黃連解毒湯對過氧化氫誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用

1、黃連解毒湯對過氧化氫誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用?142?中國醫(yī)院藥學(xué)雜志2005年第25卷第2期ChinHospPharmJ,2005Feb,Vol25,No.2黃連解毒湯對過氧化氫誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用吳彥.,孫建寧,于紹坤(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理系,北京100102;2.北京維健生生物科技有限公司,北京)()39)摘要目的:觀察黃連解毒湯有效部位(HIjDTAF)對培養(yǎng)皮層神經(jīng)細胞過氧化氫損傷的保護作用.方法:體外培養(yǎng)新生大鼠皮層神經(jīng)細胞,加入過氧化氫觀察其對神經(jīng)細胞的損傷及HLJDTAF的保護作用.結(jié)果:HLJDTAF610,305mg?kg可減少模型乳酸脫氫酶(LD

2、H)漏出率,305mg?kg還可提高模型細胞活性(P<I).o5;P<().01).同時HLJDTAF各劑量均可減少丙二醛生成,153mg?kg還可減少一氧化氮生成.結(jié)論:HLJDTAF對培養(yǎng)神經(jīng)細胞自由基損傷具有顯著的保護作用,其機制可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān).關(guān)鍵詞黃連解毒湯有效部位;過氧化氫;皮層神經(jīng)元;細胞培養(yǎng)中圖分類號R285.5文獻標識碼A文章編號10015213(2005)02014203ProtectiveeffectsofHuanglianJiedutangactivefractiononhydroperoxide-inducedinjuryincerebralc

3、orticalneuronalculturesWUYan,SUNJian-ning,YUShao-kun(1.DepartmentofTCMPharmacology,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.BeijingVitalCareBiothecInc,Beijing100039,China)ABSTRACT:0腳EcnVET0investigatetheprotectiveeffectsofHuanglianJiedutangactivefraction(HLJDTAF)onhydroperoxide(H202)

4、一inducedinjuryincerebralcorticalneuronalcultures.METHoDSCorticalneuronsofnewlybornratwerecuhuredinviVO.TheprotectiveeffectsofHIjDTAFonhydroperoxide-inducedinjurywereobserved.RESULTSHLJDTAF610,305mg?kgreducedtheleakagerateofLDH.305mg?kg_.increasedtheactivityofneuron,610.305,153mg?kgreducedtheproducti

5、onofMD八0Dl1LUSIONHIIDTAFprotectshydroperoxide-inducediniuryincerebralcorticalneuronalcultures,themechanismiSprobablyrelatedtothesuppressionofthegenerationofNOandreductionoflipidperoxideaction.KEYWORDS:HuanglianJiedutangactivefraction(HIJDTAF);hydroperoxide;cerebralcorticalneuron;cellculture黃連解毒湯源于唐?

6、王燾外臺秘要,由黃連,黃芩,黃柏和梔子組成,為清熱解毒代表方.近年中日兩國對黃連解毒湯及其提取物用于腦血管病的基礎(chǔ)研究與臨床報道較多1q,提示本方治療缺血性腦血管病有良好前景.本研究運用復(fù)方有效部位研究模式與方法4,利用大孑L樹脂色譜技術(shù)分離制備了黃連解毒湯有效部位(HLJDTAF),并對該有效部位的藥效學(xué)進行了系統(tǒng)研究.為進一步證實該藥對自由基損傷的保護作用,本實驗采用過氧化氫損傷大鼠皮層神經(jīng)細胞的方法模擬氧自由基損傷,觀察HIdDTAF對損傷的影響,探討其對神經(jīng)細胞的保護作用.1材料722型分光光度計(上海第三分析儀器廠);新生Wistar大鼠(24h)北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合

7、格證號:SCXK(京)200200033;黃連解毒湯有效部位(HIjDTAF),黃連解毒湯流浸膏(HLJDTD),(北京中藥學(xué)院中藥化學(xué)系,HLJDTD每1mL相當(dāng)于原藥材1g);牛黃清心丸(NHQXW,同仁堂集團公司);乳酸脫氫酶(LDH),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);DMEM高糖培養(yǎng)基,胎牛血清,胰蛋白酶(Gibco公司);馬血清(Hyclone公司);HEPES(德國BM公司);胰島素(上海生物化學(xué)制藥廠);鹽酸阿糖胞苷(cytarabinehydrochlride)(北京醫(yī)科大學(xué)實驗藥廠);多聚賴氨酸(相對分子質(zhì)量/p>

8、0),噻唑蘭(thiazoylbluetetrazoliumbromide),牛血清白蛋白,臺盼藍(trypanblue)(美國Sigma公司);過氧化氫,(分析純,北京化工廠);其他試劑均為國產(chǎn)分析純.2方法2.1藥物血清的制備藥物血清的制備方法正常Wistar大鼠,隨機分為6組.正常對照組,HLJDTAF610,305,153mg?kg組,HLJDTD4g?kg組和NHQXW1.6g?kg組.藥物按劑量,每日分上,下午2次給藥,正常對照組灌服0.5CMC1mL?(1()()g),第5次全量給藥后2h頸總動脈取血,4保存4h后離心,(3000r?min)20min,取上清,混勻,56滅活30

9、min,過濾除菌,分裝,一2()貯存.2.2方法和分組2.2.1大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng)無菌條件下分離出24h內(nèi)乳大鼠大腦皮層,迅速放解剖液中,剔除軟腦膜和血管,將分離出的皮層組織置于盛有解剖液的平皿內(nèi),用眼科剪剪成約300500m的腦作者簡介吳彥,男,博士,助理研究員,電話812,E-mail:WUyan2003中國醫(yī)院藥學(xué)雜志2005年第25卷第2期ChinHospPharmJ,2005Feb,Vol25,No.2?143?片,終濃度為0.125胰酶,37消化30min.接種培養(yǎng)液中止消化2次,吹打分散細胞,將細胞懸液經(jīng)2()()目金屬網(wǎng)過濾,調(diào)整細胞數(shù)至

10、I.010L,0.4臺盼藍鏡檢存活率>95.將制備好的神經(jīng)細胞懸液接種到0.001多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板中或培養(yǎng)瓶中,置37,5二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細胞貼壁后換培養(yǎng)液(全換),去除死細胞,以后23d換液1次,細胞培養(yǎng)至第4天.加入阿糖胞苷(終濃度為1()/mol?L)培養(yǎng)48h,以抑制非神經(jīng)細胞過度增殖,48h后換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).2.2.2皮層神經(jīng)細胞過氧化氫損傷模型的建立取培養(yǎng)10d的神經(jīng)細胞去除原培養(yǎng)液后,損傷組用無糖Earles液(mmol?L:NaCl116;KCl5.4;CaCI21.8;MgS(L7:H2O0.8;NaH2PO42:H2O2.6;NaHCO3

11、26.2;HEPES20.1;pH7.4)洗2遍,加入無血清培養(yǎng)液DMEM,加入終濃度為25,50,100,200,5()()tmmol?L過氧化氫培養(yǎng)1h后,DMEM洗2次,換上無血清的DMEM培養(yǎng)基,并置于37,5二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h.2.2.3MTT法測定細胞活性實驗結(jié)束前4h加入MTT(終濃度為0.5g?L),吸去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜200L,待孔內(nèi)顆粒完全溶解后,移入96孔培養(yǎng)板中,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570nm處的光密度(0D).2.2.4HLJIDTAF對過氧化氫誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞損傷的保護作用細胞培養(yǎng)與造模方法均同前,過氧化氫終濃度為200ptmmol?L.在過

12、氧化氫損傷前,給藥各組各孔分別加入占總體積1()的HUDTAF610,3O5,153mg?kg;HLJDTD4g?kg和NHOXW1.6g?kg占總體積1()的含藥血清,培養(yǎng)30min后,再加入過氧化氫損傷.對照組和模型組分別加入占總體積1()的空白血清.(1)乳酸脫氫酶活性測定:24h后收集培養(yǎng)液上清液100L,剩余培養(yǎng)液置一2()冰箱凍存5h后拿出化凍,按試劑盒說明書分別測定原上清液乳酸脫氫酶(LDH)的活性和培養(yǎng)板中剩余培養(yǎng)液凍融后的LDH活性,計算LDH漏出率.漏出率=(上清液LDH活性/凍融后細胞培養(yǎng)液中LDH活性)X1()().(2)細胞活性測定:方法同上;細胞上清液中氧化氮測定采

13、用硝酸還原酶法,以總硝酸鹽(No!一/N03一)含量表示氧化氮濃度;MDA含量及SoD活性的測定:細胞用PBS洗2遍,每孔加入().1tool?LPBS,加入0.1mL1TritonX一100裂解細胞,培養(yǎng)板振蕩使之溶解,3000r?min離心后,測定裂解液MDA和SOD.3結(jié)果3.1不同濃度過氧化氫對神經(jīng)細胞損傷的比較結(jié)果顯示:過氧化氫100500pmol?L可引起細胞損傷,表現(xiàn)為細胞活性降低.結(jié)果見表1.表1不同濃度過氧化氫對培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細胞損傷(z-)Tab1InjuryofdifferentconcentrationOfH2(onhydroper-oxide-inducedinju

14、ryincerebralcorticalneuronalcultures(注:與對照組比較,P<O.oi;P<O.o53.2HLJIDTAF對過氧化氫誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞損傷的保護作用結(jié)果顯示,造模后,細胞活性降低,LDH漏出率增高,No和MDA含量增加(與對照組比較P<().01;P<0.05).HLJDTAF610,3()5mg?kg對過氧化氫損傷原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞有一定的保護作用,表現(xiàn)為減少模型LDH漏出率,305mg?kg還可提高模型細胞活性(P<().()1;P<O.05).同時HLJDTAF各劑量均可減少MDA生成,153mg?kg還可減少No生成

15、.結(jié)果見表2.表2HLJIDTAF對過氧化氫損傷原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞的保護作用(z-S,”=6)Tab2EffectofHLJITAFonhydroperoxide-inducedinjuryincerebralcorticalneuronalcuhures(zs.”6)刪出率一模型組一1.160.1373.94.915.34.84.41.4HlJDTAF6101.220.1660.73.1a15.13.01.80.4a3051.400.21b61.410.7b12.07.32.00.6b1531.240.1166.512.86.12.9a2.41.4bHIJDTD4(HJ()1.320.1262

16、.83.8a8.54.【IbI.8o.6ag!:主!:!:!圭!:!:主:主!:注:與模型組比較,aP<o.O1,P<o.054討論缺血時,興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放,膜去極化和細胞內(nèi)Ca的增加,引起活性氧自由基和一氧化氮的產(chǎn)生L5j.活性氧自由基包括?o,H:和?0H,次黃嘌呤與XO反應(yīng)或X與XO反應(yīng)生成一,是缺血時產(chǎn)生自由基的主要途徑,一進一步啟動Haber-Weiss反應(yīng)生成毒性更強的羥自由基.活性氧自由基產(chǎn)生的另一個途徑是Ca鈣調(diào)蛋白依賴性NoS的激活,同時生成No,No可與?ot反應(yīng)生成?ONOO?活性氧自由基,No,?oN00一均引起細胞損傷.過氧化氫是一種較強的氧化劑,其

17、基本的細胞損傷機理是通過HaberWeiss反應(yīng)生成?OH,誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并持續(xù)為鏈式反應(yīng),使自由基反應(yīng)擴增放大造成的_6_.本研究結(jié)果表明,過氧化氫損傷可使?144?中國醫(yī)院藥學(xué)雜志2005年第25卷第2期ChinHospPharmJ,2(R)5Feb,Vol25,No.2細胞活性下降,LDH漏出率增加,細胞裂解液脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA升高,表明過氧化氫對神經(jīng)細胞有直接的損傷作用.HLJDTAF可以升高受損細胞活性,降低LDH漏出率,表明其對神經(jīng)細胞的自由基損傷有良好保護作用,HLJDTAF還可降低細胞上清液NO生成與細胞裂解液MDA的生成,這說明該藥減輕自由基損傷可能通過減少自由基生成

18、的誘發(fā)因素(N0)而減輕脂質(zhì)過氧化損傷.參考文獻:1陳光亮,張秀榮,王欽茂.黃連解毒湯藥理研究進展J.安徽中醫(yī)學(xué)院,2001,2o(5):6769.r2泉山隆男.黃連解毒湯膠囊治療腦中風(fēng)后遺癥的效果J.日本醫(yī)學(xué)介紹,1997,18(2):).溫躍才.加味黃連解毒湯治療腦梗塞1tHJ例J.吉林中醫(yī)藥,1998.(1):2627.梁吉春,石任兵,劉斌.銀翹散研究方法的新探討J.北京中醫(yī)藥大學(xué),1999.22(1):37.BeckmanJS,YeYz.ChenJ.Theinteractionofnitrieoxidewithoxygenradicalsandscavengerincerebralis

19、chemicinjuryj.AdvNeurol,1996,71(1):339.曾昭惠.張宗玉.自由基對線粒體DNA的氧化損傷J.生物化學(xué)與生物物理進展.1995,22:429,432.王德清.沈文梅,田亞平.等.羥自由基對細胞損傷作用的實驗觀察33.生物化學(xué)與生物物理進展,1995,22:278281.收稿日期2004-0428氣相色譜法測定冬蟲夏草多糖脂質(zhì)體口服液中氯仿殘留量官東秀,馮祚臻,鄧蓮芬,黃卡夫(1.玉林市紅十字會醫(yī)院.廣西玉林537OO();2.廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心,廣西南寧53()21)摘要目的:測定冬蟲夏草多糖脂質(zhì)體口服液中有機溶劑氯仿殘留量.方法:采用氣相色譜法,

20、電子捕獲檢測器(ECD);以G.nX-103(801(J()目.2m玻柱)為固定相;柱溫:18();氣化室溫度:25O;檢測器溫度:250(ECD);栽氣:氮氣;靈敏度:7;衰減:8.結(jié)果:氯仿線性關(guān)系r為0.9991.平均回收率為96.86.RSD為0.49%(,3);5批樣品中有機溶劑氯仿殘留量均符合規(guī)定.結(jié)論:經(jīng)方法學(xué)試驗驗證,該方法靈敏,準確,可靠,適用于冬蟲夏草多糖口服液中氯仿殘留量的測定.關(guān)鍵詞氣相色譜法;冬蟲夏草多糖脂質(zhì)體口服液;氟仿中圈分類號R283.1文獻標識碼A文章編號1ooi一5213(2O05)02014402Gaschromatographydetermination

21、ofresidualchloroformincordycepspolysaccharideliposomesoralliquidGUANDong-xiu,FENGZuo-zhen,DENGLianfen:.HUANGKafu(1.Red-crossHospitalofYulinCity.Guan.gxiYulin537O0O.China;2.GuangxiCentersforDiseasesControlandPrevention.GuangxiNanning53()21,China)ABSTRAL3:OBJECTIVETodeterminethecOntentsofresidualvolat

22、ileorganicsolvents.chlorofoITfl,incordycepsPolysaccharideliposomesoralliquid.ME3”HOi;Usinggaschromatographywithelectroncapturedetector(ECD);G.Dx_103(8()l(1Omesh.2m);Theintialtemperaturewas18(J;Theinjectionportanddetectortemperatureswere250;usingnitrogenascarriergas.RESULTSThecOrrelationrofchlorofoITfl