環(huán)

21、后，蛋白質(zhì)的釋放量次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量RnRn與最大釋放量與最大釋放量RmRm之比；之比； K K 與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；與溫度有關(guān)的速度常數(shù)； N N 懸浮液通過勻漿器的次數(shù)；懸浮液通過勻漿器的次數(shù)； P P 操作壓力，操作壓力，MPaMPa； 與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。http:/ 升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細(xì)胞的循升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過量的情況下，甚至一次通過勻漿環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過量的情況下，甚至一次通過勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片

22、不至過小，從而給隨后細(xì)胞碎片的分離工作帶來好處。小，從而給隨后細(xì)胞碎片的分離工作帶來好處。BrokmanBrokman等等人已研究了能適應(yīng)于高壓操作的勻漿閥，試驗(yàn)表明在約人已研究了能適應(yīng)于高壓操作的勻漿閥，試驗(yàn)表明在約175 175 MPaMPa的壓力下，破碎率可達(dá)的壓力下，破碎率可達(dá)100100，但是也有試驗(yàn)表明當(dāng)壓力，但是也有試驗(yàn)表明當(dāng)壓力超過一定的值后，破碎率增長(zhǎng)得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通常超過一定的值后，破碎率增長(zhǎng)得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為采用的壓力為55557070MpaMpa。http:/ 升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細(xì)胞的循升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細(xì)胞的

23、循環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過量的情況下，甚至一次通過勻漿環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過量的情況下，甚至一次通過勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過小，從而給隨后細(xì)胞碎片的分離工作帶來好處。小，從而給隨后細(xì)胞碎片的分離工作帶來好處。BrokmanBrokman等等人已研究了能適應(yīng)于高壓操作的勻漿閥，試驗(yàn)表明在約人已研究了能適應(yīng)于高壓操作的勻漿閥，試驗(yàn)表明在約175 175 MPaMPa的壓力下，破碎率可達(dá)的壓力下，破碎率可達(dá)100100，但是也有試驗(yàn)表明當(dāng)壓力，但是也有試驗(yàn)表明當(dāng)壓力超過一定的值后，破碎率增長(zhǎng)得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通

24、常超過一定的值后，破碎率增長(zhǎng)得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為采用的壓力為55557070MpaMpa。http:/ speed bead millHigh speed bead mill）研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī)破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī) 。http:/ LM-20 LM-20型珠磨機(jī)型珠磨機(jī)細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎http:/ 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)園盤以兩

25、種位置交錯(cuò)地安裝在軸上，一種處于徑向，園盤以兩種位置交錯(cuò)地安裝在軸上，一種處于徑向，一種和軸傾斜，徑向園盤使磨料沿徑向運(yùn)動(dòng)，傾斜園一種和軸傾斜，徑向園盤使磨料沿徑向運(yùn)動(dòng)，傾斜園盤則產(chǎn)生軸向運(yùn)動(dòng)。由于交錯(cuò)的運(yùn)動(dòng)，提高了破碎效盤則產(chǎn)生軸向運(yùn)動(dòng)。由于交錯(cuò)的運(yùn)動(dòng)，提高了破碎效率。除磨室有冷卻夾套外，攪拌軸和園盤也可以冷卻。率。除磨室有冷卻夾套外，攪拌軸和園盤也可以冷卻。http:/ lnln1/(1-R)=Kt 15-2 1/(1-R)=Kt 15-2 其中其中 R R 破碎率；破碎率； K K一一 一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)； t t一一 時(shí)間。時(shí)間。一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)K K與

26、許多操作參數(shù)有關(guān)，如如攪拌轉(zhuǎn)與許多操作參數(shù)有關(guān)，如如攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液的濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠的裝量速、細(xì)胞懸浮液的濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠的裝量和珠體的直徑，以及溫度等。和珠體的直徑，以及溫度等。http:/ )利用超聲波振蕩器利用超聲波振蕩器發(fā)射的發(fā)射的15-2515-25kHzkHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振能器的作用是把電磁振

27、蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。般破碎效果后者比前者好。http:/ cavitationcavitation),),空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。http:/ 15.2.2 非機(jī)械法非機(jī)械法細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)非機(jī)械方法很多非機(jī)械方法很多酶解酶解滲透壓沖擊滲透壓沖擊

28、凍結(jié)和融化凍結(jié)和融化干燥法干燥法化學(xué)法溶胞化學(xué)法溶胞其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。http:/ 酶解（酶溶法酶解（酶溶法 Enymatic lysisEnymatic lysis) )細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozymelysozyme) )適用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于適用于革蘭

29、氏陰性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTAEDTA使之更有效地作用于細(xì)使之更有效地作用于細(xì)胞壁。胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。http:/ 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)發(fā)生酶解的條件溫和發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整，便胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整，便于后步分離等于后步分離等但酶水解價(jià)格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣但酶水解價(jià)格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣 http:/ 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù) 自溶作用是酶解的另一種方法，自溶作用是酶解

30、的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過程繼續(xù)下去?？墒牵淖兤渖L(zhǎng)環(huán)境，酶，以便生長(zhǎng)過程繼續(xù)下去?？墒?，改變其生長(zhǎng)環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。以達(dá)到自溶目的。 http:/ 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓

31、的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 http:/ 凍結(jié)凍結(jié)- -融化法融化法細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù) 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15-15），然后在室溫中），然后在

32、室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。 http:/ 化學(xué)法化學(xué)法 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)

33、試劑 http:/ 6mol/L mol/L HClHCl。堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某。堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。天然的表面活性劑有膽酸些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等鹽和磷脂等 合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS，陰離子型）；十六烷基三甲基，陰離子型）；十六烷基三甲基溴化銨（陽離子型）。非離子型如溴化銨（陽離子型）。非離子型如Triton X-100Triton X-100和吐和吐溫（溫（TweenTween）等

34、）等 有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 http:/ 選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)利用珠磨法破碎酵母細(xì)胞時(shí)，酵母內(nèi)各種酶的釋放速利用珠磨法破碎酵母細(xì)胞時(shí)，酵母內(nèi)各種酶的釋放速率常數(shù)不同。一般靠近細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶釋放速度率常數(shù)不同。一般靠近細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶釋放速度快，而細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞器內(nèi)的酶隨破碎的進(jìn)行緩慢釋快，而細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞器內(nèi)的酶隨破碎的進(jìn)行緩慢釋放出來。因此，選擇發(fā)現(xiàn)地釋放目標(biāo)產(chǎn)物是可能的，放出來。因此，選擇發(fā)現(xiàn)地釋放目標(biāo)產(chǎn)物是可能的，關(guān)鍵是要知道目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和在細(xì)胞同存在的位置，關(guān)鍵是要知

35、道目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和在細(xì)胞同存在的位置，選擇適當(dāng)?shù)钠扑榉椒ê筒僮鳁l件。選擇適當(dāng)?shù)钠扑榉椒ê筒僮鳁l件。http:/ inclusion bodies IBsinclusion bodies IBs) )http:/ 基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒有生物活性。為此，欲獲得天然活是錯(cuò)誤的，所以沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師

36、生物分離設(shè)計(jì)的難度，體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（protein foldingprotein folding）機(jī)）機(jī)理研究提出了新的課題。理研究提出了新的課題。http:/ 15.4.2 目標(biāo)蛋白的復(fù)性目標(biāo)蛋白的復(fù)性細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體（包含體（inclusion bodiesinclusion bodies）是無定形的蛋白質(zhì)的聚）是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，狀，致密，低速

37、離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白共價(jià)鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。http:/ 路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性路線（

38、二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，因此這條路線的問題比較多。膜分離的優(yōu)質(zhì)的滯留，因此這條路線的問題比較多。膜分離的優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。消耗也比離心法少。http:/ 路線三：是用化學(xué)法破菌，所采用的試劑既可以破路線三：是用化學(xué)法破菌，所采用的試劑既可以破菌又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了菌又可以

39、溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)是設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后分離帶來困難。后分離帶來困難。http:/ 來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后加來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后加入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿經(jīng)過離心和水洗除去細(xì)胞碎片，再添加溶菌酶、經(jīng)過離心和水洗除去細(xì)胞碎片，再添加溶菌酶、EDTAEDTA和促進(jìn)劑以除去脂蛋白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離和促進(jìn)劑以除去脂蛋

40、白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為6 6mol/Lmol/L鹽酸鹽酸胍。溶解的同時(shí)通入空氣氧化以打斷錯(cuò)誤連接的雙硫胍。溶解的同時(shí)通入空氣氧化以打斷錯(cuò)誤連接的雙硫鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性過程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。析復(fù)性。復(fù)性過程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。http:/ 胞胞 破破 碎碎http:/ 重組重組DNADNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了技術(shù)為

41、大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們?cè)诜蛛x純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想是，人們?cè)诜蛛x純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素、人細(xì)胞介素、人干擾素等）干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒包含體（包含體（ inclusion

42、bodies IBsinclusion bodies IBs) )。http:/ 0產(chǎn)物占菌體總蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%/%外源蛋白的積累外源蛋白的積累人胰島素人胰島素50%50%形成包涵體形成包涵體 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在細(xì)胞間區(qū)在細(xì)胞間區(qū)- -人體干擾素人體干擾素25%25%形成包涵體形成包涵體凝乳酶原凝乳酶原形成包涵體形成包涵體牛生長(zhǎng)激素牛生長(zhǎng)激素30%30%形成包涵體形成包涵體 - -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體形成間區(qū)包涵體人胰島素原人胰島素原5%26%5%26%形成包涵體形成包涵體細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎http:/ 包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)

43、成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些因表達(dá)產(chǎn)物。這些 基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，基因表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒有生物活性。為此，欲但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離所以，包含體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（protein protein fol

44、dingfolding）機(jī)理研究提出了新的課題。）機(jī)理研究提出了新的課題。http:/ 包含體（包含體（inclusion bodiesinclusion bodies）是無定形的）是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全

45、暴露，所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。因此因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。http:/ (高壓勻漿、高速珠磨）高壓勻漿、高速珠磨）離心提取出包含體離心提取出包含體加變性劑溶解加變性劑溶解除變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎http:/ 1 的特點(diǎn)的特點(diǎn)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎目標(biāo)蛋白的復(fù)性 特點(diǎn)特點(diǎn): :是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離

46、心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。這樣首獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。 缺點(diǎn)缺點(diǎn): :是要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞是要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。http:/ 2 的特點(diǎn)的特點(diǎn)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎目

47、標(biāo)蛋白的復(fù)性 路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，因此這條路線的問題比較多。膜分離的優(yōu)質(zhì)的滯留，因此這條路線的問題比較多。膜分離的優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。消耗也比離心法少。http:/ 路線三：路線三：細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎目標(biāo)蛋白的復(fù)性是用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既

48、可以破碎又可以是用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)是所有的可缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。帶來困難。http:/ 來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后加來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后加入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿經(jīng)過離心和水洗除去細(xì)胞碎片，再添加溶菌酶、經(jīng)過離心和水洗除去細(xì)胞

49、碎片，再添加溶菌酶、EDTAEDTA和促進(jìn)劑以除去脂蛋白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離和促進(jìn)劑以除去脂蛋白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為6 6mol/Lmol/L鹽酸鹽酸胍。溶解的同時(shí)通入空氣氧化以打斷錯(cuò)誤連接的雙硫胍。溶解的同時(shí)通入空氣氧化以打斷錯(cuò)誤連接的雙硫鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性過程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。析復(fù)性。復(fù)性過程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。h

50、ttp:/ (離心，過濾離心，過濾) )細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線一路線二路線二細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產(chǎn)物清液胞外產(chǎn)物粗分離粗分離( (鹽析、萃取、超過濾等鹽析、萃取、超過濾等) )純化純化( (層析、電泳層析、電泳) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超過濾凝膠過濾、超過濾) )濃縮濃縮( (超過濾超過濾) )精制精制( (結(jié)晶、干燥結(jié)晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復(fù)性復(fù)性沉淀法沉淀法概論http:/ 16.1 概述概述沉淀法沉淀法概論 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液

51、相變成固相析出的過程。程。采用沉淀的手段，主要是為了通過沉淀達(dá)到濃縮采用沉淀的手段，主要是為了通過沉淀達(dá)到濃縮的目的，或者通過沉淀，固液分相后，除去留在液相的目的，或者通過沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分；其次，沉淀可以將已或沉積在固體中的非必要成分；其次，沉淀可以將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即有選擇地沉有選擇地沉淀雜質(zhì)或淀雜質(zhì)或有有選擇地沉淀所需成分。選擇地沉淀所需成分。http:/ 概述概述沉淀法沉淀法概論 生物分子在水中形成

52、穩(wěn)定的溶液是有條件的，生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會(huì)破壞溶液的穩(wěn)定性。件的因素都會(huì)破壞溶液的穩(wěn)定性。沉淀法沉淀法就是采用適就是采用適當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分分開的技術(shù)。分開的技術(shù)。沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室中。的方法，但目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和

53、實(shí)驗(yàn)室中。http:/ 概述概述沉淀法沉淀法概論 沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉析物可直溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析、超濾、層接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時(shí)，常操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時(shí)，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進(jìn)采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進(jìn)行：行：http:/ 概述概述沉淀法沉淀法概論

54、沉淀法操步驟沉淀法操步驟 ：首先加入沉淀劑，首先加入沉淀劑，沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長(zhǎng)；沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長(zhǎng)；為離心或過濾，收集沉淀物。為離心或過濾，收集沉淀物。加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響淀物的形狀都有很大影響。http:/ 1）鹽析法；）鹽析法；（2 2）等電點(diǎn)沉淀法；）等電點(diǎn)沉淀法；（3 3）有機(jī)溶劑沉淀法；）有機(jī)溶劑沉淀法；（4 4）非離子型聚合物沉淀法；）非離子型聚合物沉淀法；（5 5）聚電解質(zhì)沉淀法；）聚電解質(zhì)沉淀法；（6 6）高價(jià)金屬離子沉淀法等。）高價(jià)金屬離子沉淀法等。上述各種方法中，除

55、第（上述各種方法中，除第（3 3）種有機(jī)溶劑沉淀法也能適）種有機(jī)溶劑沉淀法也能適用于抗生素等小分子外，其他各種方法只適用蛋白質(zhì)用于抗生素等小分子外，其他各種方法只適用蛋白質(zhì)等大分子，故以下的討論均限于蛋白質(zhì)。等大分子，故以下的討論均限于蛋白質(zhì)。http:/ 16.2 蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解特性沉淀法沉淀法蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。象以及分子周圍的環(huán)境所決定。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。

56、親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。蛋白質(zhì)更易溶解。http:/ polymer polymer），），主要由疏水性各不相同的主要由疏水性各不相同的 20 20 種氨基酸組成。在水溶種氨基酸組成。在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，使親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體的趨勢(shì)，使親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基結(jié)構(gòu)的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面

57、，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。因此，蛋白質(zhì)量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。疏水區(qū)構(gòu)成。http:/ shell)hydration shell)可以使蛋可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（電位）降低蛋白質(zhì)溶液的

58、穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。沉淀。http:/ 16.3 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性沉淀法沉淀法蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)可以看作是一個(gè)表面分布有正、負(fù)電荷的球體，蛋白質(zhì)可以看作是一個(gè)表面分布有正、負(fù)電荷的球體，這種正、負(fù)電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句這種正、負(fù)電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句話說，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，話說，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，蛋白質(zhì)的沉淀，實(shí)際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相蛋白質(zhì)的沉淀，實(shí)際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似。似。靜電斥力靜電斥力吸引力吸引力ht

59、tp:/ /膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似沉淀法沉淀法蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是電中性的，水中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表電中性的，水中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。http:/ Van der Waals Van der Waals 力力Keeson Keeson 引力（偶極力）引力（偶極力）Debye Deb

60、ye 引力引力 （誘導(dǎo)力）（誘導(dǎo)力）London London 引力引力 （色散力）是最重要的一種引力，因?yàn)椋ㄉ⒘Γ┦亲钪匾囊环N引力，因?yàn)樗蟹肿佣际强梢员粯O化的，所以它是普遍存在的。所有分子都是可以被極化的，所以它是普遍存在的。http:/ 顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘；在高離子強(qiáng)度時(shí)，力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘；在高離子強(qiáng)度時(shí)，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能。吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸