釀酒酵母附加型分泌表達(dá)載體pYES2_CT_factor的構(gòu)建及鑒定

1、#China B btechnobgyVol 29 Nq 12 2009p¥ES2/CT/ factor胡亞冬姚冬生(】廣州科仁生物工程有限公司 廣州510600)2聲南大學(xué)微生物技術(shù)研究所 廣州510632)以PPE9為模板.通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得釀酒酵母的a咬配因子(a -fact)r) .#克隆至釀酒酵 母胞內(nèi)表達(dá)載體PYES2/CT中.構(gòu)建了一種新型釀酒酵母附加型分泌表達(dá)載體pYES2/CTQ factor(pYG )。再將甘露聚糖酶基因(mannase, man)通過(guò)酶切、連接克隆至pYG的CfacE的下 游構(gòu)建了 pYOman重組載體檢驗(yàn)pYOi的分泌性能和穩(wěn)定性。結(jié)果顯示c

2、i faclDr可引導(dǎo)甘露 聚糖酶基因在胞外分泌表達(dá)在曲利本蘭培養(yǎng)基上形成明顯的水解圈進(jìn)一步分析重組菌胞外和 胞內(nèi)酶活.結(jié)果顯示對(duì)照NVScl/pYQ的兩種酶活都未檢測(cè)到而NVScl/pYOman具有明顯 的胞外酶活未檢測(cè)到胞內(nèi)酶活說(shuō)明構(gòu)建的pYOi具有良好的分泌性能:穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明重組質(zhì) 粒連續(xù)培養(yǎng)150 h仍具有良好的穩(wěn)定性。釀酒酵母信號(hào)肽分泌表達(dá)Q782© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, #China B btechnobgyVol 29 Nq

3、12 2009© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 51China B btechnobgyVol 29 Nq 12 2009釀酒酵母(Sacchantn yces ceivvisiae)是一種最簡(jiǎn)單 的單細(xì)胞真核生物但和其他復(fù)雜真核生物一樣擁有 很多細(xì)胞器結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜的翻譯后修飾功能再加上 易培養(yǎng)的特性釀酒酵母被用作研究真核生物的模式 生物它的遺傳背景和生理特性也日益清晰。因其具 有翻譯后修飾功能.自上世紀(jì)80年代Hi(zanann-tf次 利用釀酒酵

4、母表達(dá)人干擾素基因獲得成功后，許多來(lái) 源于真核生物的蛋白在釀酒酵母中獲得活性表達(dá)。釀 酒酵母因其清晰的遺傳背景和培養(yǎng)易控制的優(yōu)點(diǎn).還 是定向進(jìn)化研究常用的真核表達(dá)宿主，2 J，o定向進(jìn)化 研究中重組子篩選是其中一個(gè)關(guān)律環(huán)節(jié)篩選方法的 簡(jiǎn)便和快速?zèng)Q定了定向進(jìn)化的成敗。顯然胞內(nèi)表達(dá) 不適合定向進(jìn)化的需要而胞外分泌表達(dá)不僅可簡(jiǎn)化 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化從而簡(jiǎn)化篩選過(guò)程還能使重組 蛋白得到正確修飾和防止外源蛋白在胞內(nèi)被蛋白酶水 解有助于宿主菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高表達(dá)產(chǎn) 量4因此胞外分泌表達(dá)相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)來(lái)說(shuō)是一種更收稿日期：2009-08-13 修回日期：2009-10-20國(guó)家十一五"863

5、劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2OO7AA100605)助項(xiàng)目-通訊作者電子信箱ldsyaojnu cdu cn 好的外源蛋白表達(dá)途徑。目前常用的商用釀酒酵母表達(dá)載體主耍如 Iiiviliogen公司的pYES系列、pYC系列和ATCC的YEP 系列、pBT系列等.但這些載體全部為胞內(nèi)表達(dá)載體.不 適應(yīng)胞外分泌表達(dá)的需耍。而穩(wěn)定、分泌性能好的附 加型表達(dá)載體是定向進(jìn)化的車(chē)耍工具。因此本研究 以釀酒酵母胞內(nèi)表達(dá)載體PYES2/CT為構(gòu)建基礎(chǔ).選擇 來(lái)源干釀酒酵母的Q交配因子即a仏5為信號(hào)肽.將 之克隆至PYES2/CT上.以構(gòu)建釀酒酵母附加型分泌表 達(dá)載體得到一種高效的分泌表達(dá)系統(tǒng)為外源蛋白在 釀酒酵母中的分泌表

6、達(dá)和定向進(jìn)化研究提供重要的載 體材料。大腸桿菌DHD為本實(shí)驗(yàn)室保存。乳酸克魯維酵 母(lactis GG799)和載體 pKLACl 購(gòu) 白 NEB公司，甘露聚糖酶重組質(zhì)粒pKLAClnnan (pKLinan)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。釀酒酵母尿喀噪營(yíng)養(yǎng)缺 陷型 NVScl 及質(zhì)粒 pYES2/CT. pPE9 購(gòu)自 hvitiugen 公司。PCR引物由北京奧科合成。髙保真聚合酶 phusbn購(gòu)自 Finnzjmes.限制性?xún)?nèi)切酶 Xho I . Nof I . Kpn I及Xba I購(gòu)自TO YOB A 0 T4 DNA連接酶購(gòu)自 NEB.DNA marker購(gòu)自Genscrip to膠回收試劑盒

7、、質(zhì)粒 小提試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。YNB、 半乳糖、酵母抽提物、蛋白腺、魔芋精粉和曲利本蘭均 為國(guó)產(chǎn)分析純。L 2培養(yǎng)基 YPD. YPGak SC-U的組成見(jiàn) hvitwgcn公 司操作手冊(cè)。曲利本蘭培養(yǎng)基:在sou培養(yǎng)基基礎(chǔ)上 以2%半乳糖代替2%葡萄糖.并添加Q 15叼曲利本蘭 和0. 5%的魔芋精粉。L 3factorDNA的操作、瑩組、轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)5。首先通過(guò) CaCb轉(zhuǎn)化法將pPE轉(zhuǎn)至DH口培養(yǎng)后抽提pPC9o 根據(jù)PPE9的afac"序列設(shè)計(jì)上下游引物上游引物 (GG1ACC為 Kpn 酶切位點(diǎn)):CGGGG1ACCATGAQX TTTCCTTCAATTT

8、T1ACTG.下游引物(TCTA8 為 Xba I酶切位點(diǎn))：GCTCIAGATTCGCGGCCGCCCIAGGGA ATTC.以pPL：9為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?98X： 30s: 30 cycles of(98°C 10s, 60°C 30s, 72X： 15s); 7210min.膠回收PCR產(chǎn)物。L 4 pYES2/CT/ factor( pYC )勺加和X/w取酶切afacior和pYES2/CT.雙酶切后 的p¥ES2/CT去磷酸化.去磷酸化的栽體與雙酶切后的 Cl.facsr用T4DNA連接酶連接過(guò)夜.連接產(chǎn)物用CaCk 轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸

9、桿菌DH0.對(duì)轉(zhuǎn)化于進(jìn)行質(zhì)粒抽提后 PCR鑒定.鑒定的陽(yáng)性莖組千送上海生工測(cè)序。L 5 pYES2/CT/ factorinan( pYC man)Xho I和Not I雙酶切實(shí)驗(yàn)室保存的pKLACKnaii (pKLman)質(zhì)粒獲取甘露聚糖酶基因，X/w I和Not I雙 酶切測(cè)序正確的PYO1并去磷酸化，T4 DNA連接酶連 接過(guò)夜，連接產(chǎn)物用CaCb轅化法轅化大腸桿菌 DH0 .對(duì)轉(zhuǎn)化于進(jìn)行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定。L 6按hvitiogen公司提供的說(shuō)明書(shū).用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化 釀酒酵母:按NEB公司提供的說(shuō)明書(shū)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn) 化乳酸克魯維酵母。L 7參照hvitogen使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，略有修改

10、。L 8 pYC將1. 6節(jié)所述的釀酒酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子NVScl/ pYCQ、NVScl/pYCQ "an和乳酸克魯維酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化 于 GG799 /p KLACI、GG799 /p KLm an點(diǎn)植于加有曲利本 蘭和魔芋精粉的SC-U-Gal培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)72h.觀 察水解圈產(chǎn)生情況。另外.參照文獻(xiàn)|6|.取Iml NVScl/pYOlnnan 1. 7的培養(yǎng)液離心后.上清液用于 測(cè)定胞外酶活:菌體加1ml破胞緩沖液，用消解酶( Zolyase)破胞后用于測(cè)定胞內(nèi)酶活。以NVScl/ pYCU為對(duì)照。L 9參照文獻(xiàn)6將含有莖組質(zhì)粒的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子 接種干50inl YPD液體培養(yǎng)基

11、中，30£過(guò)夜培養(yǎng)然后 取10® 1接種到50ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中30£ 培養(yǎng)過(guò)夜如此轉(zhuǎn)接培養(yǎng)50h、100h, l50h后(分別為2 次、4次、6次轉(zhuǎn)接).分別取樣稀釋涂布于YPD平板. 待長(zhǎng)出單菌落后將100個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接封尿喘嚨缺陷 型平板上.計(jì)算不能生長(zhǎng)的菌落。L 10甘露聚糖酶活力測(cè)定采用3.5二硝基水楊酸 (DNS)法測(cè)定步驟參照文獻(xiàn)7 略作改動(dòng)，底物用 (1 5%的槐豆膠代瞽0. 5%的魔芋精粉。一個(gè)酶單位定 義為600 pH5. 5條件下.每分鐘產(chǎn)生ip mol還原糖所 需的酶量。22 1factorpYES2/CT/ factor( pYC

12、 )釀酒酵母附加型分泌表達(dá)栽體PYES2/CTXI -faclr (pYGl )的構(gòu)建如圖1所示。通過(guò)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pPC9±的Cifacmr區(qū)域.獲得 Clfaclm基因.約300 bp.結(jié)果如圖2A所示。通過(guò)酶 切、連接、轉(zhuǎn)化獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子挑取克隆進(jìn)行PCR鑒 定鑒定結(jié)果如圖2B所示。對(duì)鑒定陽(yáng)性的1組于測(cè) 序測(cè)序結(jié)果與pPC9± M -factor比對(duì)(B bed it),比 對(duì)結(jié)果完全一致如圖2C所示斜體為p¥ES2/CT載 體序列.其中3端斜體(7TGA)為pYES2/CT的Xlxil 酶切位點(diǎn)；下劃線標(biāo)記為新引入的多克隆位點(diǎn).這樣 pYGl 的多克隆位點(diǎn)

13、(multpie cbnc sites.MCS)為 XhoI >SnaB I、EcoR I、AwU、No/ I 和 Xba I ；黑體為 a factor的最后一個(gè)密碼于AAT(編碼天冬酰胺)。表明 pYOl構(gòu)建成功。© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 512009.29(12) 胡亞冬等：一種釀酒酵母附加型分泌表達(dá)栽體pYES2/CTA -facin啲構(gòu)建及鑒定© 1994-2010 China Academic Journal El

14、ectronic Publishing House. All rights reserved, © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All

15、 rights reserved, bp Ml I M2 bp bp MpPICQa-l»*< pYCa apYCu upPKWti hfiirpYC a a -fcutiifpM(5> upYCa a 'Urtur圖 1 pYES2/CT/a-factor( pYCa)的構(gòu)建Fir. 1 Construction of pYESI/Cr/a-factor( pYCa)anuc numnucwiimarcuttAsaxccanianci 65 lllllllllllllllIII Illi Illi III III llllllllllllllllllllllll

16、lllluraioc cttcc nt a immricr icrminr «ur AXccrccamccTca <X1M)cc tcuuctftmariCMCiiuuccccacuaTnccaYAMCUv Mm |25 lllllllllllllll III llllllll III lllllllllllllllllllllllllllllllCC iCTUUtfTMAKACU&A1UMCWACUintCOCIUMaCV MW 91 |QTBClt lMTTTM4MC4MnKM VTU< TCnnUtmnCUM ACC AC 1MT 185 iiiiiiiii

17、iiiiii iii mi mi iii iii mi iiiiiiiiiiiiiii iii iiiiiiTBCKBHrntfAAc&UAnruiEncricnTMCArnYCMritfifAuT 9|7()MrU4TTftHCnTmMTlCIMTATMCMintfXTMMMCUOMTl 245 lllllllllllllll III lllllllllll III llllllllllllllllllllllllllllucucnsncnnnMncnc nncrcMr mccxcuAtfAACuatfii qry) itn MJKlllllllllllllll III llllll

18、ll III IIHIIIIIIIIIIIIIIIIII IIIIIITCKTtUCAlMUCMCTXMtf TUCCT&MArKCCTMCtfartCrCMTTU 9290圖2 (A)PCR制備a-factor J B)陽(yáng)性重組子的PCR鑒定JC)pYCa與pPIC9比對(duì)結(jié)果Kig. 2( A) preparation of orfactor by PCR; ( B) PCR identification of pYCa; ( C) Alignnwnt of pYCa and pPIC9(A)M1： Marker I ；1:PCR products </a-farior；M2：

19、Markrr 2( B)M：Marker；l ： DH5a/pYCal ；2：DH5a/pYCai© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2 2 pYC -manpYC man本實(shí)驗(yàn)室從假蜜環(huán)菌(A *n ilia riel la tahescens)中克 隆得到一種B甘露聚糖酶的全長(zhǎng)cdnaib,該酶的全長(zhǎng) CDNA共1481 bp.其中開(kāi)放閱讀框1338bp.編碼445個(gè) 氨基酸。在Genbank的登錄號(hào)為DQ286392。目前實(shí) 驗(yàn)室已構(gòu)建該酶的重組

20、表達(dá)載體有pPEXlAnnan和 pKLAC1 nnan(pKLman) o 利用 pYCU 和 pKLnian 共有 的酶切位點(diǎn)構(gòu)建pYOl nnanM組質(zhì)粒.構(gòu)建后的質(zhì)粒用 Xho I和No! I雙酶切鑒定陽(yáng)性(圖3)后轉(zhuǎn)化入釀酒酵 母 NVScio將 NVScI/pYCU、NVScI /pYCU nnaiN GG799/ p KLAC 1和GG799 /p KLAC 1 m an轉(zhuǎn)化子點(diǎn)植于加有曲 利本蘭和魔芋精粉的SC-U-Gal培養(yǎng)基上.連續(xù)培養(yǎng) 72h.觀察水解圈產(chǎn)生情況.結(jié)果如圖4所示.陰性對(duì)照 NVScl/pYOl和GG799/pKLACl均無(wú)水解圈產(chǎn)生，而 NVScl /pY

21、CU man和陽(yáng)性對(duì)照 GG799/pKLinan有水解 圈產(chǎn)生說(shuō)明pY與pKLACl 樣其信號(hào)肽可引導(dǎo) 甘露聚糖酶表達(dá)在胞外。進(jìn)一步分析NVScl/pYCQ- man胞內(nèi)和胞外甘露聚糖酶酶活，以NVScl/pYCU作 對(duì)照挑取克隆誘導(dǎo)培養(yǎng)至72h.同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液上清 及胞內(nèi)提取液的甘露聚糖酶酶活結(jié)果如表1所示對(duì) 照菌株胞內(nèi)提取液和胞外液酶活都未檢測(cè)到而 NVScl /pYOl "an的胞外液具有明顯的甘需聚糖酶酶 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reser

22、ved, 2009.29(12) 胡亞冬等：一種釀酒酵母附加型分泌表達(dá)栽體pYES2/CTA -facin啲構(gòu)建及鑒定#活而胞內(nèi)液酶活未檢測(cè)到。通過(guò)這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)可充分表明PYCU的Cl應(yīng)"信號(hào) 肽具有強(qiáng)而有效的分泌能力可引導(dǎo)目的蛋白分泌至 細(xì)胞外構(gòu)建的pYOl分泌載體是一種髙效的分泌表達(dá) 載體。2 3pYC pYC man把含有瑩組質(zhì)粒的酵母菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)計(jì)算 不能在SCP平板上生長(zhǎng)的克隆數(shù).來(lái)判斷質(zhì)粒的穗定 性。結(jié)果(表2)表明：質(zhì)粒在釀酒酵母中連續(xù)表達(dá)150 h.仍具有很好的穩(wěn)定性。2( n =3, x s)Table 2 Shbiihr of recon b han t ph

23、an kls ( n =3, x s)茵株贖粒Strain/phsBidSC-U平板上不能生長(zhǎng)的克隆數(shù)Cbnes not CKMvinc on the SC<I d talesOh50h100 h150 hNVScl/pYOl0 ±)0 if)1. 0 卻1. 7 如 58NVScl /pYCfl in an0 ±)0 ±)1. 3 ±). 582 3 如 58© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009.

24、29(12) 胡亞冬等：一種釀酒酵母附加型分泌表達(dá)栽體pYES2/CTA -facin啲構(gòu)建及鑒定53圖3 pYCorman Xho I和Not I雙屬切鑒定Fig. 3 Analysis of recombinant plasmids pYCorman by enzyme digestionM : Marker； I : Enzyme dijcrslion pnMlurts <( pYCa-man by Xho I an<i I圖 4 INVScl/pYCa-man 和GG799/pKLman的水解圈Fig. 4 Hydrolysis rings of INVScl/pYCa-m

25、anand GG799/ pKLmanl92： INVScl/pYCa$394： INVScl/pYCa-man；5.8： G(r799/pKLACI ； 6.7： (；G799/pKl4mm1( n = & x s)Table 1 Enzmie Acth iK anahsis of ii tracellukir andextracelhihr extiucts frail rccmibiiant yeasts( n =& x s)菌株質(zhì)粒Strain/p la sn id甘器聚糖聲聲活(U/ml)Mannase acth itv(U/ml)胞外extracelluhr胞內(nèi) i

26、n trace llu hrNVScl/pYCU00NVScl /pYCtl man 1Q 354 4ft 0570NVScl/pYGman2Q 418 卻 0370在分泌表達(dá)栽體的構(gòu)建中a是目前運(yùn)用最 廣泛的信號(hào)肽，已構(gòu)建入商業(yè)化栽體PPE (Inviliogcn )、pPFXi 系列(Invitiogen )和 pKLACl (NEB)等多種載體中并成功應(yīng)用于外源蛋白的分泌 表達(dá)對(duì)于大分子量蛋白質(zhì)同樣也可以獲得很好的分 泌效果如來(lái)源于枯草桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因(約 1. 4kb)就在畢赤酵母中獲得髙效分泌表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物 分于量為79. 82kDa，q，e由此可見(jiàn)-factor是一種強(qiáng)有 效

27、的信號(hào)肽。目前常用的商用釀酒酵母載體為胞內(nèi)表達(dá)載體. 不適合釀酒酔母胞外分泌表達(dá)和真核蛋白定向進(jìn)化研 究.在大部分以釀酒酵母為宿主的定向進(jìn)化研究中. 一種分泌表達(dá)載體PYEX-S1常被使用這個(gè)載體由 Cbntech公司開(kāi)發(fā).但目前已停止生產(chǎn)，另外它所使用 的信號(hào)肽來(lái)源于乳酸克魯維酵母(Kluyveninyces lactis).趙穎怡等將來(lái)源于克魯維酵母 (Khiyvemn yces m axianus)的菊粉歸基因的信號(hào)肽序列 克隆至iwitgen公司的pYES2栽體上構(gòu)建了一種釀 酒酵母分泌表達(dá)載體。由于這些信號(hào)肽序列并非來(lái)自 于釀酒酵母異源信號(hào)肽序列引導(dǎo)表達(dá)外源基因可能 會(huì)影響外源蛋白的

28、分泌效果。因此利用釀酒酵母本身 的a -factor構(gòu)建釀酒酵母分泌表達(dá)載體具有很大的應(yīng) 用潛力。左研究構(gòu)建的PYES2/CTH facto沖的借號(hào)肽C端 含有酔母內(nèi)切蛋口酶識(shí)別位點(diǎn)(Lys-A咚).可在分泌至細(xì) 胞外的過(guò)程中切除信號(hào)肽。利用甘露聚糖酶基因(約 1. 3kb)檢驗(yàn)構(gòu)建的分泌載體的穩(wěn)定性和分泌能力結(jié)果 充分衰明PYO1的a -facrfg號(hào)肽具有強(qiáng)而有效的分泌 能力可引導(dǎo)目的蛋白分泌至細(xì)胞外構(gòu)建的pvcn分泌 栽體是一種穩(wěn)定、高效的分泌表達(dá)載體可用于外源蛋白 在釀酒酵母中的分泌表達(dá)并為定向進(jìn)化研究提供一種 真核分泌表達(dá)系統(tǒng).更利于目的蛋白的檢測(cè)和篩選適于 定向進(jìn)化高通量表達(dá)和篩選

29、的需要OI 1 Hitzmian R A. Leung D W. Perry L J el al Secretion of hinian interfemns by yeast Science. 1983,219 : 62O625| 2 | Arnold F H Geoipbu G Directed Exolutbn Library Creation: Methods and PiuIlkoIs Tbtowa. N J. US: Hun ana Press he 200A 17 223 | MonMski B Quan S, Arnold F H. Funclbnal expressbn an

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34、加型分泌表達(dá)栽體pYES2/CTA -facin啲構(gòu)建及鑒定#© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 2009.29(12) 胡亞冬等：一種釀酒酵母附加型分泌表達(dá)栽體pYES2/CTA -facin啲構(gòu)建及鑒定#Constructbn and Determ hatfon of an Episomal Secrethg ExpressfonVector: pYES2/CTXi -foctor for Saccharom yces cerevisiaeHU Yadong ' YAO Dong-sheng*(1 Guangzhou Co-u in Bioengineermg Ca .Ltd .Guangzhou 510600.China)(2 hstituie ofMicmbial Technobgy. Jinan University. Guangzhou 510632.China)Abstract pPC9 was used as a template andQ factor gene of Sacchainnyces cerevisiae was anplified by PCR. The gene was ebned