研究方法和手段

1、一、顯微鏡技術(shù)二、細胞的分離及培養(yǎng)三、細胞組分的分離分離四、細胞內(nèi)分子的示蹤五、基本的分子生物學實驗技術(shù)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)v光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。v電子顯微鏡：以電子束為光源。 1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng) 機械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。（一）普通光學顯微鏡（一）普通光學顯微鏡Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。laser confocal scanni

2、ng microscope, LCSMLCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)原理用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本淀粉電子顯微鏡電子顯微鏡 (Electron microscope)(Electron microscope) 1 1932932年德國學者年德國學者Max KnollsMax Knolls和和Ernst RuskaErnst Ruska用波長比光短得多的用波長比光短得多的電子作光源電子作光源, ,發(fā)明了第一臺電子顯發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，大大提

3、高了顯微鏡的分辨率，微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。開拓了超微世界。電子顯微鏡概述電子顯微鏡概述電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)由三大部分組成: 電子光學系統(tǒng)電子光學系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、標本室、 成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機等 組成；真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)是保持電鏡的真空度；電子學系統(tǒng)電子學系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。不同光線的波長不同光線的波長透透射射電電子子顯顯微微鏡鏡透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEMScanning electron microscope（ SEM）掃描電子顯微鏡原

4、理掃描電子顯微鏡原理電子染色電子染色 標本對電子的散射能力取決于其組成標本對電子的散射能力取決于其組成元素的原子序數(shù)元素的原子序數(shù), ,原子序數(shù)越高原子序數(shù)越高, ,散射的電散射的電子越多子越多, ,反差就越大。生物分子是由一些原反差就越大。生物分子是由一些原子序數(shù)很低的輕元素子序數(shù)很低的輕元素( (氫、氧、碳、氮等氫、氧、碳、氮等) )組成的組成的, ,它們散射電子的能力很弱它們散射電子的能力很弱, ,在電鏡在電鏡下幾乎不存在明暗反差。為使生物樣品加下幾乎不存在明暗反差。為使生物樣品加大反差大反差, ,就要進行染色就要進行染色, ,即用重金屬增加電即用重金屬增加電子散射能力子散射能力, ,稱

5、為電子染色。稱為電子染色。電電鏡鏡樣樣品品的的制制備備制樣技術(shù) 1）超薄切片）超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2）負染技術(shù)）負染技術(shù)Negative Stained Actin3）冰凍蝕刻）冰凍蝕刻 freeze-etching 亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜

6、（replica）。A Yeast Cell第二節(jié)第二節(jié) 細胞分離和培養(yǎng)細胞分離和培養(yǎng)一、流式細胞術(shù)一、流式細胞術(shù) 用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選快速定量分析與分選的一門技術(shù)。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。二、細胞電泳二、細胞電泳 原理：在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動

7、。 各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同 。 用途：檢測細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細胞，如分離哺乳動物的XY精子。三 細胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary culture）：即：培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶，以1：2以上的比例擴大培養(yǎng)，稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。 細胞株細胞株（cell strain）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群。 細胞系細胞系（cell line）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞，可無限繁殖。 克隆克隆（c

8、lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP20骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 體外細胞培養(yǎng)的條件體外細胞培養(yǎng)的條件 環(huán)境因素環(huán)境因素 無菌環(huán)境、合適的溫度、一定的滲透無菌環(huán)境、合適

9、的溫度、一定的滲透 壓和氣體環(huán)境、壓和氣體環(huán)境、O O2 2和和COCO2 2。后者對于維。后者對于維 持細胞培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。持細胞培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。 代謝物和廢物排除代謝物和廢物排除：細胞融合 通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）或細胞雜交。 同核體同核體：相同基因型的細胞融合而成。 異核體：異核體：不同基因型的細胞融合而成。 自發(fā)融合：自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。 誘發(fā)融合：誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘導劑處理才能融合。 誘導細胞融合的方法：生物方法生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒

10、）、化學方法化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方物理方法法（電擊和激光）。用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程圖 第三節(jié) 細胞組分的分級分離一、分離細胞亞顯微結(jié)構(gòu)和大分子的超速離心法 離心技術(shù)是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速為1025kr/min的離心機稱為高速離心機。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89K者稱為超速離心機。 目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。 （一）差速離心（一）差速離心 Differential centrifugation 特點： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞

11、和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯度離心再行分離純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度離心（二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。 類型：速度沉降、平衡沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。1、速度沉降

12、 velocity sedimentation 用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2.平衡沉降平衡沉降 equilibrium sedimentation 用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度。 所需的力場通常比速度沉降法大10100倍，往往需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度

13、的成分分離。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation可以分離蛋白質(zhì)的層析法 又稱色譜法 在本世紀初，俄國植物學家茨維特(MTswett) 將植物色素的石油醚提取液傾入裝滿碳酸鈣顆粒的玻璃管中，再加入石油醚使其自由流下，結(jié)果植物色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的色譜帶。這種方法被稱為色譜法。裝碳酸鈣的玻璃管稱為色譜柱(Column)，管內(nèi)裝的填料(如碳酸鈣)稱為固定相(Stationary phase)，淋洗液(如石油醚)稱為流動相(mobile phase)。 層析法實質(zhì)上是一種物理化學分離方法：即利用混合物中各組分在兩相(固定相和流動相

14、)中溶解、析出、吸附、脫附、或其他親和力和滲透性的差異，當兩相作相對運動時，使各組分在兩相中反復多次受到上述各作用力而得到互相分離。 按兩相的物態(tài)分類：用氣體作流動相稱為氣相層析(gas chromatography簡稱 GC)，用液體作流動相稱為液相層析(1iquid chromatography，簡稱LC)。 按固定相所處的形式分類：柱層析、紙層析、薄層層析 按分離過程的物化原理分類：吸附層析法、分配層析、離子交換層析、凝膠層析法、親和層析離子交換層析離子交換層析 (ion exchange chromatography) 利用固定相球形介利用固定相球形介質(zhì)表面活性基團經(jīng)質(zhì)表面活性基團經(jīng)化

15、學鍵合方法，將化學鍵合方法，將具有交換能力的離具有交換能力的離子基團在固定相上子基團在固定相上面，這些離子基團面，這些離子基團可以與流動相中離可以與流動相中離子發(fā)生可逆性離子子發(fā)生可逆性離子交換反應而進行分交換反應而進行分離的方法，稱之為離的方法，稱之為離子交換層析。離子交換層析。凝膠過濾層析凝膠過濾層析 利用凝膠層析介質(zhì) ( 固定相 ) 交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進行分離的一種方法，又稱之為排阻層析。 親和層析在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基，這些配基可以與流動相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合而

16、進行分離的一種方法疏水層析利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離的方法金屬螯合層析 利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進行分離的方法蛋白質(zhì)電泳技術(shù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：最常用的變性電泳，可以用來測定蛋白質(zhì)分子量。比層析法測定要好。 SDS 與蛋白質(zhì)的疏水部分相合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。 SDS 蛋白質(zhì)復合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。 SDS-PAGE分離蛋白等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。 等電聚焦電泳槽 雙向電泳 第一向進行等電聚焦電泳，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離. 典型圖譜典型圖譜 質(zhì)譜技術(shù)什么是質(zhì)譜（Mass