MTT配制原理操作步驟結果分析注意事項

1、MTT配制、原理、操作步驟、結果分析、注意事項-四、實驗所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g1.1 對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜蛶状?，以使小管中的MTT不殘留于管

2、內。將MTT完全混勻后，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。1.2 對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養(yǎng)板中加。注意事項：l 在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l 配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感l(wèi) MTT一般最好現用現配，過濾后4度避光保存兩周內（個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好

3、小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用。l MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.2MTT甲瓚溶解液2.1 二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結晶去掉，導致結果不穩(wěn)定。2.2 三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液（文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457），該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。

4、（個人覺得其溶解的能力不如DMSO強）該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。五、MTT法實驗步驟1: 胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。細胞詳細計數方法請參照中的相關文章。對于初學者而言，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數量。以一般細胞培養(yǎng)常用的25cm2為例，1)        細胞密度在長到約80%

5、90%（下圖所示為80%90%密度時細胞的大致狀態(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻。2)        另取一支新的15ml無菌離心管（為下一步接種96孔板用），裝入約9ml培養(yǎng)基. 3)        從第一步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細胞計數，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當于細胞計數板4個大格內每大格平均5-10個細胞（見下圖）；如果不夠該濃度，再根據計數的結果滴加細胞懸液，

6、每滴按50ul計算。 4)        細胞數量因實驗目的不同應做相應調整，如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以（相當于細胞懸液密度為2×104/ml），細胞毒性實驗每孔500010000個（相當于細胞懸液密度為5×104/ml）。此外，還應根據細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數量。比如：生長較快的細胞密度可略小。 2將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為500010000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。l    

7、     注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結果至關重要。-3.       將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設6個，否則難以反應真實情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。 l

8、0;      對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。 4.       5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度

9、為細胞的毒性作用。5.       每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 6.       終止培養(yǎng)，準備溶解結晶。  l         溶解結晶的方法有兩種，第一種，用DMSO溶解1)     

10、60;  MTT加入培養(yǎng)4h后，結晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損失。個人認為，這兩種方法都有可能導致結晶的損失，從而引起結果的不準確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再決定。2)        每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 l   &#

11、160;     另一種方法，用三聯溶解液（見上面MTT甲瓚溶解液）1)        MTT加入培養(yǎng)4h后，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。）2)        放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育46小時，鏡下觀察，待結晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37孵育4小

12、時左右，紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會長一些。 在實際的操作過程中，往往為了等待46小時，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經摸索，加入溶解液后過夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。7、同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。 MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4

13、,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。二、MTT法用來做什么 簡單地說：是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT主要有兩個用途1藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細胞毒性的測定；2細胞增殖及細胞活性測定。三、為何MTT可以用來做上述工作檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜

14、（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。四、實驗所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g1.1對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預先在50ml離心管（沒有的

15、話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜蛶状?，以使小管中的MTT不殘留于管內。將MTT完全混勻后，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。1.2對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養(yǎng)板中加。注意事項：l在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l配成的MTT需要無菌，MTT

16、對菌很敏感l(wèi)MTT一般最好現用現配，過濾后4度避光保存兩周內（個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用。lMTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套. 2MTT甲瓚溶解液2.1二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結晶去掉，導致結果不穩(wěn)定。2.2三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙

17、蒸水溶解配成100ml溶液（文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457），該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。（個人覺得其溶解的能力不如DMSO強）該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。五、MTT法實驗步驟1: 胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。 細胞詳細計數方法請參照易生物實驗技術中的相關文章。對于初學者而言，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在

18、這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數量。以一般細胞培養(yǎng)常用的25cm2為例，1)細胞密度在長到約80%90%（下圖所示為80%90%密度時細胞的大致狀態(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻。2)另取一支新的15ml無菌離心管（為下一步接種96孔板用），裝入約9ml培養(yǎng)基.3)從第一步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細胞計數，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當于細胞計數板4個大格內每大格平均5-10個細胞（見下圖）；如果不夠該濃度，再根據計數的結果滴加細胞懸液，每滴按50ul計算。)細胞數量因實驗目的不同應做相應調整，如一般

19、細胞增殖實驗每孔2000個就可以（相當于細胞懸液密度為2×104/ml），細胞毒性實驗每孔500010000個（相當于細胞懸液密度為5×104/ml）。此外，還應根據細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數量。比如：生長較快的細胞密度可略小。2將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為500010000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。l注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加6個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結果至關重要。3.將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿

20、孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設6個，否則難以反應真實情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。l對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥

21、引起細胞死亡。4.5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用。5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 6. 終止培養(yǎng)，準備溶解結晶。l 溶解結晶的方法有兩種，第一種，用DMSO溶解1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損

22、失。個人認為，這兩種方法都有可能導致結晶的損失，從而引起結果的不準確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再決定。2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。l 另一種方法，用三聯溶解液（見上面MTT甲瓚溶解液）1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。）2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育46小時，鏡下觀察，待結晶全部溶解后570nm測吸光度

23、。通常37孵育4小時左右，紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會長一些。在實際的操作過程中，往往為了等待46小時，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經摸索，加入溶解液后過夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。7、同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。六、MTT結果分析關于如何計算IC50 1、改良寇式法:lgIC50=

24、Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應率之和Pm:最大陽性反應率Pn:最小陽性反應率舉個例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細胞后所得MTT值如下藥物濃度ug/ml100502512.56.253.1250OD均值0.0800.0930.2360.3740.4410.5310.614公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對于100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：藥物濃度ug/ml100502512.56.253.125抑制率0.8690.84

25、90.6160.3910.2820.135代入計算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655 IC50=45.186該藥物的IC50值為45.186ug/ml    -/ MTT所有問題大匯總-實驗前應明確的問題1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因

26、此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間

27、點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。4. 培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的45次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。6. 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。7. 實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入

28、不同濃度的藥物。8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內殘余培養(yǎng)液。實驗步驟貼壁細胞：1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2. 5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況3. 5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。6. 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10m