淀粉酶的提取 α淀粉酶的提取分離及測定

1、-淀粉酶的提取、分離及測定（生化試驗小組-2005.4）試驗全程安排：第一天樣品的粗處理及粗分離，包括：1） 樣品處理2） 離子交換色譜分離3） 紫外檢測（紫外測定蛋白），繪出色譜圖4） 收集樣品第二天對各峰收集樣品進行分析，包括：1） 精確測定蛋白含量（Folin-酚）2） 測定酶活3） 比活計算第三天對活性峰及原液進行分析及鑒定，包括：1） SDSPAGE分析（分子量分析）2） 純化倍數(shù)計算等試驗一、色譜分離淀粉酶1.1 試劑及設(shè)備離子交換樹脂-20冰箱樣品管（5-10ml試管）1.5ml離心管紫外分光光度計-淀粉酶樣品秒表膠頭吸管（進樣用）平衡緩沖液（pH8.0，0.01M磷酸鹽緩沖液）

2、洗脫緩沖液（平衡緩沖液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化鈉）試劑瓶1.2 離子交換色譜原理與方法色譜(chromatography)是一種分離的技術(shù),隨著現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運而生。20世紀初在俄國的波蘭植物化學(xué)家茨維特(Twseet)首先將植物提取物放入裝有碳酸鈣的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸鈣中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈現(xiàn)出不同的顏色，這樣就可以對各種不同的植物提取液進行有效的成分分離。到1907年茨維特的論文用俄文公開發(fā)表，他把這種方法命名為chromatography, 即中文的色譜，這就是現(xiàn)代色譜這一名詞的來源。但由于茨維特當(dāng)時沒有知名度，而且能看懂俄文的人也不

3、多，加之很快爆發(fā)了第一次世界大戰(zhàn)，茨維特的分離方法一直被束之高閣。 20世紀20年代，許多植物化學(xué)家開始采用色譜方法對植物提取物進行分離，色譜方法才被廣泛地應(yīng)用。自20世紀40年代以來以Martin為首的化學(xué)家建立了一整套色譜的基礎(chǔ)理論使色譜分析方法從傳統(tǒng)的經(jīng)驗方法總結(jié)歸納為一種理論方法，馬丁等人還建立了氣相色譜儀器使色譜技術(shù)從分離方法轉(zhuǎn)化為分析方法。20世紀50年代以后由于戰(zhàn)后重建和經(jīng)濟發(fā)展的需要，化學(xué)工業(yè)特別是石油化工得到廣泛的發(fā)展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。而石化成分十分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)十分相似，且多數(shù)成分熔點又比較低，氣相色譜正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明顯、有效。同樣，石

4、化工業(yè)的發(fā)展也使色譜技術(shù)特別是氣相色譜得到廣泛的應(yīng)用。氣相色譜的儀器也不斷得到改進和完善，氣相色譜逐漸成為一種工業(yè)分析必不可少的手段和工具。20世紀80年代以后我國也大規(guī)模采用氣相色譜和高效液相色譜。隨著環(huán)境科學(xué)的發(fā)展，不僅需要對大量有機物質(zhì)進行分離和檢測，而且也要求對大量無機離子進行分離和分析。1975年美國Dow化學(xué)公司的H.Small等人首先提出了離子交換分離抑制電導(dǎo)檢測分析思維即提出了離子色譜這一概念離子。色譜概念一經(jīng)提出便立即被商品化產(chǎn)業(yè)化由Dow公司組建的Dionex公司最早生產(chǎn)離子色譜并申請了專利。我國從20世紀80年代開始引進離子色譜儀器，在我國八五、九五科技攻關(guān)項目中均列有離

5、子色譜國產(chǎn)化的項目，對其進行了重點技術(shù)攻關(guān)。色譜的分類 色譜的分類有多種，主要按兩相的狀態(tài)及應(yīng)用領(lǐng)域的不同可分為兩大類 1. 按應(yīng)用領(lǐng)域不同分類 制備色譜 半制備色譜 2. 以流動相和固定相的狀態(tài)分類 氣相色譜、氣固色譜、氣液色譜、液相色譜、液固色譜、液液色譜、超臨界色譜、毛細管電泳 離子交換色譜 離子色譜分離主要是應(yīng)用離子交換的原理，采用低交換容量的離子交換樹脂來分離離子。它在離子色譜中應(yīng)用最廣泛，其主要填料類型為有機離子交換樹脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚體為骨架在苯環(huán)上引入磺酸基形成強酸型陽離子交換樹脂，引入叔胺基而成季胺型強堿性陰離子交換樹脂，此交換樹脂具有大孔或薄殼型或多孔表面層型的物理結(jié)

6、構(gòu)以便于快速達到交換平衡。離子交換樹脂耐酸堿，可在任何pH范圍內(nèi)使用，易再生處理，使用壽命長。缺點是機械強度差，易溶脹，易受有機物污染。 離子色譜基本流程圖如下圖所示：離子交換的分類及常見種類（一）分類離子交換劑分為兩大類，即陽離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強、弱兩種，即 強酸劑陽離子交換劑 弱酸劑強鹼型陰離子交換劑弱鹼型 。1.陽離子交換劑陽離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基。某些交換劑在交換時反應(yīng)如下：強酸性：R-SO3 -H+ Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOH

7、Na+ R-COONa H+國產(chǎn)樹脂中強酸1×7（上海樹脂732）和國外產(chǎn)品Dowex 50、Zerolit 225等都于強酸型離子交換劑。2.陰離子交換劑陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺N-（CH3）2和季胺-N（CH3）2等鹼性基團。某些交換反應(yīng)如下：強鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- Cl R-N+（CH3）2 ClOH-弱鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- Cl R-N+（CH3）2 HClOH-強鹼性201號國產(chǎn)樹脂和國外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強鹼型陰離子交換劑

8、。（二）種類1.纖維素離子交換劑：陽離子交換劑有羥甲基纖維素（CM-纖維素）， 陰離子交換劑有氯代三乙胺纖維紗（DESE-纖維素）。2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類交換劑，因而既具有離子交換作用，又具有分子篩效應(yīng)，是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離物質(zhì)。常用的Sephadex離子交換劑也有陰離子和陽離子交換劑兩類。陰離子交換劑有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 陽離子交換劑有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。陰離子交換劑用英文字頭A，陽離子交換劑的英文字頭是

9、C。英文字后面的數(shù)字表示Sephadex型號。3.瓊脂糖離子離交換劑：是將DESE-或CM-基團附著在Sepharose CL-6B 上形成，DEAE-Sephades（陰離子）和CM-Sepharose（陽離子），具有硬度大， 性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的流速好，分離能力強等優(yōu)點。交換劑的處理，再生與轉(zhuǎn)型新出廠的樹脂是干樹脂，要用水浸透使之充分吸水膨脹。因其含有政績一些雜質(zhì)，所要要用水、酸、鹼洗滌。一般手續(xù)如下：1. 新出廠干樹脂用水浸泡2 小時后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無離子水洗至澄清，去水2. 加4倍量0.1-2N HCl攪抖4小時，除去酸液，水洗到中性3. 再加4倍量0.1-2N NaOH

10、攪抖4小時，除鹼液， 水洗到中性備用。4. 將樹脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉(zhuǎn)型。如希望陽樹脂帶Na+，則用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時以上；如希望樹脂帶H+，可用HCl處理。陰樹脂轉(zhuǎn)型也同樣，若希望帶Cl-則用HCl，希望帶OH-則用NaOH。再生：用過的樹脂使其恢復(fù)原狀的方法稱為再生。并非每次再一都用酸、鹼液洗滌，往往只要轉(zhuǎn)型處理就行了。樹脂保存方法使用過的樹脂用大量的去離子水洗至中性后，放置于20酒精中，4冰箱保存。再次使用時，需先用大量的去離子水洗至中性，再用0.5N 氫氧化鈉和0.5N 氯化鈉處理0.5小時，洗至中性即可使用。柱上操作交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用鹼式滴定管代替

11、。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。裝柱前應(yīng)先在柱內(nèi)保留1/3的緩沖液，并排除柱底部氣泡，然后再傾入樹脂。上樣：向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液洗脫與收集不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)。1.3 試驗流程 粗酶液的制備將一定量的發(fā)酵酶粉溶于醋酸鈉或者磷酸鹽緩沖液中，4浸泡12h，1104r/min，4離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清夜進行分離。(備注：這一步驟已完成) 色譜

12、柱的準備（裝柱）按標準方法將離子交換樹脂裝填于色譜柱內(nèi)，用平衡緩沖液平衡。 -淀粉酶的分離 將一定量的樣品溶液緩慢上入色譜柱內(nèi)，先后用平衡緩沖液和洗脫緩沖液洗滌，每隔2分鐘收集一次樣品，每個樣品檢測280nm的吸光值，繪出色譜曲線。將每個峰的樣品集中起來，以備酶活和蛋白質(zhì)含量的測定。（備注：具體操作步驟及上樣量以ppt課件為準）試驗二、-淀粉酶的活性測定及比活計算1.1 試劑及設(shè)備3,5二硝基水楊酸試劑(DNS)葡萄糖標準液（10mg/ml）福林試劑淀粉溶液（10mg/ml）磷酸鹽緩沖液（pH6.0，0.02M）722 型（或721 型）分光光度計4 000r/min 的離心機分析天平1.2

13、原理與方法 Folin-酚試劑測定蛋白含量Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin 試劑）還原，產(chǎn)生深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為5100g 蛋白質(zhì)。Folin 試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。 淀粉酶活性測定淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經(jīng)

14、淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機體利用。淀粉酶主要包括-55淀粉酶和-淀粉酶兩種。-淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，其反應(yīng)式如下：淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標準濃度的麥芽糖溶液制作標準曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。淀

15、粉酶存在于幾乎所有植物中，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子，淀粉酶活力最強，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6 以下迅速鈍化。-淀粉酶不耐熱，在7015min 鈍化。根據(jù)它們的這種特性，在測定活力時鈍化其中之一，就可測出另一種淀粉酶的活力。本實驗采用加熱的方法鈍化-淀粉酶，測出-淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉酶總活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再減去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。1.3 試驗部分 Folin-酚試劑測定蛋白含量（按ppt課件為準，以下僅供參考）.1 標準曲線的制作（1）配制標準牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精確稱取0.02

16、50g 結(jié)晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL 容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸餾水沖洗數(shù)次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，則配成250g/mL 的牛血清白蛋白溶液。（2）系列標準牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通試管，按表1 加入標準濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5 試劑乙，立即混合均勻（這一步速度要快，否則會使顯色程度減弱）。30min 后，以不含蛋白質(zhì)的1 號試管為對照，用722 型分光光度計于500-650nm 波長下測定各試管中溶液的光密

17、度并記錄結(jié)果。（3）標準曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量（g）為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制標準曲線。.2 樣品測定將各峰收集的樣品經(jīng)一定稀釋后，按標準曲線的步驟進行測定。以緩沖液作為空白對照。 淀粉酶活性測定.1 標準曲線的繪制分別吸取1.0葡萄糖標準溶液岳陽家政1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸餾水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的標準溶液，按表A1的操作步驟一起反應(yīng)。以葡萄糖含量為縱坐標（0.5ml以上稀釋液葡萄糖含量分別為：100、200、300、400、500、600g），以吸光值為橫坐標，繪制標準曲線，列

18、出直線回歸方程（Y=KX+B）。.2 樣品測定將各峰收集的樣品經(jīng)一定稀釋后按下表所示步驟操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物開始，向每支管中加入試劑的時間間隔要絕對一致：表A1反應(yīng)順序樣品，標準樣品空白標準空白樣品稀釋液（ml）0.50.5蒸餾水（ml）0.550預(yù)熱5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.5（第二步）1.5（第二步）混合50保溫30min依次加入DNS試劑（ml）3.03.0（第一步）3.0（第一步）混合100煮沸7min（第一步）冷卻蒸餾水（ml）101010混合均勻總體積（ml）15.015.015.0反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，毛孔大怎么辦如出現(xiàn)混濁需在離心機上以4,000rpm離心10min，上清液以標準空白調(diào)零，在分光光度計540nm波長處測定樣品空白（A0）和樣品溶液（A）的吸光值，AA0為實測吸光值。用直線回歸方程計算樣品淀粉酶的活性。.3 活性計算酶活力單位定義：在60、PH6.0條件下，每小時從1的可溶性淀粉溶液中釋放出1微摩爾葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）淀粉酶活性U按下式計算： K（AA0） S（3060）180 U =