核苷酸代謝講義

1、第十章 核酸代謝要求掌握：遺傳信息傳遞的中心法則，原核細(xì)胞DNA復(fù)制及RNA轉(zhuǎn)錄的酶、有關(guān)概念和基本過程。熟悉：DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；逆轉(zhuǎn)錄酶活性和逆轉(zhuǎn)錄的應(yīng)用。了解：核苷酸分解代謝的終產(chǎn)物、生物合成的方式。原核生物與真核生物復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的區(qū)別。重點(diǎn)內(nèi)容：遺傳信息傳遞的中心法則，原核細(xì)胞DNA半保留復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄。難點(diǎn)內(nèi)容：DNA復(fù)制的過程，原核生物RNA轉(zhuǎn)錄的相關(guān)概念。第一節(jié) 核苷酸的代謝一、嘌呤核苷酸的合成代謝體內(nèi)嘌呤核苷酸的合成有兩條途徑。第一，由簡單的化合物合成嘌呤環(huán)的途徑，稱從頭合成（de novo synthesis）途徑。第二，利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷，經(jīng)過簡單的反應(yīng)過

2、程，合成嘌呤核苷酸，稱為補(bǔ)救合成（或重新利用）（salvage pathway）途徑。肝細(xì)胞及多數(shù)細(xì)胞以從頭合成為主，而腦組織和骨髓則以補(bǔ)救合成為主。（一）嘌呤核苷酸的從頭合成(1) 原料核素示蹤實(shí)驗(yàn)證明嘌呤環(huán)是由一些簡單化合物合成的，如圖10-1所示，甘氨酸提供C-4、C-5及N-7；谷氨酰胺提供N-3、N-9; N10-甲酰四氫葉酸提供C-2, N5，N10-甲炔四氫葉酸提供C-8;CO2提供C-6。磷酸戊糖則來自糖的磷酸戊糖旁路，當(dāng)活化為5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）后, 可以接受堿基成為核苷酸。其活化的反應(yīng)式如下。（2）過程 合成的主要特點(diǎn)是在磷酸核糖的基礎(chǔ)上把一些簡單的原料逐步

3、接上去而成嘌呤環(huán)。而且首先合成的是次黃嘌呤核苷酸(IMP)，由后者再轉(zhuǎn)變?yōu)橄汆堰屎塑账?AMP)和鳥嘌呤核苷酸(GMP)1. IMP的合成2.AMP和GMP的合成需要說明的是，AMP和GMP是不能直接轉(zhuǎn)換的，但AMP可在腺苷酸脫氨酶催化下脫去氨基，生成IMP，然后再利用IMP合成GMP。 作為核酸合成的底物是核苷三磷酸的形式，通過激酶的作用及ATP供能，AMP和GMP可轉(zhuǎn)變成ATP及GTP。（二）嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成雖然從頭合成途徑是嘌呤核苷酸的主要合成途徑，但嘌呤核苷酸從頭合成酶系在哺乳動(dòng)物的某些組織(腦、骨髓)中不存在，細(xì)胞只能直接利用細(xì)胞內(nèi)或飲食中核酸分解代謝產(chǎn)生的嘌呤堿或嘌呤核苷重新合

4、成嘌呤核苷酸，稱為補(bǔ)救合成。補(bǔ)救合成的過程比從頭合成簡單得多，消耗ATP少，且可節(jié)省一些氨基酸的消耗。有兩種酶參與補(bǔ)救合成，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(adenine phosphoribosyl transferase,APRT)和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)。補(bǔ)救合成同樣由PRPP提供磷酸核糖。腺嘌呤核苷通過腺苷激酶（adenosine kinase）的作用可變成AMP而重新利用。類似地，其他核苷也可由相應(yīng)的激酶磷酸化得到相應(yīng)的核苷酸由于基因缺陷導(dǎo)致HGPRT活性嚴(yán)重不足或完全缺乏，是一

5、種X染色體連鎖的隱性遺傳病，稱為Lesch-Nyhan綜合征或稱自毀容貌征，患兒在二三歲時(shí)即開始出現(xiàn)癥狀，如尿酸過量生成，智力遲鈍，甚至自身毀容，這種患兒很少活到成年?，F(xiàn)在科學(xué)家正研究將由功能的HGPRT基因，借助基因工程的方法轉(zhuǎn)移至患者的細(xì)胞中，以達(dá)到基因治療的目的。（三）嘌呤核苷酸合成的調(diào)節(jié)嘌呤核苷酸的合成受反饋抑制（feedback inhibition）調(diào)節(jié)。抑制物及作用部位1.PRPP合成酶：PRPP濃度是從頭合成過程的最主要決定因素。PRPP合成的速度又依賴磷酸戊糖的存在和PRPP合成酶的活性。PRPP合成酶受嘌呤核苷酸的別構(gòu)調(diào)節(jié)。其中，IMP、AMP和GMP可對PRPP合成酶反饋

6、抑制以調(diào)節(jié)PRPP的水平。2. 谷氨酰胺磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶：IMP對催化嘌呤核苷酸合成的定向步驟的酶即谷氨酰胺磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶有反饋抑制，而AMP和GMP對IMP的反饋抑制有協(xié)同作用；PRPP增加可促進(jìn)谷氨酰胺磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶活性，加速PRA生成。3.過量AMP會(huì)抑制IMP轉(zhuǎn)變成AMP，而過量GMP會(huì)抑制IMP轉(zhuǎn)變成GMP，從而使這兩種核苷酸合成速度保持平衡。另外，GTP是AMP合成時(shí)必需的能源，而ATP是GMP合成時(shí)必需的能源，這種作用使腺嘌呤核苷酸和鳥嘌呤核苷酸的合成的以保持平衡。3嘌呤核苷酸合成的抗代謝物6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6MP)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與次黃嘌呤相

7、似，只是后者C-6的羥基被巰基取代。它在體內(nèi)可變成6-MP核苷酸，可以反饋抑制PRPP合成酶和谷氨酰胺磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶的活性，也能抑制IMP轉(zhuǎn)變成AMP和GMP，從而可抑制腫瘤生長。二、 嘧啶核苷酸的合成代謝與嘌呤核苷酸一樣，體內(nèi)嘧啶核苷酸的合成亦有兩條途徑，即從頭合成及補(bǔ)救合成。（一）嘧啶核苷酸的從頭合成1、原料核素示蹤實(shí)驗(yàn)證明，合成嘧啶堿的原料如圖10-5。2、過程與嘌呤核苷酸的從頭合成不同，嘧啶核苷酸是先合成嘧啶環(huán)，然后再與磷酸核糖相連，形成嘧啶核苷酸。全過程見教材，此過程主要在肝細(xì)胞的胞液中進(jìn)行。除了二氫乳清酸脫氫酶位于線粒體內(nèi)膜上外，其余均位于胞液中。（二）嘧啶核苷酸的補(bǔ)救合成由嘧

8、啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(pyrimidine phosphoribosyl transferase)催化尿嘧啶、胸腺嘧啶等，與PRPP合成一磷酸尿嘧啶核苷酸（但不能利用胞嘧啶為底物）。另外，嘧啶核苷激酶可使相應(yīng)嘧啶核苷磷酸化成核苷酸。（三）嘧啶核苷酸合成的調(diào)節(jié)原核生物和真核生物中，從頭合成途徑所需的酶不同，因而途徑所受的調(diào)控也不一樣。第一個(gè)調(diào)節(jié)部位在原核生物中，是天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（asparate carbamoyl transferase, ACTase），CTP是其別構(gòu)抑制劑，ATP是別構(gòu)激活劑。氨甲?；姿岷铣擅冈谡婧松锛霸松锒际欠答佉种频恼{(diào)控點(diǎn)，受UTP的抑制，但可被PRPP激活

9、。第二個(gè)調(diào)節(jié)部位是乳清酸脫羧酶處，受UMP抑制。由于PRPP合成酶是嘧啶與嘌呤兩類核苷酸合成過程中共同需要的酶，它可同時(shí)接受嘧啶核苷酸及嘌呤核苷酸的反饋抑制。三、脫氧核糖核苷的生成脫氧核苷酸是由二磷酸核苷還原而成?，F(xiàn)知脫氧核苷酸中的脫氧核糖并非先形成后再合成為脫氧核苷酸，而是在二磷酸核苷(NDP，N代表A、G、U、C、T等堿基)水平上直接還原，即以氫取代其核糖分子中C-2的羥基而成的，催化此反應(yīng)的酶是核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase,RR)RR是一種別構(gòu)酶，由B1和B2兩個(gè)亞基組成，在B1亞基上有兩個(gè)結(jié)合部位，一為底物特異性部位，另一為總活性調(diào)節(jié)部位。此外，B

10、1還含有巰基（SH），供直接還原核糖之用?，F(xiàn)知RR從NADPH獲得電子時(shí)，還需要一種硫氧化還原蛋白(thioredoxin,T)作為電子載體及硫氧化還原酶（thioredoxin reductase,TR）及其輔基FAD參加。整個(gè)過程如圖10-8所示。RR的活性受一些別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)。dATP是所有四種底物還原酶的抑制劑，當(dāng)dATP結(jié)合至總活性部位時(shí)，該酶活性降低，反映脫氧核苷酸過剩，ATP能消除此反饋抑制。當(dāng)dATP或ATP結(jié)合至底物特異性部位時(shí)，促進(jìn)嘧啶核苷酸UDP及CDP的還原。dTTP則促進(jìn)GDP的還原，及抑制UDP和CDP的進(jìn)一步還原。dGTP促進(jìn)ADP的還原。由此可見RR有多種構(gòu)象

11、狀態(tài)，各具有不同的催化活性，從而為DNA合成提供數(shù)量平衡的四種脫氧核苷酸為底物。若產(chǎn)物不平衡會(huì)影響DNA的合成，嚴(yán)重者可導(dǎo)致疾?。ㄒ娤拢?。四、脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成首先，dUDP轉(zhuǎn)換為dUMP，有幾條途徑，一條是在核苷單磷酸激酶催化下，dUDP與ADP反應(yīng)生成dUMP和ATP；另一條途徑是dUDP先形成dUTP，然后水解生成dUMP和PPi。dCMP經(jīng)脫氨也可以形成dUMP。然后，dTMP是由dUMP的C-5甲基化而形成的。催化此反應(yīng)的酶是胸腺嘧啶核苷酸合酶(thymidylate synthase)。甲基由N5,N10_甲炔FH4提供。反應(yīng)中形成的FH2須經(jīng)二氫葉酸還原酶的作用變成FH4，

12、才能重新載帶甲基。 DNA合成的底物為四種dNTP，一磷酸或二磷酸脫氧核苷可由激酶的催化和ATP供能而形成三磷酸脫氧核苷。五、 核苷酸的分解代謝（一）嘌呤核苷酸的分解代謝AMP在腺苷酸脫氨酶作用下生成IMP，再在核苷酸酶作用下水解成次黃苷和磷酸，或者AMP在核苷酸酶作用下水解成腺苷，再經(jīng)腺苷脫氨酶作用生成次黃苷。次黃苷經(jīng)嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase, PNP）生成次黃嘌呤和磷酸核糖。磷酸核糖可轉(zhuǎn)變成磷酸核糖，進(jìn)入磷酸戊糖途徑或再合成PRPP。次黃嘌呤既可進(jìn)入補(bǔ)救途徑，也可進(jìn)一步分解，即次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化下氧化成黃嘌呤，在同一酶的催化

13、下進(jìn)一步氧化成終產(chǎn)物尿酸。而GMP分解生成的鳥嘌呤氧化成黃嘌呤，再變成尿酸。腺苷脫氨酶（adenosine deaminase,ADA）基因缺陷是一種常染色體隱性遺傳病，由于基因突變造成酶活性下降或消失，常導(dǎo)致AMP，dAMP和dATP蓄積，dATP是核糖核苷酸還原酶的別構(gòu)抑制劑，能減少dGDP, dCDP和dTTP合成，從而DNA合成受阻。由于正常情況下淋巴細(xì)胞中腺苷酸脫氨酶活性較高，當(dāng)ADA基因缺陷時(shí)，可造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)均下降，甚至死亡，即嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥（severe combined immunodeficiency, SCID）。ADA基因突變引起的SCID

14、是第一個(gè)進(jìn)行基因治療的病種，即在體外將正常的ADA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)患者的淋巴細(xì)胞，再回輸體內(nèi)。PNP基因缺陷是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，純合子PNP基因缺陷的患兒表現(xiàn)為T細(xì)胞免疫缺陷。原因是PNP不能發(fā)揮正常作用，所以患兒體內(nèi)鳥苷、脫氧鳥苷、次黃苷及脫氧次黃苷濃度均增加，脫氧鳥苷轉(zhuǎn)化成dGTP，造成dGTP堆積，是核糖核苷酸還原酶的別構(gòu)抑制劑，導(dǎo)致dCDP及dCTP下降，最終DNA合成不足，影響胸腺細(xì)胞增殖，導(dǎo)致T細(xì)胞免疫缺陷。 可見嘌呤核苷酸的分解代謝的終產(chǎn)物為尿酸，后者經(jīng)腎臟排泄。痛風(fēng)癥（gout）患者由于血中尿酸含量升高，尿酸水溶性較差，形成的晶體沉積于關(guān)節(jié)、軟組織、軟骨及腎等處，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎

15、、尿路結(jié)石及腎疾病等，痛風(fēng)癥多見于成年男性。原發(fā)性痛風(fēng)癥由于HGPRT活性降低，嘌呤堿不能通過補(bǔ)救合成途徑合成核苷酸再利用，即分解成尿酸。此外，大量PRPP促使嘌呤的從頭合成加快。繼發(fā)性痛風(fēng)癥由于腎功能減退，尿酸排出減少。治療原則：用促進(jìn)尿酸排泄的藥物，或用抑制尿酸形成的藥物。例如別嘌呤醇（allopurinol）在體內(nèi)氧化成別黃嘌呤，后者能與黃嘌呤氧化酶結(jié)合成不可逆的復(fù)合物，所以別嘌呤醇是黃嘌呤氧化酶的強(qiáng)烈抑制劑。（二）啶核苷酸的分解代謝嘧啶核苷酸的分解可先脫去磷酸及核糖，余下的嘧啶堿進(jìn)一步開環(huán)分解，最終產(chǎn)物為NH3、CO2、丙氨酸及氨基異丁酸，這些產(chǎn)物均易溶于水，可隨尿排出體外。第二節(jié) D

16、NA的生物合成的幾個(gè)原則遺傳信息傳遞的中心法則：一、半保留復(fù)制Watson和Crick于1953年提出的DNA雙螺旋模型，堿基互補(bǔ)配對的原則，為DNA分子的復(fù)制提供了理論基礎(chǔ)，即親代的DNA雙鏈，每股鏈都可以作為模板，按堿基互補(bǔ)配對原則指導(dǎo)DNA新鏈的合成，這樣合成的兩個(gè)子代DNA分子，堿基序列與親代分子完全一樣。但一條鏈?zhǔn)莵碜杂H代的DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻逆?，此即為半保留?fù)制 (semiconservative replication)。用15N標(biāo)記親代的DNA鏈，而用14N標(biāo)記新合成的DNA鏈的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)子代的DNA分子，一股鏈含15N，另一股含14N。二、半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋的兩

17、股鏈?zhǔn)欠聪蚱叫?antiparallel)的，新合成的兩股子鏈，一股的方向?yàn)?3，另一股為35。那么體內(nèi)是否存在兩種DNA聚合酶?一種催化核苷酸以53方向聚合，另一種以35方向聚合。但從現(xiàn)知所有的DNA聚合酶都只能催化53方向合成。這個(gè)問題直到1968年岡崎(Okazaki)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DNA復(fù) 制過程中出現(xiàn)一些含1000 2000個(gè)核苷酸的片段，一旦合成終止，這些片段即連成一條長鏈。這種小片段被稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。因此，復(fù)制時(shí)親代DNA分子中那股35方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新鏈以53方向連續(xù)合成，此鏈稱為前導(dǎo)鏈(1eading strand)。在前導(dǎo)鏈延長100

18、0 2000個(gè)核苷酸后，另一母鏈也作為模板指導(dǎo)新鏈也是沿53合成1 000 2 000個(gè)核苷酸的小片段，這就是岡崎片段。隨著鏈的延長，可以有許多個(gè)岡崎片段，這條稱為隨從鏈(1agging strand)?？梢?，隨從鏈為不連續(xù)復(fù)制，所以DNA為半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication)，如圖12-2所示。復(fù)制后，這些岡崎片段由DNA連接酶的作用而連接成完整的新鏈。三、RNA引物目前所發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶都需要一個(gè)具3-OH的引物，才能將合成原料dNTP一個(gè)一個(gè)接上去。因?yàn)镈NA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的dNTP在DNA模板上進(jìn)行聚合，如圖12-3所示。實(shí)驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)抑制

19、RNA聚合酶的藥物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的復(fù)制。再者在體外DNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)岡崎片段的5端都有一小段412個(gè)核苷酸的RNA引物(RNA primer)?，F(xiàn)知RNA聚合酶合成新鏈時(shí)不需要引物，能直接催化游離NTP聚合?？梢奟NA引物為DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶除去，留下的空隙也由該酶補(bǔ)滿，缺口再由DNA連接酶封口。在DNA的復(fù)制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離dNTP的聚合，而RNA引物酶卻具有此能力外，這種作用尚可盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變。因?yàn)橛坞x核苷酸起始處的聚合最容易出現(xiàn)差錯(cuò)，若用RNA引物，即

20、使出現(xiàn)差錯(cuò)，由于最后將被DNA聚合酶切除，便可提高DNA復(fù)制的真實(shí)性。四、復(fù)制的真實(shí)性DNA復(fù)制過程是非常復(fù)雜的，需要許多酶類和蛋白質(zhì)因子參加。這既保證DNA復(fù)制的速度，又保證產(chǎn)物的高度真實(shí)性。這也保證了自然界種族延續(xù)中生物遺傳特性的相對穩(wěn)定性。第三節(jié) 參與DNA復(fù)制的一些酶類和蛋白質(zhì)一、 大腸桿菌的DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase）的作用是將脫氧核苷酸連接成DNA，所用底物必須是四種脫氧核苷三磷酸(dNTP ) ，Mg2+存在和一個(gè)DNA模板，按模板的序列將配對的脫氧核苷酸逐個(gè)接上去，并且需要一個(gè)具有3-OH的RNA引物或DNA的3-OH端。使3-OH與合成上去的dNT

21、P分子-磷酸連接成3，5磷酸二酯鍵，合成方向?yàn)?3，如圖12-4。從大腸桿菌純化得到3種DNA聚合酶(， )。(一) DNA聚合酶1955年Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶(簡稱為pol)，故也稱為Kornberg酶，并因此而獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。DNA聚合酶是一條分子質(zhì)量為103X103 Da的多肽鏈。具有多種催化功能。若用蛋白酶輕度水解可得一個(gè)分子質(zhì)量68X103 Da的大片段和一個(gè)分子質(zhì)量為36X103 Da的小片段，常將大片段稱為Klenow片段，此片段具有兩種催化活性，一為上述的聚合功能，另一為35外切酶的活性，從3端水解DNA產(chǎn)生3單核苷酸，如圖12-5所示。這種35外切酶活性對保證D

22、NA復(fù)制的真實(shí)性具有重要的意義。DNA聚合酶在接上新的核苷酸前，它能對3末端的堿基進(jìn)行識(shí)別。若為配錯(cuò)的堿基，即通過35外切酶活性把配錯(cuò)的堿基切除，再使正確的堿基聚合上去，保證DNA復(fù)制的高度真實(shí)性，這種功能也稱校讀功能(proof reading)。小片段則具53外切酶的活性，它能從53方向一個(gè)挨一個(gè)切除，產(chǎn)物為5單核苷酸，或跨過若干個(gè)核苷酸再進(jìn)行酶解，從5末端釋放一寡核苷酸。可除去岡崎片段5端的RNA引物和在DNA損傷修復(fù)中起重要的作用?？梢?，DNA聚合酶為一條多肽鏈上具有三種酶的活性，也是一種多功能酶(圖12-7)。但DNA聚合酶并不是大腸桿菌DNA復(fù)制中主要的DNA合成酶，它的主要作用，

23、是切除RNA引物、填補(bǔ)空缺和DNA損傷的修復(fù)。DNA聚合酶為一條多肽鏈上具有三種酶的活性，是一種多功能酶(圖12-7)。鑒于Klenow片段兼具聚合及35外切活性，能非常準(zhǔn)確按模板堿基序列合成DNA，所以此片段是分子生物學(xué)常用的工具酶。 (二) DNA聚合酶 由一條多肽鏈構(gòu)成。此酶除具有聚合酶的活性外，還具有35外切酶活性。它在生物體內(nèi)的確切作用不詳，可能也是在DNA損傷修復(fù)中起作用。(三) DNA聚合酶 此酶是一個(gè)多聚酶，由10種不同亞基組成的( 圖12- 8)，稱為DNA聚合酶全酶(DNA po1ymerase ho1oenzyme)。它具有三個(gè)特點(diǎn)：是一種非常高的續(xù)進(jìn)性(processi

24、vity)酶。所謂續(xù)進(jìn)性即在DNA聚合酶與模板分離下來之前加入的核苷酸平均數(shù)。續(xù)進(jìn)性500 000。而DNA聚合酶僅合成3200個(gè)核苷酸即自模板上釋放。DNA聚合酶催化活性比DNA聚合酶高很多倍，每秒可催化1 000個(gè)核苷酸的聚合，而DNA聚合酶每秒僅催化1620個(gè)核苷酸聚合。DNA聚合酶不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有35外切酶活性，產(chǎn)物真實(shí)性高。所以，大腸桿菌DNA聚合酶是DNA復(fù)制必需的酶。DNA聚合酶聚合和校正功能分別存在于和亞基。DNA聚合酶全酶分子質(zhì)量約900X103 Da，全酶成不對稱的二聚體，圍繞著DNA雙螺旋，每個(gè)單體都具有催化活性，一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈，另一個(gè)作用于隨從

25、鏈，使DNA兩股鏈在同一位置同一時(shí)間進(jìn)行合成。二、真核細(xì)胞的DNA聚合酶真核細(xì)胞的DNA聚合酶有5種，即DNA聚合酶、和。DNA聚合酶負(fù)責(zé)隨從鏈的合成，DNA聚合酶和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的合成。PCNA是作為DNA聚合酶活性所需的一種輔助蛋白，有與E.coli DNA聚合酶的亞基類似的結(jié)構(gòu)和功能，形成環(huán)狀的夾鉗，大大地增強(qiáng)DNA聚合酶的續(xù)進(jìn)性。DNA聚合酶負(fù)責(zé)線粒體DNA(mitochondria DNA, mt DNA)的復(fù)制，DNA聚合酶和的功能為DNA的修復(fù)。三、解旋、解鏈酶類復(fù)制時(shí)DNA雙螺旋要解開，

26、才能在原來的母鏈上合成新鏈。復(fù)制在不斷延伸，螺旋要不斷解開。若每秒鐘復(fù)制1 000個(gè)堿基對，則要解旋100次。這樣必然在復(fù)制前方產(chǎn)生很大的張力，使DNA纏結(jié)，這要靠DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶等來解決。(一) DNA解鏈酶DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制開始部位的DNA雙螺旋必須解開成單鏈，模板鏈上的堿基才能以堿基配對原則，指導(dǎo)新鏈的合成。解開DNA雙螺旋的酶有多種，稱為DNA解鏈酶(DNA helicase)，該酶具有ATP酶的活性，在ATP的存在下，該酶能解開DNA雙鏈，每解開1對堿基消耗2個(gè)ATP。(二) 單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白(single strand binding protein，SSB)或

27、螺旋去穩(wěn)定蛋白(helix destabilizing protein HDP)，能與已被解鏈酶解開的單鏈DNA結(jié)合，以維持模板處于單鏈狀態(tài)，又可保護(hù)其不被核酸酶水解。單鏈DNA結(jié)合SSB后既可避免重新形成雙鏈的傾向，又可避免自身發(fā)夾螺旋的形成，還能使前端雙螺旋的穩(wěn)定性降低，易被解開。當(dāng)DNA聚合酶在模板上前進(jìn)，逐個(gè)接上脫氧核苷酸時(shí)，SSB即不斷脫離，又不斷與新解開的鏈結(jié)合。(三) DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)湟辉~是指物體作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoiso-merase)有兩類：其中拓?fù)洚悩?gòu)酶，曾有過多種其他名稱如轉(zhuǎn)軸酶、解纏酶等。它能切斷DNA雙鏈中的一股，使DNA解

28、鏈旋轉(zhuǎn)時(shí)不致纏結(jié)，解除張力后又把切口封閉。拓?fù)洚悩?gòu)酶，又稱旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，暫時(shí)切斷DNA雙鏈，使另一DNA雙鏈經(jīng)過此切口，隨后又再封閉切口。四、引發(fā)體引發(fā)體(primosome)是由多種蛋白質(zhì)及酶組成，是DNA復(fù)制開始所必需的。引發(fā)體中的某些蛋白質(zhì)如DnaA能結(jié)合至DNA復(fù)制起始部位，DnaB具有解鏈酶的作用，DnaC輔助DnaB結(jié)合到復(fù)制起始點(diǎn)，使起始部位的雙鏈解開。而引發(fā)體中的引物酶(primase)在已解開起始部位的DNA單鏈按堿基互補(bǔ)配對催化NTP聚合，合成一小片段的RNA，作為DNA合成的引物，即沿此引物RNA的3-OH進(jìn)行延伸。五、DNA連接酶DNA連接酶(DNA 1iga

29、se)催化兩段DNA鏈之間磷酸二酯鍵的形成。要求DNA鏈3端有游離的OH，而5端帶有磷酸根，連接過程需要ATP供能,如圖12-9。DNA連接酶不能連接兩分子單鏈的DNA，只能作用雙鏈DNA分子中一股鏈上的缺口，或雙鏈DNA分子雙股的缺口。如DNA經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶切割后，兩個(gè)片段的粘性末端相配，DNA連接酶能使之連接。即使是兩段平齊DNA，DNA連接酶也能使之連接。在DNA復(fù)制過程中，當(dāng)RNA引物清除后，靠DNA聚合酶填補(bǔ)空缺，岡崎片段之間的缺口靠DNA連接酶作用而連成完整的一條新鏈。DNA連接酶在DNA損傷修復(fù)中亦起重要作用，并且是一種重要的工具酶。第四節(jié) DNA復(fù)制過程一、復(fù)制的起始大腸桿

30、菌復(fù)制時(shí)有特定的起始部位稱為oriC，長度為245bp。有3個(gè)串連排列的核苷酸序列，每個(gè)由13個(gè)核苷酸組成。其序列基本相同為GATCTNTTNTTTT，而且GATC在oriC部位出現(xiàn)11次，oriC還有4個(gè)DnaA結(jié)合位點(diǎn)，是4個(gè) 9bp序列的反向重復(fù)，這些序列都是高度保守的（圖12-10。）DnaA先結(jié)合至復(fù)制起始點(diǎn)，然后發(fā)動(dòng)了復(fù)雜的變化。DnaB和DnaC亦參加進(jìn)去，從而使雙鏈解開，DNA結(jié)合蛋白便與單鏈DNA結(jié)合。接著引物酶按堿基配對原則合成一小段的RNA引物，此引物的3-OH可供DNA聚合酶將第一個(gè)dNTP加到3-OH上而形成3，5磷酸二酯鍵。復(fù)制是從oriC開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的

31、，稱為雙向復(fù)制(bi-directional replication)。 復(fù)制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制。在電子顯微鏡下觀察DNA復(fù)制前進(jìn)部位伸展成叉狀，稱為復(fù)制叉(replication fork)，如圖12-12。二、 復(fù)制的延長在DNA聚合酶的作用下，新合成的DNA鏈不斷延長。大腸桿菌的岡崎片段長度為1 0002 000個(gè)核苷酸，即前導(dǎo)鏈合成1 0002 000個(gè)核苷酸后，隨從鏈便開始合成。在延長過程中，由于拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，避免了在復(fù)制叉前方的DNA打結(jié)。三、復(fù)制的終止在DNA延長階段結(jié)束后，原核生物的RNA引物被DNA聚合酶切除。留下的空隙，由DNA聚合酶進(jìn)行補(bǔ)滿

32、，即從另一岡崎片段的3-OH按53根據(jù)堿基配對原則，將一個(gè)個(gè)的dNTP補(bǔ)上去。最后的缺口再由DNA連接酶將相鄰的兩個(gè)核苷酸借磷酸二酯鍵連起來，即成完整的一條新鏈，DNA的復(fù)制即告完成，如圖12-15。四、真核生物端粒DNA的復(fù)制真核生物線性染色體的兩個(gè)末端稱為端粒(telomere)。按上述DNA復(fù)制機(jī)制新合成子鏈5端的那段RNA引物被切除后，必留下一個(gè)空缺，假如每次細(xì)胞分裂或DNA復(fù)制都是如此，端粒將會(huì)不斷縮短，最終導(dǎo)致關(guān)鍵基因的喪失及種系滅絕的危險(xiǎn)，但事實(shí)并非如此。那么真核生物一定存在著某種阻止端粒縮短的機(jī)制。端粒DNA的結(jié)構(gòu)和端粒酶對端粒DNA序列的分析，發(fā)現(xiàn)端粒DNA的3端是由數(shù)百個(gè)串

33、聯(lián)重復(fù)GT豐富的短的寡核苷酸序列，如四膜蟲的重復(fù)序列為-GGGGTT-，人為-AGGGTT-。端粒DNA序列雖不含功能基因，但對維持染色體的穩(wěn)定性起著重要作用。如果端粒喪失，染色體之間可能出現(xiàn)端-端融合、降解、重排乃至染色體丟失等變化，最后細(xì)胞衰亡。近年來，發(fā)現(xiàn)了一種能防止端粒縮短的酶，稱為端粒酶(telomerase)，該酶由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成，其中RNA作為合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，具有種屬特異性，例如四膜蟲的端粒酶，其RNA部分含159個(gè)核苷酸，其中有一段序列為5-CAACCCCAA-3可作為合成端粒DNA3端GT 豐富序列-GGGGTT-

34、模板。人端粒酶的RNA含450個(gè)堿基，其中-CUAACCCUAAC-為合成-AGGGTT-的模板。這樣可防止細(xì)胞分裂時(shí)DNA復(fù)制端粒的縮短。 端粒、端粒酶和細(xì)胞的衰老有密切關(guān)系。有人將端粒稱為分子鐘或有絲分裂鐘。但是惡性腫瘤細(xì)胞當(dāng)端?？s短到某種程度，端粒酶活性又重新出現(xiàn)，對端粒進(jìn)行補(bǔ)償，使之永不衰亡，形成惡性增殖。五、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞DNA復(fù)制的區(qū)別-見P501六、 逆轉(zhuǎn)錄合成DNA 某些病毒的基因組是RNA，而不是DNA，這類病毒稱為RNA病毒。1964年Temin觀察到有些致腫瘤的RNA病毒（如雞肉瘤病毒avian sarcoma virus，ASV）感染細(xì)胞的作用能被DNA復(fù)制抑制劑（

35、如甲氨喋呤，MTX）、5FdUMP等所阻斷，說明ASV的繁殖需要DNA的合成。另一發(fā)現(xiàn)為放線菌素D能抑制子代病毒顆粒的產(chǎn)生。放線菌素D是抑制以DNA為模板的RNA合成，這說明RNA腫瘤病毒在宿主細(xì)胞的繁殖，需要通過細(xì)胞RNA的合成。因此，Temin大膽提出一種設(shè)想，即RNA腫瘤病毒先變成DNA原病毒(provirus)，再產(chǎn)生RNA腫瘤病毒。這意味著遺傳信息也可以從RNA流向DNA。1970年Temin和Baltimore各自發(fā)現(xiàn)RNA腫瘤病毒含有一種酶，稱為逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)。這種酶以RNA為模板，在有4種dNTP存在及合適條件下，能按堿基互補(bǔ)配對的原則，

36、合成互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)。這種酶也稱RNA依賴的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。由于RNA腫瘤病毒含有這種逆轉(zhuǎn)錄酶，所以也稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)。這一發(fā)現(xiàn)使生物中心法則內(nèi)容更充實(shí)和完善。Temin和Baltimore也因此而獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。1、逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，dNTP為原料，按堿基配對規(guī)律合成DNA的過程，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化。2、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱為反轉(zhuǎn)錄酶，為依賴RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)逆轉(zhuǎn)錄酶是多

37、功能酶，有三種酶活性：逆轉(zhuǎn)錄活性：即以RNA為模板合成DNARNaseH活性：水解RNA:DNA中的RNADNA pol活性：以DNA為模板合成DNA3、生物學(xué)意義（1）（2）（1） 豐富和發(fā)展了中心法則（2） 豐富和發(fā)展了致癌理論（3） 在基因工程中的應(yīng)用第五節(jié) RNA合成（轉(zhuǎn)錄）轉(zhuǎn)錄 (transcription) 是以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程。 表1 轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的異同差 異 相 同轉(zhuǎn)錄 復(fù)制 或相似模板 基因的模板鏈轉(zhuǎn)錄 2股鏈均全復(fù)制 DNA原料 NTP dNTP 核苷三磷酸堿基配對 A-U，T-A；G-C A-T；G-C 遵從

38、堿基配對原則聚合酶 RNA聚合酶 DNA聚合酶 依賴DNA的聚合酶 產(chǎn)物 mRNA，tRNA，rRNA等 DNA 多核苷酸鏈轉(zhuǎn)錄的模板是單鏈DNA，與復(fù)制的模板有較多的不同特點(diǎn)，引出了下列相關(guān)概念。轉(zhuǎn)錄過程只以基因組DNA中編碼RNA（mRNA、tRNA、rRNA及小RNA）的區(qū)段為模板。把DNA分子中能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因（structure gene）。結(jié)構(gòu)基因的雙鏈中，僅有一股鏈作為模板轉(zhuǎn)錄成RNA，稱為模板鏈(template strand)，也稱作Watson（W）鏈(Watson strand)、負(fù)（-）鏈(minus strand)或反意義鏈(antisense st

39、rand)。與模板鏈相對應(yīng)的互補(bǔ)鏈，其編碼區(qū)的堿基序列與mRNA的密碼序列相同（僅T、U互換），稱為編碼鏈(coding strand)，也稱作Crick（C）鏈（Crick strand）、正（+）鏈(plus strand)，或有意義鏈(sense strand)。不同基因的模板鏈與編碼鏈，在DNA分子上并不是固定在某一股鏈，這種現(xiàn)象稱為不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)。模板鏈在相同雙鏈的不同單股時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄方向都從53，表觀上轉(zhuǎn)錄方向相反。與DNA復(fù)制類似，轉(zhuǎn)錄過程在原核生物和真核生物中所需的酶和相關(guān)因子有所不同，轉(zhuǎn)錄過程及轉(zhuǎn)錄后的加工修飾亦有差異。一、參

40、與 轉(zhuǎn) 錄 的 酶轉(zhuǎn)錄酶（transcriptase）是依賴DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP），亦稱為DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase），簡稱為RNA聚合酶（RNA pol）。它以DNA為模板催化RNA的合成。原核生物和真核生物的轉(zhuǎn)錄酶，均能在模板鏈的轉(zhuǎn)錄起始部位，催化2個(gè)游離的NTP形成磷酸二酯鍵而引發(fā)轉(zhuǎn)錄的起始，如圖13-2所示。因此，轉(zhuǎn)錄的起始不需引物，這也是轉(zhuǎn)錄與復(fù)制在起始階段的一大區(qū)別。（一） 原核生物的RNA聚合酶細(xì)菌中只發(fā)現(xiàn)一種RNA聚合酶，能催化mRNA，tRNA和rRNA等

41、的合成，研究得比較清楚的是大腸桿菌（E coli）的RNA聚合酶。1、 大腸桿菌RNA聚合酶的組成大腸桿菌RNA聚合酶的分子量約450kDa，由四種5個(gè)亞基（2）組成全酶（holoenzyne），亞基與全酶疏松結(jié)合，在胞內(nèi)、外均容易從全酶中解離，解離后的部分（2）稱為核心酶（core enzyme）。通過利福霉素等抑制轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)研究，對轉(zhuǎn)錄酶各亞基的功能已有一定的認(rèn)識(shí)：亞基可能參與全酶的組裝及全酶識(shí)別啟動(dòng)子，從而決定哪些基因可轉(zhuǎn)錄；亞基與底物（NTP）及新生RNA鏈結(jié)合；亞基與模板DNA結(jié)合；和亞基組成酶的活性中心，通過DNA的磷酸基團(tuán)與核心酶的堿性基團(tuán)間的非特異性吸附作用，核心酶能與模板DN

42、A非特異性松馳結(jié)合；亞基的功能是識(shí)別啟動(dòng)子，辯認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，但不能單獨(dú)與DNA模板結(jié)合，當(dāng)它與核心酶結(jié)合時(shí)，可引起酶構(gòu)象的改變，從而改變核心酶與DNA結(jié)合的性質(zhì)，使全酶對轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的親和力比其他部位高4個(gè)數(shù)量級(jí)，在轉(zhuǎn)錄延長階段，亞基與核心酶分離，僅由核心酶參與延長過程。因此，亞基實(shí)際上被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，因而稱為因子(factor)。2、因子生物體在生命周期的不同階段或在內(nèi)、外環(huán)境有所變化時(shí)，其基因表達(dá)有一定的時(shí)、空順序，以適應(yīng)生長、發(fā)育及環(huán)境變化的需要。RNA聚合酶的活性是決定基因表達(dá)的重要一環(huán)。而因子是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合啟動(dòng)子的亞基，原核生物中所有RNA的轉(zhuǎn)錄都由同一種RNA聚合

43、酶催化，在生命周期的不同階段或不同環(huán)境下，這個(gè)酶如何識(shí)別所有轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子，是由識(shí)別啟動(dòng)子的因子來完成的?；騿?dòng)子 -35和-10區(qū)的共有序列（圖13-3）是因子識(shí)別的位點(diǎn)，如表13-2所示，不同的因子能識(shí)別的共有序列可以完全不同。（二） 真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶已發(fā)現(xiàn)有三種，稱為RNA聚合酶I、II和III，分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄不同的RNA，它們對特異性抑制劑鵝膏蕈堿的敏感性亦有差異，如表13-3所示。二、 轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄是生物合成RNA的過程，與復(fù)制相似，有起始、核苷酸鏈延長和鏈合成終止三個(gè)階段。（一） 轉(zhuǎn)錄的起始 轉(zhuǎn)錄的起始，就是形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的過程。這一階段反應(yīng)所需的

44、輔助因子，在原核生物與真核生物之間有較大的差異。 1、 原核生物轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始由RNA聚合酶與DNA模板的啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合。經(jīng)過對百種以上原核生物不同基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子具有下列的共同點(diǎn)：在-10bp處有一段共有序列（consensus sequence），富含AT，即 TATAAT-，系Pribnow等首先發(fā)現(xiàn)，因而稱為Pribnow盒（box），再往上游-35bp的中心處又有一組保守的共有序列，即-TTGACT-。啟動(dòng)子鄰近的結(jié)構(gòu)示如圖13-3。結(jié)合過程可分為二個(gè)步驟，首先由因子辨認(rèn)啟動(dòng)子的35區(qū)，全酶與該區(qū)結(jié)合，形成疏松的復(fù)合物，此時(shí)DNA雙鏈未解開，因而

45、稱為封閉型轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，繼而RNA聚合酶移向10區(qū)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，在20區(qū)處DNA發(fā)生局部解鏈，形成1217bp的單鏈區(qū)，RNA聚合酶與DNA結(jié)合更緊密，形成開放型轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。以單鏈的模板鏈為模板，RNA聚合酶上的起始位點(diǎn)和延伸位點(diǎn)被相應(yīng)的NTP占據(jù)，聚合酶的亞基催化第一個(gè)磷酸二酯鍵的生成，亞基從全酶解離，形成DNA-RNA聚合酶（核心酶）結(jié)合在一起的起始延伸復(fù)合物。2、真核生物轉(zhuǎn)錄的起始真核生物有三種RNA聚合酶，分別催化不同RNA的合成，每種酶都需要一些蛋白質(zhì)輔助因子，稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)。為方便討論，轉(zhuǎn)錄因子的命名冠以聚合酶的名稱。如RNA聚

46、合酶所需的轉(zhuǎn)錄因子稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）。 （二） 轉(zhuǎn)錄的延長轉(zhuǎn)錄延長階段發(fā)生的反應(yīng)，在原核生物和真核生物比較相近。總的來說，一是聚合酶如何向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游移動(dòng)，繼續(xù)指導(dǎo)核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成，二是轉(zhuǎn)錄區(qū)的模板如何形成局部單鏈區(qū)，便于轉(zhuǎn)錄。原核生物RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄起始，即核苷酸鏈中的第一個(gè)磷酸二酯鍵形成后，因子從全酶中解離出來，核心酶就能沿DNA分子移動(dòng)，真核生物RNA聚合酶不僅需要較多的轉(zhuǎn)錄因子來催化起始，而且轉(zhuǎn)錄起始后，酶的移動(dòng)也靠多種轉(zhuǎn)錄因子的共同作用使酶的構(gòu)象發(fā)生改變來實(shí)現(xiàn)，如在TFH等作用下，聚合酶C端絲氨酸殘基的磷酸化是聚合酶向下游

47、移動(dòng)的重要因素。在轉(zhuǎn)錄延長過程中，DNA雙鏈需解開1020 bp，形成的局部單鏈區(qū)象一個(gè)小泡，故形象地稱為轉(zhuǎn)錄泡（transcription bubble）。轉(zhuǎn)錄泡是指RNA聚合酶-DNA模板-轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA結(jié)合在一起形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。為了保持局部的轉(zhuǎn)錄泡狀態(tài)，在RNA聚合酶下游的DNA需不斷解鏈，可使其下游的DNA（未解開雙鏈部分）越纏越緊，形成正超螺旋，而其上游DNA變得松馳，產(chǎn)生負(fù)超螺旋，需要解旋酶（gyrase） 和拓?fù)洚悩?gòu)酶來消除這些現(xiàn)象，如圖13-7。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中，核苷酸之間第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成是由第一個(gè)核苷酸的3-OH與第二個(gè)核苷酸的5-磷酸之間脫水而成。第一個(gè)核苷酸常為G

48、，來自GTP的5-三磷酸仍保留，第二個(gè)核苷酸的3-OH仍然游離形成5pppGpN-OH3。在聚合酶沿模板鏈的35移動(dòng)時(shí)，可按模板鏈堿基序列的指引，相應(yīng)NTP上的-磷酸可與延長新鏈的3-OH相繼形成磷酸二酯鍵，其、磷酸基脫落生成焦磷酸后迅速水解，釋放的能量進(jìn)一步推動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使新合成的RNA鏈沿著5 3方向逐步延長。在轉(zhuǎn)錄局部形成的RNADNA雜化雙鏈之間的引力比DNA雙鏈的弱（因?yàn)殡s化雙鏈間存在dArU配對， dArU的穩(wěn)定性比dAdT的?。娱L中的RNA鏈的5-端會(huì)被重新形成的DNA雙鏈擠出，使合成中的RNA的5-端游離于轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。（三） 轉(zhuǎn)錄的終止 1、 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止原核生物轉(zhuǎn)錄的終

49、止有兩種主要機(jī)制。一種機(jī)制是需要蛋白質(zhì)因子（Rho）的參與，稱為依賴因子(factor)的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制，另一種機(jī)制是在離體系統(tǒng)中觀察到，純化的RNA聚合酶不需要其他蛋白質(zhì)因子參與，可使轉(zhuǎn)錄終止，稱為不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制。（1）依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止： 因子是一種分子量為46kDa的蛋白質(zhì)，以六聚體為活性形式。依賴因子的終止位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)有特殊的DNA序列，但因子能與轉(zhuǎn)錄中的RNA結(jié)合。因子的六聚體被約7080 nt的RNA包繞，激活因子的ATP酶（ATPase）活性，并向RNA的3端滑動(dòng)，滑至RNA聚合酶附近時(shí)，RNA聚合酶暫停聚合活性，使RNADNA雜化鏈解鏈，轉(zhuǎn)錄的RNA釋放出來而終止轉(zhuǎn)錄。

50、如圖13-8所示。（2）不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止： 在這種轉(zhuǎn)錄終止系統(tǒng)中，模板DNA在終止位點(diǎn)附近有特殊的連續(xù)T序列，在連續(xù)T之前有富含GC互補(bǔ)區(qū)及幾個(gè)插入堿基，如圖13-9。這種互補(bǔ)區(qū)的轉(zhuǎn)錄物可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，影響RNA聚合酶的構(gòu)象使轉(zhuǎn)錄暫停；同時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的（rU）n與模板的（dA）n之間的dArU雜交區(qū)的雙鏈?zhǔn)亲畈环€(wěn)定的雙鏈，使雜化鏈的穩(wěn)定性下降，而轉(zhuǎn)錄泡模板區(qū)的兩股DNA容易恢復(fù)雙鏈，釋出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，使轉(zhuǎn)錄終止。2、 真核生物轉(zhuǎn)錄的終止真核生物轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制，目前了解尚不多，而且3種RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止不完全相同。RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄有18 bp的終止子序列，可被輔助因子識(shí)別。RNA聚合酶II和III催化轉(zhuǎn)錄的終止子，可能有與原核生物不依賴因子的終止子相似的結(jié)構(gòu)和終止機(jī)制，即有富含GC的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop structure)和連續(xù)的U。由于成熟的mRNA 3端已被切除了一段并加入了poly A尾,具體的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)目前尚未認(rèn)識(shí)。三、 轉(zhuǎn)錄的抑制作用（一）作用于模板DNA的轉(zhuǎn)錄抑制劑如放線菌素D（actinomycin D），能插入至DNA雙鏈