感?？沽鞲胁《镜膶?shí)驗(yàn)研究

1、感?？沽鞲胁《镜膶?shí)驗(yàn)研究 作者：時(shí)間：2007-11-22 14:10:00 作者：申元英 楊占秋 王晶 潘云華 郭利軍 王濤 白麗 【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞培養(yǎng)【摘要】 目的 探討感?？共《镜寞熜?。方法 采用微量細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行抗病毒療效和病毒滴定。結(jié)果 感停對(duì)流感病毒的最小治療濃度為:3.25g/ml，感停對(duì)流感病毒的治療指數(shù)（therapy index，TI）為8。經(jīng)最小有效劑量感停作用后，流感病毒的滴度由10 4.3 TCID 50 /0.1ml下降為10 2.3 TCID 50 /0.1ml。結(jié)論 感停在體外對(duì)流感病毒有一定的治療作用。關(guān)鍵詞 感停 流感病毒 抗病毒實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng) 【Abstr

2、act】 Objectives To evaluate the therapeutic effect of Ganting against influenza virus.Methods Micro-well cell cultures was adopted to observe anti-viral activity and titer the virus.Results The minimal concentration of Ganting was3.25g/ml，the titer of influenza virus declined from10 4.3 TCID 50 /0.1

3、ml to10 2.3 TCID 50 /0.1ml after treated by minimal concentration，and the therapy indexwas8.Conclusion Ganting has certain therapeutic effect in fighting influenza virus in vitro. Key words Ganting influenza virus anti-viral activity cell culture 滇虹藥業(yè)有限公司根據(jù)中藥的作用機(jī)制研制了一種抗病毒新藥感停外用噴鼻劑。本研究通過(guò)感停的抗流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究

4、，旨在找到一種有效的早期預(yù)防和治療急性上呼吸道病毒感染的藥物，并為該藥的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。 1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 細(xì)胞株 狗腎細(xì)胞系（MDCK）由武漢大學(xué)典型細(xì)胞保藏中心提供。細(xì)胞生長(zhǎng)液為10%新生犢牛血清199培養(yǎng)液，內(nèi)含100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素;細(xì)胞維持液除含新生犢牛血清含量為2%和2g/ml胰蛋白酶外，其它成分同細(xì)胞生長(zhǎng)液。 1.2 病毒株 流感病毒為本室保存。病毒型分別為:A/SH/S/84（H 3 N 2 ）E 2 。病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞活化增殖，細(xì)胞病變（CPE）達(dá)75%以上（+）時(shí)收獲，滴定其滴度為10 5 TICD 50 /0.1ml。1.3 藥物 1.4

5、 主要試劑 199培養(yǎng)基，DIBCOBRL公司生產(chǎn)，批號(hào):1090813。胰蛋白酶，Difico分裝，上海金路貿(mào)易公司銷售。新生犢牛血清，中國(guó)云南鄧川蝶泉生物血清廠出品，產(chǎn)品批號(hào):20030607002。青霉素，哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):A03062318。鏈霉素，華北制藥公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):021111。2 方法 2.1 藥物毒性測(cè)定分別按下列劑量將感停藥液（10X）加入到生長(zhǎng)為良好單層的24孔DMCK細(xì)胞培養(yǎng)孔:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90l/ml，每一藥物劑量設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，于37，5%CO 2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

6、4天，每天觀察藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。 2.2 感停的體外抗病毒實(shí)驗(yàn) 根據(jù)病毒的增殖周期，擬定感停對(duì)流感病毒的作用方式共分3組:（1）藥物殺病毒作用組:分別將藥物（2 -2 稀釋）直接和100TCID 50 /0.1ml病毒作用后，再把它們的混合液加到細(xì)胞表面，37、5%CO 2 孵育2h后，棄上清液，加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)，觀察藥物對(duì)病毒的直接殺傷作用，連續(xù)觀察3天。同時(shí)設(shè)病毒唑（陽(yáng)性對(duì)照）、NS（陰性對(duì)照）和細(xì)胞對(duì)照。每一劑量分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。（2）藥物抗病毒吸附組:采用最大細(xì)胞毒劑量的感停進(jìn)行2 -2 稀釋，然后加到細(xì)胞表面，37、5%CO 2 中孵育2h，棄上清液，分別用100TCID 50 /0

7、.1ml流行性感冒病毒攻擊細(xì)胞，37、5%CO 2 中孵育2h，棄上清液，加細(xì)胞維持液37、5%CO 2 培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天。同時(shí)設(shè)病毒唑（陽(yáng)性對(duì)照）、NS（陰性對(duì)照）和細(xì)胞對(duì)照。每一劑量分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。（3）治療組（抗病毒復(fù)制、合成組）先分別用100TCID 50/0.1ml流行性感冒病毒吸附細(xì)胞，37、5%CO 2 中孵育2h，棄上清液，再分別用細(xì)胞維持液經(jīng)2 -2 稀釋的最大細(xì)胞毒劑量的藥物與細(xì)胞一起培養(yǎng)，使藥物作用于細(xì)胞內(nèi)的流行性感冒病毒以觀察藥物對(duì)病毒的抑制作用，連續(xù)觀察3天。同時(shí)設(shè)病毒唑（陽(yáng)性對(duì)照）、NS（陰性對(duì)照）和細(xì)胞對(duì)照。每一劑量分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。最后，滴定最小有效劑量孔的病毒

8、滴度。 2.3 病毒滴定 將各實(shí)驗(yàn)組藥物作用的細(xì)胞培養(yǎng)板反復(fù)凍融3次后，合并同一劑量重復(fù)孔懸體，分別取0.1ml按10 -1 稀釋，滴定細(xì)胞凍融液中病毒滴度，并重復(fù)3孔。3 結(jié)果 3.1 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用 感停對(duì)狗腎細(xì)胞（DMCK）的最大細(xì)胞毒性為20l/ml（26g/ml）。 3.2 藥物作用方式 （1）感停對(duì)流感病毒的最小治療濃度為:3.25g/ml;（2）直接殺流感病毒的最小濃度為:13g/ml;（3）感停不能預(yù)防流感病毒的感染。 感停對(duì)流感病毒的治療指數(shù) 1 （therapy index，TI）等于8。治療組細(xì)胞凍融液中病毒滴度經(jīng)最小有效劑量感停作用后，細(xì)胞凍融液中流感病毒的滴度為

9、10 2.3 TCID 50 /0.1ml，病毒唑組的病毒滴度為10 2.7 TCID 50 /0.1ml，NS對(duì)照組的病毒滴度為10 4.3 TCID 50 /0.1ml。 4 討論由于病毒屬于非細(xì)胞型微生物，具有個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，必須在活細(xì)胞內(nèi)增殖等特點(diǎn)。病毒感染后，一方面，由于臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)，組織細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重?fù)p傷，另一方面，由于病毒的超級(jí)寄生性，迄今，我們較難找到一種對(duì)細(xì)胞毒性較低而抗病毒活性較高的藥物，因此，病毒的預(yù)防和治療一直是各國(guó)科學(xué)家研究的重要領(lǐng)域。盡早預(yù)防和治療病毒感染對(duì)縮短病毒感染疾病的病程和減輕臨床癥狀具有十分重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。 研究表明，感停具有直接殺傷流感病

10、毒作用，可避免病毒進(jìn)入細(xì)胞，防止流行性感冒和普通感冒，同時(shí)，感停也能抑制胞內(nèi)病毒的復(fù)制，對(duì)流行性感冒和普通感冒均有一定的治療作用，其對(duì)流感病毒的治療指數(shù)為8，經(jīng)最小有效劑量感停作用后，流感病毒的滴度由10 4.3 TCID 50 /0.1ml下降為10 2.3 TCID 50 /0.1ml。 感停對(duì)流感病毒無(wú)預(yù)防作用，說(shuō)明感停沒(méi)有和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，可能是由于感停屬于中藥復(fù)方，成分復(fù)雜， 針對(duì)細(xì)胞表面的單一病毒受體的成分含量低，或以復(fù)合物形式存在，不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而不能預(yù)防病毒的感染。但能直接殺傷病毒和抑制胞內(nèi)病毒的復(fù)制，也證明感停對(duì)呼吸道常見(jiàn)病毒具有一定的預(yù)防和治療作用，感停對(duì)病毒的直接殺傷作用推測(cè)可能是感停中的有效成分對(duì)病毒包膜的作用，感停對(duì)已經(jīng)進(jìn)入胞內(nèi)的流感病毒也有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能是抑制病毒核酸復(fù)制或阻止病毒蛋白合成，這有待于進(jìn)一步研究。 體外（in vitro）藥理研究具有快捷迅速、敏感特異、條件易控等優(yōu)點(diǎn)，在藥物的活性篩選、毒性評(píng)價(jià)與深入細(xì)胞分子藥理等研究中起重要作用 25 。隨著細(xì)胞生物學(xué)與生物化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，體外藥理研究方法日新月異，使得人們能夠更加