PCR技術(shù)檢測(cè)種傳植病細(xì)菌研究進(jìn)展

1、PCR 技術(shù)檢測(cè)種傳植病細(xì)菌研究進(jìn)展 ¹張 卉 1、 2趙廷昌 1李景富 2孫福在 1劉學(xué)敏 2回文廣 1張濤濤 3(11中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 10009421東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 31北京市農(nóng)林科學(xué)院植保環(huán)保研究所 摘要 本文綜述了 PCR 技術(shù)在種傳植病細(xì)菌檢測(cè)方面近年來的研究進(jìn)展?fàn)顩r , 對(duì)各種檢 測(cè)方法進(jìn)行了比較詳細(xì)的介紹 , 著重闡述了種類 、 原理 、 靈敏度等方面的研究進(jìn)展 。關(guān)鍵詞 PCR 種傳病害 細(xì)菌 檢測(cè)種傳病害為通過種子攜帶傳播的一類植 物病害 1。病原 體可以 存在于 用于 播種材 料的表面、 內(nèi)部或內(nèi)外兼存 , 有的則

2、以病原體 直接混在種子之間。地 球上 90%左右的食用作 物是以種子 繁殖的 , 這些 作物均受 種傳病害 的侵害 2。 種帶病原是很多農(nóng)作物病害的重要初侵染源 之一 , 是引起作物在田間和在貯藏期發(fā)病的 禍根。種子攜帶并傳播病害是很多地區(qū)發(fā)生 新病害的原因。種傳細(xì)菌性病害有 74種以 上 3, 理論上任何植物病原細(xì)菌都有可能由 種子 傳 播。 菜 豆 暈 疫 病 (Pseudomonas sy-r ingae pv. phaseolicola , 116萬粒種子中若 有一粒帶菌則可使菜豆暈疫病發(fā)生流行造成 生 產(chǎn) 上的損失 4、 5。因此 , 加強(qiáng)種 子檢測(cè)以 減少、 減輕病害的發(fā)生是十分重

3、要的。下面 對(duì) PCR 技術(shù)在種傳細(xì)菌檢測(cè)方面進(jìn)行較為 詳細(xì)介紹。1PC R 技術(shù)在種傳細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用 M ullis 等 6在 1985年創(chuàng)立的 PCR 方法 已成為分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的經(jīng)典試驗(yàn) 方法。此法靈敏、 準(zhǔn)確、 方便、 快速 , 可在短時(shí) 間內(nèi)擴(kuò)增 出數(shù) 百萬 個(gè)特 異 DNA 序列 的拷 貝 , 目前研究人員已在檢測(cè)種子帶菌方面應(yīng) 用 PCR 技術(shù)做了大量工作 , 設(shè)計(jì)得到了大量 相關(guān)引物。例如 , 用于檢測(cè)菜豆暈疫病的引 物 7, 檢測(cè)番茄細(xì)菌性潰瘍病 (CMM 的引物 等。多種以 PCR 為基礎(chǔ)的分析 方法 , 比如 , 以 rDNA 為模 板 的 PCR:ITS -P

4、CR 、 tRNA -PCR 等都已經(jīng)出現(xiàn) , 利用特異引物的新方法 使細(xì) 菌 性 病害 檢 測(cè) 能 力 得 到 加 強(qiáng)。根 據(jù) PCR 所擴(kuò)增模板特點(diǎn)將 PCR 檢測(cè)方法分類 如下。111用特定基因和 DNA 序列鑒定病害 11111以致病性基因做目的片段使用特異引物 PCR 擴(kuò)增與已知細(xì)菌致 病性相關(guān)的片段來檢測(cè)和鑒定病害是很有效 的。例如 , 土壤桿菌屬細(xì)菌 (Agrobacter ium 含有的染色體基因很復(fù)雜 , 可誘發(fā)很多病害 , 這些病害的明顯癥狀是由根瘤誘導(dǎo)質(zhì)?；蚋?誘導(dǎo)質(zhì)粒的存在引起的。測(cè)得這些質(zhì)?；?序列 , 再找到相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增得到特異片 段 , 達(dá)到檢測(cè)目的。 H

5、aas 等以高度保守的毒 性 D2基因的 內(nèi)切核酸酶編碼區(qū) 設(shè)計(jì)引物 , 特異性地檢測(cè) Agr obacter ium 病原菌系。有 的引物可以用來擴(kuò)增出編碼果膠酶的 434bp 的片 段 , 這 一 片 段 與 軟 腐 病 菌 (Erw inia carotovora 引起的軟 腐病相 關(guān)。有 的引物¹北京市自然科學(xué)基金 (6012017 、 國家 863(2001AA249051 和十五攻關(guān)資助項(xiàng)目 收稿日期 :2002-11-07, 2003-03-21修回甚至根據(jù)控制果膠酶基因的不同序列可專一 性鑒定亞種。包括黑腐變種 (E. carotovor a pv. atr osep

6、 tia 、軟 腐 亞 種 (E. carotovor a subsp. carotovora 、山俞菜亞 種 (E. caro -tovora subsp. w asabiae , 但不包括其它歐氏 桿菌 (Erwinia 種。還有的引物可以檢測(cè)出 馬鈴 薯軟腐 病病原 菌 (E. chrysanthem i 。 目前 , 乙烯形成酶 (efe 基因 8, 冠毒素生物 合成基因 9都已被用作目 的基因來 檢測(cè)病 害。11112無特性 DNA (Anonymous -DNA 作 為擴(kuò)增目標(biāo)無特性 DNA 序列也可被用于設(shè)計(jì) PCR 引物。經(jīng)常可以用某一物種 中特有的 DNA 片段作為目標(biāo)片段將

7、其專一性地鑒定出來 , 這樣的 DNA 片 段序 列就 可以 用 于設(shè) 計(jì)專 一、 靈敏的 PCR 基礎(chǔ)上的檢測(cè)方案。這樣的 無特性 DNA 包括克隆的 RAPD 片段、 克隆 的 rep -PCR 片段、 負(fù)雜交片段、 插入元素和無 特性探針。但是這種目標(biāo)序列對(duì)用于長期檢 測(cè)可能不理想 , 因?yàn)閷?duì)無特性目標(biāo)序列的可 變性 , 穩(wěn)定性的研究工作進(jìn)行的還很少。 11113質(zhì)粒 DNA 作為擴(kuò)增模板需要注意 的問題是 , 同無特性 DNA 作 目的片段相類似的 , 除致病性特點(diǎn)外 , 還要考 慮質(zhì)?；蜃鳛槟康钠蔚姆€(wěn)定性。在有些 情況下還要考察某一引物的適用范圍。舉例 來講 , 對(duì)于一個(gè)病原物種

8、的檢測(cè)有時(shí)只能檢 測(cè)到其中一部分 , 因?yàn)槠浞N內(nèi)有些毒性菌系 不含目的質(zhì)粒。對(duì)黃單胞桿菌屬引起的菜豆 疫病的檢測(cè)就是這樣。有的 引物 10只能檢 測(cè)到番茄潰瘍病菌 (Clavibacter michigane -sis subsp. m ichiganensis 中 75%的 菌 系。 根據(jù)質(zhì)粒 Pcsl 設(shè)計(jì)的類似啟動(dòng) 子序列的引 物對(duì)檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病中有質(zhì)粒的菌系具有 專一性 , 但對(duì)質(zhì)粒 缺乏菌系 就檢測(cè)不 到了。 但一套根 據(jù)馬 鈴薯 環(huán)腐 病 (C. m. subsp. sep edonicus 質(zhì)粒衍生物設(shè)計(jì)的特異性引物 可以檢 測(cè)到所有 C. m. subsp. sep edon

9、icus 菌系 , 包括一個(gè)用其它引物檢測(cè)不到的可能 不含質(zhì)粒 的菌系。一種根據(jù) pEA29質(zhì)粒序 列設(shè)計(jì)的引物可專一敏感的檢測(cè)梨火疫病菌 (Erw inia amylovora 。所有 的被檢 菌系都 含有這一目標(biāo) DNA 。這種質(zhì)粒也許與適應(yīng) 性有關(guān) , 因此能夠在自然生長的梨火疫病病 菌中存留下來。最后還有一種情況 11, 在沒 有詳細(xì)闡述基因及其產(chǎn)物的情況下 , 根據(jù)木 薯枯萎病 (X . c. pv. manihotis (一種世界 范圍的檢疫對(duì)象 中與致病性相關(guān)的質(zhì)粒片 段設(shè)計(jì)引物 , 從 107個(gè)菌系中都可以得到一 個(gè)特異的 895bp 的 PCR 片段 , 而在 5種木薯 枯萎

10、病菌的非致病菌系及一些與這種黃單胞 近緣的或與木薯相關(guān)的其它腐生菌都沒有擴(kuò) 增產(chǎn)物。所以質(zhì)粒 DNA 可作為一種可靠的檢測(cè) 和鑒定病害相關(guān) 的病原物 的檢測(cè) 目標(biāo)。當(dāng) 然 , 掌握目標(biāo)質(zhì)粒 DNA 的本 質(zhì)特征和持久 性將對(duì)利用質(zhì)粒 DNA 檢測(cè)方案的長期的可 靠性大有裨益。112以 rDNA 為模板的 PCR 分析 11211rDNA -PCR根據(jù)不同細(xì)菌的 rDNA 的不同特征有很 多不同方案來對(duì)它們進(jìn)行描述區(qū)分。個(gè)別的 細(xì)菌可能含有 1(支 原菌 到 14(梭菌屬 個(gè) rRNA 基因組 , 這些基因組不 一定都是同源 的。根據(jù) DNA 保守區(qū)段設(shè)計(jì)的引物可用于 從一個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育不同的細(xì)

11、菌范圍中擴(kuò)增 核糖體基因片段。已有充分的事實(shí)說明植物病原細(xì)菌當(dāng)中 由基因?qū)е碌?rDNA 特異序列的存在 , 并針 對(duì)假單胞桿菌屬、 黃單胞桿菌屬和許多檢疫 對(duì)象設(shè)計(jì)了相關(guān)引物。 Widmer 等用一套具 有高度選擇性的引物得到了假單胞桿菌 16s rRNA 的基因片段?，F(xiàn)已證明用這些引物對(duì) 土壤假單胞桿菌的純 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增是 能夠有效的得到目的片段的。 Maes 等推出 一套能夠擴(kuò)增一個(gè)對(duì)黃單胞桿菌特異的 480 -bp 的片段引物 , 通過結(jié)合一個(gè)通用的 16s rDNA 引物和一個(gè)對(duì)黃單胞桿菌特異的反向 引物能夠檢測(cè)小麥種子上的黃單胞桿菌。 T akeuchi 等 12測(cè)得

12、 6種布克氏菌和另 外兩種相關(guān)細(xì)菌種的 16s 和 23s rRNA 基因 間的整個(gè)區(qū) 間序列并具此 ITS 帶設(shè)計(jì)了專 一性引物來檢測(cè)水稻苗期病害的菌原物水稻 谷枯病菌 (B. plantar ii 和水稻 苗枯 病菌 (B. glumae 。 最近有人利用 16s rRNA 基因 中單堿基對(duì)變異連接酶連式反應(yīng)來特異性的 檢測(cè) 斯氏細(xì)菌性萎蔫病病原 Pantoea (Er-w inia stew artii 。rRNA 基因已被用來作為檢測(cè)目的基因 的 DNA 的高度敏感目標(biāo)基因 , 但其區(qū)分能 力目前還在種或?qū)俚乃缴?。很?PCR 引 物的特性使它們對(duì)其它 PCR 方案都很適用 , 象特

13、異性很高的 ITS -PCR 。11212IT S -PCR:轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) -PCRITS -PCR 分析利用根據(jù)保守 16s 及 23s 核糖 體 設(shè) 計(jì) 的 引 物 來 擴(kuò) 增 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū) (ITS 。在 16s 及 23s rRNA 基 因間 的 ITS 區(qū)間可能包括一些 tRNA 基因和一些未編碼 區(qū) , 因此較 16s 和 23s rRNA 基因本身變異要 大。用通用引物進(jìn)行 ITS -PCR 時(shí)可以根據(jù) PCR 產(chǎn)物 的數(shù) 量和 長度 檢測(cè) 和區(qū) 分細(xì) 菌。 如果從一種細(xì)菌中擴(kuò)增出的條帶有變化 , 應(yīng) 是由不同 rDNA 長度變異引起的。實(shí)際上在 多 rDNA 基因組中 DN

14、A 的變異程度與近源 菌系間的變異程度相等?？梢酝ㄟ^限制性酶 切分析 ITS -PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物或分析 ITS 擴(kuò)增 產(chǎn)物的 DNA 序列來增強(qiáng)特異性。Kim 和 Sony 13鑒定了 7種水稻病害病 原菌 , 包括假單胞菌屬、 黃單胞桿菌屬和歐氏 桿菌屬中的種。方法是 :先用通用引物擴(kuò)增 , 獲得 16s 和 32s rRNA 基因 ITS -PCR 產(chǎn)物 , 然后設(shè)計(jì)特殊引物專一性的擴(kuò)增 ITS 區(qū)。 113tDNA -PCRtRNA -PCR 方 法 是 利 用 了 tRNA -PCR 基因的固 有特性 , tRNA 基因常位于 16s 和 23s rRNA 基因的 ITS 帶或細(xì)菌 5

15、s rRNA 基 因末端。從被擴(kuò)增區(qū)段外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物對(duì) tRNA 基因進(jìn)行擴(kuò) 增 , 得到不 同大小的擴(kuò)增 產(chǎn)物的指紋圖譜 , 不同產(chǎn)物的產(chǎn)生就是由屬 或種的特異性造成的。 Pan 等結(jié)合 tRNA 引 物 Ala4和 ITS 的通用引 物 L1, 從甘蔗白條 病中擴(kuò)增一個(gè)用于檢測(cè)的 360bp 的片段 , 可 以在待測(cè)樣品中含 15CFU 的情況下檢出 病原物。2與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合的 PCR 檢測(cè)方法 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)及動(dòng)物醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的不斷發(fā) 展促進(jìn)了血清學(xué)技術(shù)用于植物病原細(xì)菌的檢 測(cè)研究。應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)植物病原細(xì)菌 發(fā)展至今 , 對(duì)于植物病原細(xì)菌的檢測(cè)已是一 種較 為 成 熟的 技 術(shù)。目

16、 前 血 清 學(xué) 技 術(shù) 與 PCR 相結(jié)合應(yīng)用于病原細(xì)菌的檢測(cè) , 提高了 檢測(cè)的靈敏度。主要有兩個(gè)大的方向 :211免疫 PCR (Immuno -PCR免疫 PCR 技術(shù)是 1992由 Sano T. 等 14最早使用的。該技術(shù)將血清學(xué)中抗原 -抗體 反應(yīng)的特異性與 PCR 的強(qiáng)特異擴(kuò)增能力結(jié) 合起來 , 可以在短時(shí)間內(nèi)精確的檢測(cè)某一病 原物是否存在。免疫 PCR 的原理是 :用一段 具體的 DNA 分子標(biāo)記抗體 , 應(yīng)用此抗體去 檢測(cè)抗原 , PCR 擴(kuò)增此段 DNA 分子 , 根據(jù)擴(kuò) 增產(chǎn)物存在與否判斷抗原是否存在。一般的 操作過程是 :在酶聯(lián)板內(nèi)包被用于捕獲抗原 的抗體 , 加 待

17、檢 抗原 , 再 加 DNA 標(biāo)記 的抗 體 , 然 后 PCR 擴(kuò) 增 抗 原 抗 體 復(fù) 合 物 上 的 DNA 片段 , 根據(jù) 電泳結(jié)果 判斷抗原 存在情 況。此種做法類似于 ELISA 中的雙抗體夾 心法。根 據(jù) 反應(yīng) 物 的不 同 , 目 前可 將 免疫 PCR 分為單分析物免疫 PCR 、 多分析物免疫 PCR 、 單引物免疫 PCR 、 和雙引物免疫 PCR 。 212免疫磁性分離 -PCR (IMS -PCR 磁性免疫微球 (immunomagnetic micro -sphere -IMM S 是近年發(fā)展起來的一類新型 功能性材料 , 它是磁性微球載體表面通過化 學(xué)或物理方法

18、連接上具有一定免疫活性的物 質(zhì)作為配體而研制成的。由于磁性微球粒徑 一般很小 , 比表面積大 , 故而偶聯(lián)容量較高 , 懸浮穩(wěn)定性較好 , 便于各種反應(yīng)高效而方便 的進(jìn)行 ; 又因其具有順磁性 , 在外電場(chǎng)的作用 下固液相的分離十分簡(jiǎn)單 , 可省去過濾、 離心 等繁雜操作 , 并可在磁場(chǎng)作用下定位 , 方便地 進(jìn)行分離同配體相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。目前免疫磁 性分離技術(shù)已應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記、 細(xì)胞分離、 臨 床 PCR 檢測(cè) 等方面 1516。應(yīng)用于 種子帶 菌檢測(cè)的具體做法是 :包括于 IM MS 上的抗 體選擇性吸附目標(biāo)菌 , 洗掉未吸附的污染物 (土壤顆粒、 植物殘?jiān)头悄繕?biāo)菌 ; 然后對(duì)目 標(biāo)菌擴(kuò)增

19、培養(yǎng) (此步也可省略 , 進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增目的片段 , 根據(jù)所得結(jié)果判斷目標(biāo)菌是否 存在。 IMS -PCR 的特點(diǎn)是對(duì)目 的菌進(jìn)行了 二步檢測(cè) , 一是血清的作用 , 二是 PCR 的作 用。這樣在保證了檢測(cè)速度的情況下 , 提高 了檢測(cè)的可靠性。在檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病 的試驗(yàn)中 R. R. Walcott 等證明了 IM S -PCR 的靈敏度 比直接 PCR 高 100倍 , 而 且不受 PCR 抑制因子的影響。3展望隨著國際貿(mào)易自由化程度不斷加深 , 國 際間農(nóng)產(chǎn)品的交易日漸頻繁 , 種子的進(jìn)出口 檢疫工作顯得日益重要。在這一方面 , 我國 著實(shí)應(yīng)當(dāng)向發(fā)達(dá)國家學(xué)習(xí) , 加強(qiáng)種子檢疫

20、研 究。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法 , 如 :解剖檢測(cè)法、 洗滌 檢測(cè)法、 分離培養(yǎng)檢測(cè)法、 熒光反應(yīng)檢測(cè)法、 化學(xué)染色檢測(cè)法、 噬菌體檢測(cè)法、 生物測(cè)定檢 測(cè)法、 離體培養(yǎng)檢測(cè)法等 , 操作相對(duì)粗放 ; 精 確度低 ; 耗時(shí)長 ; 靈敏度差 ; 需要多種方法配 合使用。而電鏡檢測(cè)、 實(shí)時(shí) PCR (RT -PCR 等精度較高、 速度快 (RT -PCR 可以在采集到 樣品之后的 1個(gè)小時(shí)內(nèi)得出可靠檢測(cè)結(jié)果 的方法 , 一方面儀器設(shè)備昂貴 , 另一方面對(duì)操 作人員的技術(shù)水平要求也較高 , 如直接應(yīng)用 到實(shí)踐中還存在一定困難?？茖W(xué)的發(fā)展尤其 是免疫學(xué)和分子生物學(xué)日新月異的進(jìn)步 , 將 使用于檢測(cè)種傳植物病原

21、細(xì)菌的方法不斷突 破舊的局限 , 使新的、 適應(yīng)不同需要的方法層 出不窮。目前 , 我們正在用免疫磁性分離法 針對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病種子帶菌情況進(jìn)行研 究 , 用全菌體抗原和膜蛋白抗原制備抗體 , 得 到了效價(jià)分別為 640和 1280(試管凝集法 的抗血清 , 為后繼工作打下了基礎(chǔ)。總的來 說新的分析 手段將向 短時(shí)間、 高精度、 自動(dòng) 化、 微量化、 盡量減少人為因素的方向發(fā)展 , 這無疑會(huì)給不同檢測(cè)目的的需要不斷提供更 合適的方法。然而任何一種方法都有其適用 范圍 , 對(duì)于不同目標(biāo)的檢測(cè) , 得到靈敏度、 可 靠性和高效性的最優(yōu)組合 , 制訂標(biāo)準(zhǔn)化方案 , 仍是我們面臨的重要問題。參考文獻(xiàn)

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