第五章 分子生物學(xué)常用技術(shù) 習(xí)題

1、第5章 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用 習(xí)題 （引自網(wǎng)絡(luò)精品課程）一、選擇題（一）A型題1 分子雜交實(shí)驗(yàn)不能用于A 單鏈 DNA 與 RNA 分子之間的雜交 B 雙鏈 DNA 與 RNA 分子之間的雜交C 單鏈 RNA 分子之間的雜交 D 單鏈 DNA 分子之間的雜交E 抗原與抗體分子之間的雜交2 關(guān)于探針敘述錯(cuò)誤的是A 帶有特殊標(biāo)記 B 具有特定序列 C 必須是雙鏈的核酸片段 D 可以是基因組 DNA 片段 E 可以是抗體3 下列哪種物質(zhì)不能用作探針A DNA 片段 B cDNA C 蛋白質(zhì) D 氨基酸 E RNA 片段4 印跡技術(shù)可以分為A DNA 印跡 B RNA 印跡 C 蛋白質(zhì)印跡

2、 D 斑點(diǎn)印跡 E 以上都對(duì)5 PCR 實(shí)驗(yàn)延伸溫度一般是A 90 B 72 C 80 D 95 E 60 6 Western blot 中的探針是A RNA B 單鏈 DNA C cDNA D 抗體 E 雙鏈 DNA7 Northern blotting 與 Southern blotting 不同的是A 基本原理不同 B 無(wú)需進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化 C 探針必須是 RNAD 探針必須是 DNA E 靠毛細(xì)作用進(jìn)行轉(zhuǎn)移8 可以不經(jīng)電泳分離而直接點(diǎn)樣在 NC 膜上進(jìn)行雜交分析的是A 斑點(diǎn)印跡 B 原位雜交 C RNA 印跡 D DNA 芯片技術(shù)E DNA 印跡9 下列哪種物質(zhì)在 PCR 反應(yīng)中不

3、能作為模板A RNA B 單鏈 DNA C cDNA D 蛋白質(zhì) E 雙鏈 DNA10 RT-PCR 中不涉及的是A 探針 B cDNA C 逆轉(zhuǎn)錄酶 D RNA E dNTP11 關(guān)于 PCR 的基本成分?jǐn)⑹鲥e(cuò)誤的是A 特異性引物 B 耐熱性 DNA 聚合酶 C dNTPD 含有 Zn 2+ 的緩沖液 E 模板12 DNA 鏈末端合成終止法不需要A ddNTP B dNTP C 引物標(biāo)記 D DNA 聚合酶 E 模板13 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建不需要A 提取 mRNA B 限制性?xún)?nèi)切酶裂解 mRNA C 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNAD 將 cDNA 克隆入質(zhì)?；蚴删w E 重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞14 標(biāo)簽

4、蛋白沉淀是A 研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù) B 基于親和色譜原理C 常用標(biāo)簽是 GST D 也可以是 6 組氨酸標(biāo)簽 E 以上都對(duì)15 研究蛋白質(zhì)與 DNA 在染色質(zhì)環(huán)境下相互作用的技術(shù)是A 標(biāo)簽蛋白沉淀 B 酵母雙雜交 C 凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn) D 染色質(zhì)免疫沉淀法 E 噬菌體顯示篩選系統(tǒng)16 動(dòng)物整體克隆技術(shù)又稱(chēng)為A 轉(zhuǎn)基因技術(shù) B 基因滅活技術(shù) C 核轉(zhuǎn)移技術(shù) D 基因剔除技術(shù)E 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)17 目前主要克隆的致病基因是A 糖尿病致病基因 B 惡性腫瘤致病基因 C 單基因致病基因D 多基因致病基因 E 高血壓致病基因18 基因疫苗主要是指A DNA 疫苗 B RNA 疫苗 C 反義核酸 D 核

5、酶 E 小干擾 RNA19 目前基因治療中選用最多的基因載體是A 噬菌體 B 脂質(zhì)體 C 逆轉(zhuǎn)錄病毒 D 腺病毒相關(guān)病毒 E 腺病毒20 目前基因治療多采用的方法是A 基因增補(bǔ) B 基因置換 C 基因矯正 D 基因滅活 E 基因疫苗（二）B型題A Southern blotting B Northern blottingC Western blotting D dot blotting E in situ hybridization1 不需要電泳、轉(zhuǎn)膜等程序2 電泳前不需進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化3 靠電轉(zhuǎn)移完成生物大分子的轉(zhuǎn)移4 直接在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行雜交A 逆轉(zhuǎn)錄 PCR B 原位 PC

6、R C 實(shí)時(shí) PCRD 多重 PCR E RFLP5 將目的基因擴(kuò)增與定位相結(jié)合6 能動(dòng)態(tài)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量7 將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一項(xiàng)技術(shù)8 在同一反應(yīng)中采取多對(duì)引物A 功能克隆 B 定位克隆 C 轉(zhuǎn)基因技術(shù)D 核轉(zhuǎn)移技術(shù) E 基因剔除 9 也叫基因靶向滅活10 該技術(shù)中，被導(dǎo)入的目的基因稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因11 從對(duì)基因編碼產(chǎn)物的功能的了解出發(fā)克隆致病基因A 基因疫苗 B 基因矯正 C 基因置換D 基因增補(bǔ) E 基因失活12 目前基因治療采用最多的方法是13 將致病基因的異常堿基進(jìn)行修正的基因治療方法是14 將正?；蚪?jīng)體內(nèi)基因同源重組原位替換致病基因的基因治療方法是1

7、5 利用特定的反義核酸阻斷變異基因異常表達(dá)的基因治療方法是A 酵母雙雜交技術(shù) B 標(biāo)簽蛋白沉淀 C 電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定D 染色質(zhì)免疫沉淀 E 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析16 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)17 需要設(shè)計(jì)誘餌基因18 近年該技術(shù)與芯片技術(shù)結(jié)合在一起，成為一項(xiàng)鑒定特定核蛋白的 DNA 結(jié)合靶點(diǎn)的新技術(shù)（三）X型題1 核酸探針可以是A 人工合成寡核苷酸片段 B 基因組 DNA 片段 C RNA 片段D cDNA 全長(zhǎng)或部分片段 E 核苷酸2 核酸分子雜交可以形成的雜化雙鏈有A DNA/DNA B RNA/RNA C DNA/RNA D 寡核苷酸 /RNAE 寡核苷酸 /DNA3 PCR 技術(shù)主要用于A

8、目的基因的克隆 B 基因的體外突變 C DNA 和 RNA 的微量分析 D DNA 序列測(cè)定 E 基因突變分析4 分子雜交技術(shù)的原理涉及A 分子雜交特性 B 基因文庫(kù) C 印跡技術(shù) D 生物芯片 E 探針技術(shù)5 關(guān)于 DNA 鏈末端合成終止法正確的是A 需加入的鏈終止劑 ddNTP B dNTP 需要標(biāo)記 C 引物也需要標(biāo)記 D 又稱(chēng) Sanger 法 E ddNTP 缺乏 5 ' -OH6 基因組 DNA 文庫(kù)建立需要A 基因組進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化 B DNA 片段克隆到相應(yīng)載體中 C 重組體感染宿主菌 D 篩選目的基因可以通過(guò)核酸分子雜交的方法進(jìn)行 E 以 噬菌體為載體的人基因組

9、DNA 文庫(kù)的克隆數(shù)目至少應(yīng)在 10 6 以上7 用于構(gòu)建基因組 DNA 文庫(kù)的載體有A 酵母人工染色體 B 粘粒 C 噬菌體 D 腺病毒 E 脂質(zhì)體8 基因診斷較常規(guī)診斷其特點(diǎn)有A 屬于病因診斷 B 特異性強(qiáng) C 適用范圍窄 D 靈敏度高 E 有放大效應(yīng)9 基因失活的常用技術(shù)包括A 基因疫苗 B 核酶 C 小干擾 RNA D 反義核酸 E 基因置換10 克隆羊多莉的產(chǎn)生屬于A 同種異體細(xì)胞轉(zhuǎn)移技術(shù) B 同種異體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù) C 試管內(nèi)受精D 無(wú)性繁殖 E 同種異體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)11 疾病動(dòng)物模型可用于A 探討疾病的發(fā)生機(jī)制 B 克隆致病基因 C 新治療方法的篩選系統(tǒng)D 新藥物的篩選系統(tǒng) E

10、 新疾病模型的篩選系統(tǒng)12 蛋白質(zhì)芯片主要應(yīng)用于A 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究 B 蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究 C 蛋白質(zhì)功能的研究D 蛋白質(zhì)之間的相互作用研究 E 疾病的診斷和新藥的篩選13 研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括A 標(biāo)簽蛋白沉淀 B 酵母雙雜交 C 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)D 噬菌體顯示篩選系統(tǒng) E DNA 印跡14 基因治療的基本程序包括A 治療性基因的選擇 B 基因載體的選擇 C 靶細(xì)胞的選擇 D 基因轉(zhuǎn)移E 回輸體內(nèi)15 目前可用作基因治療的基因載體包括A 腺病毒相關(guān)病毒 B 噬菌體 C 腺病毒 D 逆轉(zhuǎn)錄病毒 E 粘粒二、是非題1 Southern blot 主要用于 RNA 的定性和定量分析。2 蛋白質(zhì)

11、印跡分析技術(shù)中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，可以用電轉(zhuǎn)移，也可以靠毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移。3 實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)與普通 PCR 技術(shù)相比，它可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的量。4 Sanger 法在測(cè)定核酸序列時(shí)，反應(yīng)管中加入的 dNTP 僅標(biāo)記一種即可。5 生物芯片可以是 DNA 芯片、 cDNA 芯片或蛋白質(zhì)芯片。6 酵母雙雜交技術(shù)是分析 DNA 蛋白質(zhì)相互作用的一項(xiàng)重要技術(shù)。7 核轉(zhuǎn)移技術(shù)，是指將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體去除了胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體。8 基因矯正是用正常的基因通過(guò)體內(nèi)基因同源重組，替換致病基因來(lái)達(dá)到治療目的。9 目前基因治療多采用基因增補(bǔ)的方式。10 RNA 印跡技術(shù)中， RNA 分子在轉(zhuǎn)

12、移前需進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶切割。11 PCR 反應(yīng)中變性主要是使模板 DNA 完全變性為單鏈。12 實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)中， TagDNA 聚合酶在鏈延伸過(guò)程中遇到熒光探針，可發(fā)揮 3 ' 5 ' 核酸外切酶活性。13 酵母雙雜交系統(tǒng)可用于證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。14 轉(zhuǎn)基因技術(shù)即動(dòng)物克隆技術(shù)，是無(wú)性繁殖。15 內(nèi)源基因結(jié)構(gòu)突變發(fā)生在生殖細(xì)胞可引起惡性腫瘤。16 基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中最重要的用途是建立疾病動(dòng)物模型。17 定位克隆是指從對(duì)基因編碼產(chǎn)物的功能的了解出發(fā)來(lái)克隆致病基因。18 目前 DNA 序列分析是找出患者有關(guān)基因變異所在的最為直

13、接和確切的基因診斷法。三、填空題1 分子雜交是利用 DNA 和 這一基本性質(zhì)來(lái)進(jìn)行 DNA 或 RNA 定性、定量分析的。2 在印跡技術(shù)中，將 DNA 片段在瓊脂糖凝膠中 使其成為 ，利用 使膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到 膜上，使之成為固相化分子。3 印跡技術(shù)的基本流程依次為 、 、 和 。4 Southern blotting 主要用于 定性和定量分析，亦可用于 和 的分析。5 Northern blotting 主要用于檢測(cè) 的表達(dá)水平，敏感性較 PCR ，但其具有 和 的優(yōu)點(diǎn)。6 Western blotting 主要用于檢測(cè)樣品中 的存在、細(xì)胞中 以及 的相互作用研究等。7 PCR 的基本反

14、應(yīng)步驟包括 、 、 。8 基因芯片適用于分析不同組織細(xì)胞或同一細(xì)胞不同狀態(tài)下的 ，其原理是基于 。9 在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，被導(dǎo)入的目的基因稱(chēng)為 ，目的基因的受體動(dòng)物稱(chēng)為 。10 標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明 是否存在直接的物理結(jié)合，分析結(jié)合的 及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的 。11 染色質(zhì)免疫沉淀法是目前可以研究 與 相互作用的主要方法。12 目前克隆致病相關(guān)基因主要有 和 兩大策略。13 根據(jù)受體細(xì)胞的類(lèi)型不同，基因治療分為 的基因治療和 的基因治療兩大類(lèi)。14 目前使用的基因載體有 和 兩大類(lèi)。15 在人類(lèi)基因治療實(shí)施中，導(dǎo)入基因的方式有 和 兩大類(lèi)。四、名詞解釋1 probe2 blot

15、ting technologe3 gene libary4 核轉(zhuǎn)移技術(shù)5 gene chip6 gene therapy7 gene diagnosis8 基因疫苗9 gene inactivation10 gene replacement11 gene augmentation12 PCR13 ex vivo五、問(wèn)答題1 簡(jiǎn)述印跡技術(shù)的分類(lèi)及應(yīng)用。2 簡(jiǎn)述 PCR 反應(yīng)體系的基本成分、 PCR 的基本反應(yīng)步驟和主要用途。3 簡(jiǎn)述 PCR 技術(shù)的基本原理。4 簡(jiǎn)述逆轉(zhuǎn)錄 PCR 、原位 PCR 和實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)的基本原理和主要區(qū)別。5 簡(jiǎn)述 DNA 鏈末端合成終止法（ Sanger 法）測(cè)

16、序的基本原理。6 簡(jiǎn)述基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用。7 簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。8 試述染色質(zhì)免疫沉淀法基本原理及用途。9 簡(jiǎn)述基因診斷的概念及特點(diǎn)。10 何為基因治療，目前基因治療有哪些基本策略？11 試述基因治療的基本程序。12 欲生產(chǎn)一種藥用多肽，科學(xué)家已經(jīng)將此多肽的基因與某真核表達(dá)質(zhì)粒重組在一起。請(qǐng)你設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，利用 PCR 方法鑒定此重組表達(dá)質(zhì)粒是否含有這一多肽的基因。13 請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)從某一癌組織中提取、純化的一種未知蛋白質(zhì) X 與兩種已知蛋白質(zhì) a 、 b 之間是否有相互作用。14 請(qǐng)為某一單基因遺傳?。ǖ捅磉_(dá)或不表達(dá)）的患者設(shè)

17、計(jì)一個(gè)基因治療方案。參考答案一、選擇題（一）A型題1 B 2 C 3 D 4 E 5 B 6 D 7 B 8 A 9 D 10 A 11 D 12 C 13 B 14 E 15 D 16 C 17 C 18 A 19 D 20 A（二）B型題1 D 2 B 3 C 4 E 5 B 6 C 7 A 8 D 9 E 10 C 11 A 12 D 13 B 14 C 15 E 16 C 17 A 18 D（三）X型題1 ABCD 2 ABCDE 3 ABCDE 4 ACE 5 ABD 6 ABCDE 7 ABC 8 ABDE 9 BCD 10 BD 11 ACD 12 BCDE 13 AB 14 A

18、BCD 15 ACD二、是非題1 B 2 B 3 A 4 A 5 A 6 B 7 B 8 B 9 A 10 B 11 A 12 B13 A 14 B 15 B 16 A 17 B 18 A三、填空題1 變性 復(fù)性2 變性 單鏈 毛細(xì)作用 NC3 電泳 轉(zhuǎn)移 雜交 放射自顯影或化學(xué)顯色4 DNA 重組質(zhì)粒 噬菌體5 mRNA 差 特異性強(qiáng) 假陽(yáng)性率低6 特異性蛋白質(zhì)的存在 特異性蛋白質(zhì)的半定量分析 蛋白質(zhì)分子7 變性 退火 延伸8 基因差異表達(dá)情況 雙色熒光探針雜交9 轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物10 兩種蛋白質(zhì)分子 具體結(jié)構(gòu)部位 未知分子11 體內(nèi) DNA 蛋白質(zhì)12 功能克隆 定位克隆13 體細(xì)胞 生

19、殖細(xì)胞14 病毒載體 非病毒載體15 直接體內(nèi)療法 間接體內(nèi)療法四、名詞解釋1 探針，是指帶有特殊可檢測(cè)標(biāo)記（放射性核素或其它化合物標(biāo)記）的核酸片段，它具有特定的序列，能夠與待測(cè)的核酸片斷互補(bǔ)結(jié)合，因此可用于檢測(cè)核酸樣品中特定的基因。2 印跡技術(shù)，是指將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移或直接放在固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。它包括 DNA 印跡技術(shù)、 RNA 印跡技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)等。3 基因文庫(kù)，是指一個(gè)包含了某一生物體全部 DNA 序列的克隆群體?；蛭膸?kù)可以分為基因組 DNA 文庫(kù)和 cDNA 文庫(kù)。4 核轉(zhuǎn)移技術(shù) ， 即所謂動(dòng)物整體克隆技術(shù)，是指將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體去除了胞

20、核的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體。這樣的個(gè)體所攜帶的遺傳性狀僅來(lái)自一個(gè)父親或母親個(gè)體，因而為無(wú)性繁殖。從遺傳角度上講，是一個(gè)個(gè)體的完全拷貝，故稱(chēng)之為克隆。5 基因芯片，又稱(chēng) DNA 微陣列，包括 DNA 芯片 (DNA chip) 和 cDNA 芯片 (cDNA chip) ，是指將許多特定的 DNA 片段或 cDNA 片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。6 基因診斷，是指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基

21、因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。7 基因治療，從廣義上講，是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。8 基因疫苗 ， 主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其將編碼外源性抗原的基因插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中，直接導(dǎo)入人體內(nèi)，抗原基因在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，達(dá)到治病或防病目的。9 基因失活，是指將特定的序列導(dǎo)入細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，已達(dá)到治療疾病的目的。10 基因置換，是指用正常的基因通過(guò)體內(nèi)基因同源重組，原位替換致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的 DNA 完全恢復(fù)正常狀態(tài)。11 基因增補(bǔ)，是指將目的基因?qū)?/p>

22、病變細(xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異?；颍ㄟ^(guò)目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)缺陷基因的功能或使原有的功能增強(qiáng)。12 聚合酶鏈反應(yīng)，指以 DNA 分子為模板，以一對(duì)與模板序列相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在 DNA 聚合酶的作用下，完成新的 DNA 的合成，重復(fù)這一過(guò)程使目的 DNA 片段得到擴(kuò)增。這一技術(shù)可以將微量目的 DNA 片段擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上。13 間接體內(nèi)療法，是指在體外將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，再將這種基因修飾過(guò)的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使帶有外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，已達(dá)到治療的目的。五、問(wèn)答題1 簡(jiǎn)述印跡技術(shù)的分類(lèi)及應(yīng)用。答：印記技術(shù)是指將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移或直接放在

23、固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。它主要包括 DNA 印跡技術(shù) (Southern blot) 、 RNA 印跡技術(shù) (Northern blot) 和蛋白質(zhì)印跡技術(shù) (Western blot) 等。DNA 印跡技術(shù)主要用于基因組 DNA 的定性和定量分析，例如對(duì)基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，此外亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。RNA 印跡技術(shù)主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異 mRNA 的表達(dá)水平，也可以比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，也叫免疫印跡，用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。2. 簡(jiǎn)述 PCR

24、 反應(yīng)體系的基本成分、 PCR 的基本反應(yīng)步驟和主要用途。答：組成 PCR 反應(yīng)體系的基本成分包括模板 DNA 、特異性引物、耐熱性 DNA 聚合酶、 dNTP 以及含有 Mg 2+ 的緩沖液。PCR 的基本反應(yīng)步驟包括：(1) 變性：將反應(yīng)體系加熱至 95 ，使模板 DNA 完全變性為單鏈，同時(shí)因物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以消除。(2) 退火：將溫度下降至適宜溫度使引物與模板結(jié)合。(3) 延伸：將溫度升至 72 ， DNA 聚合酶以 dNTP 為底物催化 DNA 的合成反應(yīng)。PCR 主要用途： (1) 目的基因的克隆； (2) 基因的體外突變； (3)DNA 和 RNA 的微量分析

25、； (4)DNA 序列測(cè)定； (5) 基因突變分析。3 簡(jiǎn)述 PCR 技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。答 。這種變性 - 復(fù)性 - 延伸的過(guò)程就是一個(gè) PCR 循環(huán)， PCR 就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。主要用于目的基因的克隆、基因的體外突變、 DNA 和 RNA 的的微量分析、 DNA 序列測(cè)定和基因突變分析等。4. 簡(jiǎn)述逆轉(zhuǎn)錄 PCR 、原位 PCR 和實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)的基本原理和主要區(qū)別。答：逆轉(zhuǎn)錄 PCR 是將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。即首先以 RNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成 cDNA ，再以后者為模板通過(guò) PCR 反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增目的基因。原位 PCR

26、 是在固定液固定、石蠟包埋的組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的 PCR 反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè) DNA 或 RNA 是否在該組織或細(xì)胞中存在。實(shí)時(shí) PCR 的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分子，并使熒光信號(hào)強(qiáng)度與 PCR 產(chǎn)物量成正比，對(duì)每一反應(yīng)時(shí)刻的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，計(jì)算出 PCR 產(chǎn)物量。根據(jù)動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)，可以精確計(jì)算出樣品中最初的含量差異。逆轉(zhuǎn)錄 PCR 與傳統(tǒng) PCR 相比，將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)聯(lián)合起來(lái)，可以對(duì)已知序列的 RNA 進(jìn)行定性及半定量分析。常規(guī) PCR 或 RT-PCR 技術(shù)的產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位原位，因而不能與特定的組織細(xì)胞

27、特征表型相聯(lián)系，原位 PCR 技術(shù)可以將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合。實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)與傳統(tǒng) PCR 反應(yīng)相比，在常規(guī)正向和反向引物之間，增加了一特殊引物作為探針。該技術(shù)可以通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾。5. 簡(jiǎn)述 DNA 鏈末端合成終止法（ Sanger 法）的基本原理。答： DNA 鏈末端合成終止法基本原理是：將 2 ' ， 3 ' - 雙脫氧核苷酸 (ddNTP) 代替部分 dNTP 作為底物摻入到新合成的 DNA 鏈中，由于 ddNTP 缺乏 3 ' -OH ，一旦 ddNTP 摻入到 DNA 鏈中，就不能與下一核苷酸形成磷酸二

28、酯鍵，因此合成反應(yīng)終止。測(cè)定時(shí)，首先將模板分為四組，每一組分別加入引物和 DNA 聚合酶及由 32 P 或 35 S 標(biāo)記的 dNTP ，啟動(dòng) DNA 合成，一定時(shí)間后，每一組加入四種 ddNTP 中的一種，就可以獲得在不同部位終止的、長(zhǎng)短不同的 DNA 鏈，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，通過(guò)反射自顯影就可以讀出 DNA 的序列。6. 簡(jiǎn)述基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用。答：基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中最重要的用途是建立疾病動(dòng)物模型。以往的遺傳疾病動(dòng)物模型主要是自然發(fā)生或用化學(xué)藥物、放射誘導(dǎo)等方式獲得?；蜣D(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)為直接建立動(dòng)物模型提供了有效的手段。這些模型可用于探討

29、疾病的發(fā)生機(jī)制，更重要的是可作為新的治療方法和新的藥物的篩選系統(tǒng)。建立動(dòng)物模型： (1) 單基因決定疾病模型：應(yīng)用基因剔除模擬基因失活，如動(dòng)脈硬化癥疾病模型。 (2) 多基因決定疾病模型7 簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。答：酵母雙雜交系統(tǒng)目前已成為分析細(xì)胞內(nèi)未知蛋白相互作用的主要手段之一。該技術(shù)是基于酵母轉(zhuǎn)錄激活因子 GAL4 分子的 DNA 結(jié)合區(qū) (BD) 和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的活性區(qū) (AD) 被分開(kāi)后將喪失對(duì)下游基因的激活作用，但 BD 和 AD 分別融合了具有配對(duì)相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子后，就可以依靠所融合的蛋白質(zhì)分子之間的相互作用而恢復(fù)對(duì)下游基因的表達(dá)激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)可以用于

30、(1) 證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)； (2) 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基； (3) 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與 BD 基因融合成為 “ 誘餌 ” 表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選 AD 基因融合的 “ 獵物 ” 基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。8 試述染色質(zhì)免疫沉淀法基本原理及用途。答：染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)是目前可以研究體內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。該法可以研究蛋白質(zhì)與 DNA 在染色質(zhì)狀態(tài)下的相互作用，闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下用化學(xué)交聯(lián)試劑固定蛋白質(zhì) -DNA 復(fù)合物，并將其隨

31、機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，再利用 PCR 技術(shù)特異性的富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。9 簡(jiǎn)述基因診斷的概念及特點(diǎn)。答：基因診斷是指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法?；蛟\斷與其他診斷方法相比，基因診斷的方法特點(diǎn)是：（ 1 ）針對(duì)性強(qiáng)，以基因作為檢查材料和探察目標(biāo)，屬于 “ 病因診斷 ” 。（ 2 ）特異性強(qiáng)，用分子雜交技術(shù)選用特定基因序列作為探針，故有很高的特異性。（ 3 ）靈敏度高，所用技術(shù)具有放大效應(yīng)，故診斷靈敏度高（ 4 ）適

32、用性強(qiáng)，診斷范圍廣。10 何為基因治療，目前基因治療有哪些基本策略？答：從廣義上講，是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法，均謂之基因治療。(1) 缺陷基因精確的原位修復(fù) 包括對(duì)致病基因的突變堿基進(jìn)行矯正的基因矯正和用正常基因通過(guò)重組原位替換致病基因的基因置換。這兩種方法是對(duì)缺陷基因精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變，是最為理想的治療方法，但技術(shù)上目前尚未突破。(2) 基因增補(bǔ) 是指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異?；颍ㄟ^(guò)目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)缺陷基因的功能或使原有的功能增強(qiáng)。目前基因治療多采用此法。(3) 基因失活 是指將特定的序列導(dǎo)入細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，已達(dá)到治療疾病的目的。(4) 基因疫苗 主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其將編碼外源性抗原的基因插入到真核表達(dá)質(zhì)粒中，直接導(dǎo)入人體內(nèi)，抗原基因在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，達(dá)到治病或防病目的。11 試述基因治療的基本程序。答：基本程序如下：(1) 治療性基因選擇 選擇對(duì)疾病有治療作用的特定目的基因。(2) 基因載體的選擇 有病毒載體和非病毒載體，常用的是病毒