胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

1、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，原代與繼代培養(yǎng)及鑒定劉亭目錄前言 21分離制備PMS組織的選取 32臍帶，胎盤MSC勺分離與純化 52.1胎盤組織的獲取，存儲(chǔ)與清洗 52-2臍帶，胎盤MSC勺分離及純化方法 63原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng) 103-1培養(yǎng)基 103-2培養(yǎng)密度 113-3培養(yǎng)條件 113-4換液 113-5傳代培養(yǎng) 123-6細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)速度123-7 MSC的凍存與復(fù)蘇： 124細(xì)胞表面抗原檢測(cè) 135生長(zhǎng)曲線136細(xì)胞周期 137分化潛能 13參考文獻(xiàn)13附件1不同實(shí)驗(yàn)室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分離 MSC勺方法.15臍帶血 15臍帶 15羊膜 17絨毛膜 18蛻膜層 18胎盤 1

2、9整體灌注法 20附件2背景知識(shí) 20附件3 PMSC實(shí)驗(yàn)所需試劑 21刖言干細(xì)胞(Stem cell, SC)是一種能夠自我更新且未分化并可分化成兩個(gè)或兩 個(gè)以上其它品系的細(xì)胞。在一定的條件下，干細(xì)胞能夠分化成為多種成熟細(xì)胞類 型。按照來源和分化潛能不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(Embryo nic stem_cell，ESC)和成體干細(xì)胞(Adult stem cell，ASC)兩類。胚胎干細(xì)胞 來源于早期的胚 泡和胚胎內(nèi)層的細(xì)胞群，并且具有向3個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力。但是胚胎干細(xì)胞 應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的免疫排斥、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中引發(fā)腫瘤生成以及所涉及的倫理問題等影響 并制約了臨床應(yīng)用。成體干細(xì)胞形成于原

3、腸胚形成后的胎兒和成體組織，早期研究認(rèn)為，成體干細(xì)胞主要分化為其來源組織的細(xì)胞類型。然而，近幾年來的很多研究表明，成體干細(xì)胞具有能夠分化成為除來源以外的其他胚層組織的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又稱為基質(zhì)干細(xì)胞，是屬于 成體干細(xì)胞的一種，最早從骨髓中分離而來。MSC是由早期中胚層發(fā)育而來的非造血成體干細(xì)胞，該細(xì)胞在體外可以貼壁生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)梭狀。胞質(zhì)豐富，細(xì)胞 核呈圓形，1-3個(gè)核仁。在適當(dāng)?shù)臈l件下可以大量擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)祖細(xì)胞， 進(jìn)而分化成包括三個(gè)胚層的各種組織細(xì)胞，如脂肪、骨、軟骨、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖 維細(xì)胞等。MSC具有低的免疫原性、能向腫瘤遷

4、移、具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持等功能， 而且易于外源基因?qū)氡磉_(dá)，是基因治療中重要的載體細(xì)胞。此外，一些研究學(xué) 者還發(fā)現(xiàn)，MSC具有類似免疫抑制劑作用，可抑制 T淋巴細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞 中的免疫反應(yīng)，并同時(shí)抑制 T細(xì)胞的異基因增殖反應(yīng)。所以，MSC在治療組織 缺損、器官退行性疾病、腫瘤及免疫疾病具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。 近年來MSC 已逐步成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)(張慧娟等，2014)。目前所報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源 于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖 然分離方法簡(jiǎn)便，但供者取骨髓需要經(jīng)歷一個(gè)比較痛苦的手術(shù)， 并在取材過程中 及取材后會(huì)有很高的感染機(jī)會(huì)；由于人體骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量極其稀少， 每

5、105-106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中大約只有1個(gè)；而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質(zhì) 干細(xì)胞的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用 中受到限制。其他組織中，如動(dòng)員的外周血、乳牙、臍帶、臍血也存在間充質(zhì)干 細(xì)胞，然而，從這些組織中獲得的細(xì)胞數(shù)量較為有限。以上因素，都限制了間充 質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和臨床中的運(yùn)用。目前胎盤或臍帶屬于臨床廢棄物，容易獲得，并且無(wú)污染，取材研究和應(yīng)用 基本無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，研究表明胎盤或臍帶含有豐富的MSC。有研究表明PMSC比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更容易分離培養(yǎng)， 細(xì)胞活性更好，還可誘導(dǎo)分化成脂肪，成 骨等多種細(xì)胞。并且這些胎盤源的間充質(zhì)干細(xì)胞（placenta

6、-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有極低的免疫原性，大多數(shù)患者對(duì)于胎盤或臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞具有天然的免疫耐受，因此，人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在研究相關(guān)疾病的動(dòng)物 模型中，即便是人-動(dòng)物模型間的異種間移植，由于存在天然的免疫耐受，對(duì)實(shí) 驗(yàn)研究的結(jié)果影響甚小，這對(duì)于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。目前MSC主要臨床應(yīng)用于抑制移植物抗宿主反應(yīng)。動(dòng)物模型研究結(jié)果表明 PMSC對(duì)子宮內(nèi)膜損傷（劉芳，2013），大鼠肝組織損傷（宮黎明等，2011）, APP+ 轉(zhuǎn)基因鼠阿爾茨海默?。ü鶃喣械?，2009）均有療效，也可以用于構(gòu)建組織工程 皮膚（徐彪等，2013）。

7、所以，綜合充分利用胎盤和臍帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞新來 源，優(yōu)化分離純化以及傳代培養(yǎng)條件，加快細(xì)胞繁殖速度，降低培養(yǎng)成本以高 效率獲取大量的PMSC對(duì)于的各種疾病實(shí)驗(yàn)研究及醫(yī)院各個(gè)科室的臨床應(yīng)用， 都具有重要意義。1分離制備PMSC組織的選取胎盤起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層， 人足月娩出的胎盤由羊膜層、絨毛膜層 和蛻膜層組成。從 臍帶血（于海微等，2009；管英華等，2011），臍帶（徐燕等， 2009;韓之波等，2012；管英華等，2011;李艷琪等，2014；趙琳等，2016）， 整個(gè)胎盤（陸琰等，2009；沙文瓊等，2010；劉洋等，2015；賴平等，2016）， 胎盤的羊膜層（宮黎明等，201

8、1；徐彪等，2013；張慧娟等，2014；叢姍等，2015）， 絨毛膜層（洪艷等，2014；韓之波等，2012）和蛻膜層（韓之波等，2013）分離 培養(yǎng)MSC均有報(bào)道。目前大多數(shù)研究者取胎盤小葉（包括絨毛層和絨毛滋養(yǎng)層） 進(jìn)行分離（洪艷等，2014）。胎盤的細(xì)胞成分較復(fù)雜，既有滋養(yǎng)細(xì)胞，也有間質(zhì) 細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和Hofbauer細(xì)胞（沙文瓊等，2010）。由胎盤組織分離制備MSC時(shí)不可避免會(huì)有其它細(xì)胞的干擾（苗宗寧等，2009）,其中以數(shù)量最多的血 細(xì)胞干擾為主。分離MSC選取組織時(shí)需要考慮哪個(gè)部位的組織可能含有最多的 MSC，并且盡可能降低其它種類細(xì)胞的干擾，以獲得純度高，活力強(qiáng)的MSC

9、。對(duì)于人臍帶血來源的 MSC （ human umbilical cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否穩(wěn)定傳代擴(kuò)增，曾有一定爭(zhēng)議，后來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證 實(shí)臍帶血中存在MSC，并表明臍帶血來源 MSC與骨髓來源MSC具有相同的生 物學(xué)特性及功能特征（于海微等，2009）。但是臍帶血中也存在多能成體干/祖細(xì) 胞，分離間充質(zhì)干細(xì)胞的過程以丟失造血干細(xì)胞為代價(jià)，而且個(gè)體差異大（徐燕等，2009）。臍帶包括一條靜脈和兩條動(dòng)脈，周圍是 Wharto n' s Jelly外層由羊膜來源的 上皮包裹，從發(fā)育角度來說，臍帶是干細(xì)胞形成及所經(jīng)通路（管英華等，2011）。不同研究機(jī)構(gòu)均

10、從人臍帶組織中分離到 MSC （human umbilical cord MSC, hUC-MSC ）。已有研究表明人臍帶的結(jié)締組織是間充質(zhì)干細(xì)胞豐富的組織來源（徐燕等，2009），故制備hUC-MSC一般剝離臍帶動(dòng)靜脈和外層上皮。管英華等（2011）比較了臍血和臍帶兩種來源的MSC原代培養(yǎng)過程，結(jié)果表 明臍血中細(xì)胞成分復(fù)雜，原代培養(yǎng)多見成纖維樣和大圓形破骨樣兩種形態(tài)的貼壁 細(xì)胞，隨著換液和傳代破骨樣細(xì)胞逐漸減少和消失， 剩下形態(tài)較為單一的呈漩渦 樣的細(xì)胞集落；臍帶來源培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞不會(huì)隨換液丟失，且細(xì)胞形態(tài)以成纖維 樣細(xì)胞為主，種類單一。hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培養(yǎng)的時(shí)間短，

11、培養(yǎng)成 功率明顯增高。羊膜是胎膜最內(nèi)層，胎盤包裹胎兒面的一層薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成，在胎盤面與絨毛膜相貼，由人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞組 成，其表面沒有神經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織。人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞來源于原條 期的胚胎中胚層，而人羊膜上皮細(xì)胞來源于胚胎外胚層。越來越多的研究已證實(shí)， 人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞都具有干細(xì)胞的特征。其中人胎盤羊膜來源 的間充質(zhì)干細(xì)胞（human amnion-derived mesenchymal cells, hAD-MSCs 不但表 達(dá)成體干細(xì)胞特性中的間充質(zhì)干細(xì)胞特性也表達(dá)部分胚胎干細(xì)胞特性，相關(guān)研究表明人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)胚胎

12、干細(xì)胞全能型標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子基因OCT4、SOX2和NANOG （張惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性標(biāo)志（宮黎 明等，2011）,近年來發(fā)現(xiàn)hAD-MSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，可分化成來自3個(gè) 胚層的所有細(xì)胞（宮黎明等，2011）。有研究比較人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)均 明顯高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（徐彪等，2013）。洪艷等（2014）分別從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層分離并培養(yǎng)MSC，發(fā)現(xiàn)在分離 過程中，從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層得到的細(xì)胞量都很多，絨毛滋養(yǎng)層的細(xì)胞量甚至?xí)浇q毛膜的細(xì)胞量。但是在接種后培養(yǎng)

13、時(shí)，由于絨毛滋養(yǎng)層血細(xì)胞較多，血 細(xì)胞難以處理，影響間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁，無(wú)法貼壁就無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)，由此導(dǎo)致 后期細(xì)胞生長(zhǎng)慢，收獲細(xì)胞少。韓之波等（2013）的研究表明來自母體的 底蛻膜組織也可以分離制備MSC。 苗宗寧等（2009）將胎盤組織分為3組，分別是中央帶組即臍帶附著處，邊緣帶組即距臍帶附著點(diǎn)最遠(yuǎn)處和中間帶組即兩者之間中點(diǎn)處。分別全層連續(xù)切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29分別做免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色，顯 微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)及分布分布區(qū)域， 結(jié)果表明中間層的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與表 達(dá)水平強(qiáng)于絨毛板層和底板層；同為中間層，中央帶較中間帶及邊緣帶表達(dá)更強(qiáng)。由此推測(cè)，在接近血管豐富的

14、臍帶附著部的胎盤中間層取材易于獲得較豐富的 PMSCs。2臍帶，胎盤MSC的分離與純化2.1胎盤組織的獲取，存儲(chǔ)與清洗母血檢測(cè)HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均為陰性。產(chǎn)婦無(wú)傳染性疾病，胎兒無(wú)先天性疾病。臨床足月正常剖宮產(chǎn)后胎盤，大小及質(zhì)量在正常范圍 內(nèi)，胎盤臍帶附著點(diǎn)均在胎盤中央稍偏位。經(jīng)與產(chǎn)婦及其家屬簽署知情同意書， 實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在產(chǎn)房無(wú)菌條件下獲取臍帶，胎盤。文獻(xiàn)報(bào)道中取組織后有如下處理方法：立即浸入胎盤儲(chǔ)存袋（加拿大 LABPLAS公司的無(wú)菌采樣袋，含99%低糖DMEM，1%雙抗即青鏈霉素的組織保護(hù)液），在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。臍帶靜置于4 C冰箱1

15、2h，觀察保存臍帶的PBS液，若無(wú)渾濁說明無(wú)感染。臍帶采集后在6 h內(nèi)進(jìn)行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分。無(wú)菌采集健康足月剖宮產(chǎn)羊膜，冰盒中 2h內(nèi)運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入試驗(yàn)流程。無(wú)菌采集健康足月剖宮產(chǎn)胎盤，并立即進(jìn)入分離提取程序。文獻(xiàn)報(bào)道中組織塊的用量及獲得：胎盤組織約50 g35個(gè)胎盤小葉剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL眼科手術(shù)剪將組織剪碎（細(xì)碎小塊；1mm3大小；呈肉糜狀，以能用吸管吸 取為標(biāo)準(zhǔn)；約3mm； 5 mm3大小的碎塊）組織絞碎分離機(jī)（近似肉糜）文獻(xiàn)中的組織浸泡液/清洗液：#生理鹽水# D-Hank'平衡液#磷酸緩沖液（PBS）#杜氏磷酸緩沖液（D-PBS）#含肝素的PBS

16、#含有雙抗生素的PBS （0.1%的青鏈霉素，1%的青鏈霉素,100 U/mL青霉素,100 g/mL鏈霉素）#含有青霉素和鏈霉素的無(wú)血清 DMEM /F12培養(yǎng)基2-2臍帶，胎盤MSC的分離及純化方法已報(bào)道臍帶，胎盤MSC的分離方法有組織塊貼壁法，酶消化法以及整體灌 注法。組織貼壁培養(yǎng)法得到的細(xì)胞純度較高，對(duì)細(xì)胞傷害小，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，將 組織塊剪碎、貼壁后加培養(yǎng)基培養(yǎng)即可，但原代培養(yǎng)所需周期較長(zhǎng)、獲得細(xì)胞數(shù) 量相對(duì)有限。李艷琪等（2014）在首次組織塊貼壁培養(yǎng)獲得 MSC后，將組織塊 轉(zhuǎn)移到新的培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，兩三天后仍可見到貼壁細(xì)胞，第5天可形成明顯的細(xì)胞克隆。這種改進(jìn)的 組織塊二次貼壁方

17、法 可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量原代細(xì) 胞。酶消化法可直接將消化得到原代細(xì)胞，但是獲得的細(xì)胞純度略低、狀態(tài)不均一，由于消化時(shí)間不易掌握，消化時(shí)間過短不能得到足量細(xì)胞， 消化時(shí)間過長(zhǎng)會(huì) 對(duì)細(xì)胞造成傷害，損傷細(xì)胞膜成分，導(dǎo)致無(wú)法貼壁生長(zhǎng)，影響細(xì)胞的成活率和增 殖能力，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，給后續(xù)培養(yǎng)帶來困難（李艷琪等，2014）;對(duì)于某些組織如臍帶 Wharton'膠經(jīng)酶消化后的膠體黏稠，不易離心。徐燕等 2009比 較，植塊法培養(yǎng)610 d可見成纖維樣細(xì)胞從植塊邊緣爬出，在原代細(xì)胞克隆數(shù)、 細(xì)胞產(chǎn)率、傳代時(shí)間及擴(kuò)增倍數(shù)上明顯好于膠原酶消化法 （1 g/L膠原酶U 3.05.0 mL，置于含雙抗的P

18、BS中，37 C孵育0.5 h）比較存在差異；而膠原酶與胰酶 聯(lián)合消化法（1 g/L膠原酶U于37 C孵育16 h,以PBS洗滌后加入25 g/L胰酶 于37 C孵育0.5 h）接種后未見明顯貼壁細(xì)胞。常用的酶包括胰蛋白酶，膠原蛋 白酶I，U和W。胰蛋白酶消化能力強(qiáng)，U型膠原酶消化能力相對(duì)較弱，但對(duì)細(xì) 胞膜損害較小。很多研究者對(duì)酶的濃度，消化時(shí)間，消化方式，多種消化酶聯(lián)合 消化做了大量探索。尋求既能充分的分離細(xì)胞，又能避免細(xì)胞的損傷的方法（賴 平等，2016）組織經(jīng)酶消化后需要用篩網(wǎng)/多層紗布過濾（100 目, 200 目, 300 目, 100叩 的濾器），除去未被消化的大組織塊。濾出的細(xì)胞

19、成分復(fù)雜，常含有大量的血細(xì) 胞?，F(xiàn)階段用于分離 純化方法間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有以下幾種：一般離心、 密度梯度離心法、貼壁篩選法、紅細(xì)胞裂解液法、淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）、羥乙基淀粉沉淀、流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法。因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異的 表面標(biāo)志，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法會(huì)損失大量細(xì)胞，且成本高。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，使用紅細(xì)胞裂解液對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的損傷大，使用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離的可重復(fù)性較差，技術(shù)不穩(wěn)定（洪艷等，2014）。文獻(xiàn)中報(bào)道的消化酶的濃度，消化時(shí)間，次數(shù)及組合消化：機(jī)械剝離胎盤羊膜組織，PBS反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細(xì)碎小塊，0.25% 胰酶37 C消化1

20、0 min,過100目篩網(wǎng)過濾獲得細(xì)胞液。經(jīng)胰酶消化后的組織塊， 繼續(xù)經(jīng)0.1%W型膠原酶37C消化15 min。含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的 L-DMEM終止反應(yīng)后，過100目篩網(wǎng)獲得細(xì)胞液。兩次收集的細(xì)胞液1 000 r/min 離心10 min，棄上清液（徐彪等，2013）。將胎盤組織碎片置于200 mL無(wú)菌離心管中，聯(lián)合應(yīng)用0.25%胰蛋白酶和0.1% I型膠原酶消化胎盤組織碎片。37 C搖床消化30 min，去除組織留取消化 液，經(jīng)1 500 r/min離心5 min，收集離心獲得的細(xì)胞沉淀。將離心后收集到的細(xì) 胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基（劉洋等，2015）

21、。剪碎羊膜，加入0.5 g/L胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na消化液，37C, 200 r/min 旋轉(zhuǎn)消化10 min，棄上清，再加入消化液，37E旋轉(zhuǎn)消化30 min,棄上清，按同樣的程序再 重復(fù)消化2次。經(jīng)胰酶消化后剩余的組織用 D-PBS液沖洗，加 入 0.75 g/L U 型膠原酶-0.075 g/L DNase I 消化液，37 C、200 r/min旋轉(zhuǎn)消化2.03.0 h,直至組織完全消化，經(jīng)300目 不銹鋼網(wǎng)過濾，收 集細(xì)胞濾液，1 500 r/min,離心10 min,棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于LG-DMEM培 養(yǎng)基（宮黎明等，2011）。張慧娟等（2014）無(wú)菌條件下取

22、正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜剪成碎片，分別通過7種消化方法，發(fā)現(xiàn)用 0.05 g/L的胰蛋白酶連續(xù)消化 2次每次消化30 min，然后用1 g/L的膠原酶消化60 min是最合適的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外 分離培養(yǎng)條件。0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L膠原酶I消化60 min0.75 g/L膠原酶I直接消化120 min0.05 g/L胰蛋白酶與0.75 g/L膠原酶I同時(shí)消化60 min0.05 g/L的胰酶消化30 min后，再加0.75 g/L膠原酶I消化30 min0.05 g/L的胰蛋白酶連續(xù)兩次消化30 min后，再加入0.75 g/L的I型膠原酶消化60

23、 min0.05 g/L的胰酶連續(xù)2次消化40 min后，再加0.75 g/L膠原酶I消化60 min0.05 g/L的胰酶連續(xù)2次消化30 min后，再加1 g/L的I型膠原酶消化60 min取前處理的樣品在37 C下，用0.05 g/L的胰蛋白酶連續(xù)2次消化30 min, 用含體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后 200目細(xì)胞篩 過濾，篩中組織經(jīng)PBS沖洗后裝入培養(yǎng)皿中，然后加入1 g/L的I型膠原酶，在 37 C下消化60 min，之后用含體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清DMEM終止消化，輕柔 吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，濾液在1 500 r/min的離心機(jī)中離心5 min，去

24、上 清液，換DMEM/F12培養(yǎng)基混懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿中（張慧娟等， 2014）。用眼科手術(shù)剪將羊膜剪碎約1 mmx 1 mm組織塊，加入等體積的0.05% trypsin-EDTA , 37 C水浴震蕩消化30 min后加入含血清的培養(yǎng)液，離心去上清，如此反復(fù)消化兩次，再用PBS洗23次，盡可能去除上皮細(xì)胞。用細(xì)胞 篩過濾后剩余的羊膜組織加入不同濃度I型膠原酶（0.75、1.00和2.00 mg/mL）,37 C水浴震蕩消化60 min,加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，混勻后用200目細(xì)胞篩過濾，再將濾液1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞（叢珊等，2015）。按體積比約1 : 6加入

25、U型膠原酶（0.1% ），置于37 C恒溫水浴箱中消 化30 min，間隔5 min適當(dāng)混勻組織與消化液。之后紗布過濾，上淋巴細(xì)胞分 離液（賴平等，2016）。使用pH 7.4、含25 mmol/LHEPES的D-Hank'作為消化緩沖液，加入終濃 度為2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNaseI組成消化液，沖洗后的胎盤組織分階段消 化，每個(gè)階段在恒溫氣浴搖床中 37 C、180 r/min消化20 min （沙文瓊等，2010）。用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm3大小的碎塊U型膠原酶10mL （酶消化終濃度0.1% ），置于搖床內(nèi)37 C、250 r/mi n振蕩，約

26、90 min后 終止消化（洪艷等，2014）。文獻(xiàn)中報(bào)道的純化方法：將細(xì)胞懸液緩慢加至已配好的 淋巴細(xì)胞分離液中。1 500 r min-1， 4C離心 20 min,離心后可見白膜層”小心吸取該區(qū)域細(xì)胞，并加入 4倍于該體積的 PBS稀釋，1000 rmin-1,常溫下離心5 min。重復(fù)一次，棄上清（賴平等，2016）Percoll梯度密度分離：在50 mL離心管中逐層鋪入7個(gè)密度的Percoll分離 液,每個(gè)密度5 mL。再緩緩加入5 mL細(xì)胞懸液，使用水平離心機(jī)室溫下1 200 g 離心20 min。小心棄除離心管20 mL刻度以上的液體，收集12.520.0 mL刻度 的細(xì)胞層（滋養(yǎng)

27、細(xì)胞）和12.57.5 mL刻度（胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞）的液體，分別放入不 同離心管里，用D-Hank '液稀釋5倍后，室溫下1 000 g離心15 min （沙文瓊等， 2010）。陸琰等（2009）比較了四種胎盤組織分離純化從 MSC的方法：膠原酶IV +羥 乙基淀粉沉淀組、膠原酶n+羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶n+淋巴細(xì)胞分層液 分離組、膠原酶n+氯化銨裂解紅細(xì)胞組。與膠原酶 n+羥乙基淀粉沉淀組比 較，其余3組獲取的細(xì)胞數(shù)均明顯減少（t =2.928.16, P < 0.05）。在其他條件 相同的情況下，膠原酶n +羥乙基淀粉沉淀組培養(yǎng)成功率為100%,其余3組分 別為 80%,

28、 80%, 20%。剪碎的胎盤組織與1 g/L膠原酶U中，37 C消化45 min。然后過細(xì)胞篩網(wǎng)， 收集各組細(xì)胞懸液，分別于室溫以1 000 r/min離心5 min,棄上清。用PBS重懸 細(xì)胞，加入60 g/L羥乙基淀粉（體積比為4:1）充分混勻，室溫靜置45 min，小 心吸取上清，1 000 r/min離心5 min,棄上清，PBS洗滌2次。以完全培養(yǎng)基重 懸，制成單細(xì)胞懸液，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。按1.5X 109 L-1密度接種于T-25 塑料培養(yǎng)瓶中（陸琰等，2009）。3原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)3-1培養(yǎng)基從文獻(xiàn)報(bào)道可以看出，需要10%胎牛血清，低糖的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，1

29、00U/mL青霉素+100/mL鏈霉素，此外可選的有5用/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10 pg/L表皮生長(zhǎng)因子，10舊/L血小板衍生生長(zhǎng)因子。文獻(xiàn)中報(bào)道的培 養(yǎng)基：# 10%胎牛血清的L-DMEM完全培 養(yǎng)基# 5用/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和10血/L表皮生長(zhǎng)因子的L-DMEM完全培養(yǎng) 基#10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基 # LG-DMEM培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55 pmol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉 素和100 g/L鏈霉素）# DMEM/ F12+10% FBS+10 ng

30、/mL bFGF+100 U/mL 青霉素 +100 pg/mL 鏈霉素# 10%的胎牛血清的低糖DMEM #含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM/F12#含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基#完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清、40% MCDB201、10 pg/L血小板衍生生長(zhǎng)因子、10 pg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10用/L表皮生長(zhǎng)因子的DF12培 養(yǎng)基）# DMEM+ 體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清 +1% enicillin-Streptomycin+5 pg/L 堿性成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3-2培養(yǎng)密度原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種

31、密度可能對(duì)成功培養(yǎng)有影響，于海微等（2009）試驗(yàn)了 5X108L-1、1X 109 L-1、5X 109 L-1、 1X 1010 L-1 的接種密度，發(fā)現(xiàn)以 5X108 L-1 密度 接種時(shí)細(xì)胞一直無(wú)法傳代，以5X 109 L-1的密度接種時(shí)細(xì)胞貼壁時(shí)間、出現(xiàn)伸展 時(shí)間及原代培養(yǎng)時(shí)間均顯著短于其他接種密度。文獻(xiàn)中報(bào)道的接種密度：8 -12.2X108 L11.5X 109 L-11 X106/cm21 X108 L-13X106/皿， 接種若干？100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿3-3培養(yǎng)條件37 C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5% C02孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3-4換液細(xì)胞生長(zhǎng)消耗培養(yǎng)基的養(yǎng)分，同時(shí)產(chǎn)生代謝廢物，限

32、制細(xì)胞生長(zhǎng)，所以需要 及時(shí)換液，但是換液太頻繁會(huì)造成浪費(fèi)，此外可以胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)， 可以利用此特性在換液時(shí)與其他雜細(xì)胞進(jìn)一步分離，但在培養(yǎng)早期，胎盤間充質(zhì) 干細(xì)胞貼壁不牢固，第一次換液時(shí)間過早將損失獲取的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。故需 要通過實(shí)時(shí)觀察并根據(jù)實(shí)際情況探究合適的原代培養(yǎng)的第一次換液時(shí)間和后續(xù) 培養(yǎng)的換液頻率。文獻(xiàn)中報(bào)道的首次換液時(shí)間有2d，3d，7d全量或半量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每三四天換液 1次。文獻(xiàn)中報(bào)道的換液時(shí)間和方式：每3 d全量換液1次培養(yǎng)48 h后半量換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每三四天換液1次7d后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，每三四天換液1次3 d后半量換液

33、，1周后再次換液，此后每隔3 d換液1次57 d后全量換液，以后每3 d換液3d全量換液，以后每周換液2次3d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)2d后全量換液2d換液，以后每3 d換液1次3-5傳代培養(yǎng)待原代培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁連生面積達(dá) 70%90%后（貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至70% -90% 融合時(shí)），用胰酶消化（2.5 g/L胰酶或0.25%胰酶或1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二 胺四乙酸），按1: 2或1: 3或1 : 4的比例傳代，或以（2.55.0）X 103/cm2密 度接種傳代培養(yǎng)。（消化時(shí)間？去除培養(yǎng)基后加酶消化？胰蛋白酶用 PBS還是培 養(yǎng)基溶解？每個(gè)培養(yǎng)瓶用多少量的酶消化？）3-6細(xì)胞形態(tài)與生

34、長(zhǎng)速度 3-7 MSC的凍存與復(fù)蘇:凍存液中DMSO的濃度可能對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，叢珊等（2015）對(duì)此進(jìn) 行過實(shí)驗(yàn)，將3組不同凍存液凍存的hAMSCs凍存48 h后進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。冷 凍保護(hù)液一： 5% 二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO） + 50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 +45% DMEM/F12。冷凍保護(hù)液二：10% DMSO + 50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+40% DMEM/F12。冷凍保護(hù)液三：20% DMSO + 50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+30% DMEM/F12 結(jié)果顯示，DMSO濃度為5%時(shí)，細(xì)胞在2 h后開始貼壁，4 h時(shí)幾乎全部細(xì) 胞貼壁；DMSO濃度為10%和 20

35、%的兩組活力較差，細(xì)胞仍是圓形，且無(wú)貼壁 現(xiàn)象。復(fù)蘇培養(yǎng)：解凍時(shí)從液氮罐中取出冷凍管，將其放入 37 C水浴鍋迅速融化 約12 min （或放入37C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中使其融化）。將凍存 管中液體加入有培養(yǎng)基的離心管中，1500 r/min離心5 min,去掉上清，接種到 新的培養(yǎng)基皿中，于37C、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，第2天更換培養(yǎng)液（叢珊等，2015）。4細(xì)胞表面抗原檢測(cè)由于培養(yǎng)細(xì)胞的形狀不能作為鑒別細(xì)胞類型的主要特征標(biāo)志，因此，通常都采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面抗原分子進(jìn)行鑒定。不同的研究人員觀察到MSC表達(dá)不同的表面標(biāo)記，造成這種情況的原因有很多，包括MSC的來

36、源、 供者的年齡、提取的方法和擴(kuò)增的條件等都會(huì)影響MSC的表面標(biāo)記（韓之波等，2012）。國(guó)際上對(duì)于 MSC的鑒定仍具爭(zhēng)議，目前認(rèn)可度較高的ISCT （國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)）間充質(zhì)干細(xì)胞委員會(huì)制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)。流式細(xì)胞儀分析鑒定MSC 應(yīng)細(xì)胞表達(dá)黏附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記 CD73、CD90、CD105，整合蛋白家族 CD29,以及透明質(zhì)酸鹽受體 CD44，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記 CD11b、CD34、CD45 和 HLA-DR。5生長(zhǎng)曲線6細(xì)胞周期7分化潛能參考文獻(xiàn)郭亞男，關(guān)方霞，李國(guó)棟，李祥生，楊波，杜英，胡祥，胡煒，焦紅亮，李遠(yuǎn)人羊 膜間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療阿爾茨海默病 APP+轉(zhuǎn)基因鼠的有效性及

37、安全 性評(píng)估J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009, 13（10）:1811-1818.韓之波，王有為，王濤，池穎，楊舟鑫，及月茹，孟磊，楊萍，韓忠朝.人胎盤底 蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其生物學(xué)特性研究J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志， 2013, 21（ 3）： 754-759.韓之波，楊舟鑫，池穎，王有為，王濤，及月茹，楊萍，孟磊，韓忠朝人臍帶胎 盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較研究J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2012, 20( 3): 692-696.洪艷，霍思維，陸瑤，章毅.人胎盤不同組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性J.中國(guó)組織工程研究，2014, 18(19):3082-3087.李艷琪

38、，王洪一，姚堯，劉晶晶，徐瀟，張宇，劉洋，吳祖澤，靳繼德.人臍帶源 間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)J.中國(guó)組織工程研究，2014, 18(10):1609-1614.劉芳，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素治療宮腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究D.南方醫(yī)科大學(xué),2013.劉洋，李艷琪，王洪一，吳曉冰，荊永光，徐瀟，姚堯,張宇，吳祖澤，靳繼德.胎 盤源間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的新方法J.中國(guó)組織工程研究，2015, 19(10):1608-1612.陸琰，陳麗，張洹.人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 4種消化分離方法的效果比較J.中國(guó) 組織工程研究與臨床康復(fù)，2009, 13(6):10147-1020.苗宗寧，徐秋嵐，呂國(guó)忠，王玲

39、，張學(xué)光.間充質(zhì)干細(xì)胞在人胎盤組織中的染色 定位及整體灌注分離培養(yǎng)J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009, 13(36):7133-7137.賴平，陳懿建，羅耀玲，張敏鴻，楊建瓊，邱悅?cè)?人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定J.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016, 36(2)： 183-186.沙文瓊，王自能，王冬菊.人胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010, 14(10):1833-1837.徐彪，李芳，孫青，許云云，趙娟，梁含思，馬樹立，陳永珍.羊膜上皮細(xì)胞和羊 膜間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚J.中國(guó)組織工程研究，2013, 17(41):721

40、3-7220.徐燕，李長(zhǎng)虹，孟恒星，郝牧，邱錄貴.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu) 化及其生物學(xué)特性J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009, 13(32):6289-6294.于海微，李佩玲,莊如錦，李會(huì)明.人臍帶血和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、分化及生物學(xué)特性比較J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13（6） :1021-1024.附件1不同實(shí)驗(yàn)室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分離MSC的方法臍帶血分娩后穿刺臍靜脈抽取50 mL臍帶血液，4C冰箱保存，12 h內(nèi)分離，用 Hank' 5平衡液稀釋臍帶血，稀釋血液緩慢疊加于Ficoll上，離心，吸出乳白色云霧狀單個(gè)核

41、細(xì)胞，洗滌離心2次，將獲得的單個(gè)核細(xì)胞分別以5X108/l密度種 植入25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基吹打，混勻。置于37C、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，57 d后全量換液，以后每3 d換液，并 逐日觀察細(xì)胞貼壁延伸時(shí)間、原代培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞生長(zhǎng)情況 （于海微等，2009）。距胎兒5-7cm的臍帶處進(jìn)行雙結(jié)扎，剪斷臍帶，消毒母?jìng)?cè)臍帶斷端，穿刺臍 靜脈抽取臍血40-120mL，加肝素抗凝，4h內(nèi)分離（管英華等，2011）。淋巴細(xì) 胞分離液法：將臍帶血與無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基1:1體積比混合，緩慢加至含 有等體積的Ficoll （密度為1.077g/L ）分離液上，

42、1800r/min離心20min，取中間 白膜層，經(jīng)培養(yǎng)基以1000r/min離心10min洗滌2次，細(xì)胞接種密度為5*107接 種至25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37C, 5%的CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá) 到80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等，2011）。羥乙基淀粉沉降與淋 巴細(xì)胞分離液兩步分離法：將臍帶血與6%羥乙基淀粉按4:1的體積比混合，常 溫下靜置30-45min，取上清液，1000r/min離心10min，棄去上清，培養(yǎng)基重懸 細(xì)胞將其緩慢加至含有等體積的 Ficoll （密度1.077g/L ）分離液上（管英華等， 2011）。臍帶將無(wú)菌條件下取得的足月妊娠分娩胎

43、兒臍帶，用PBS洗3次，去掉殘留的血細(xì)胞。把臍帶剪切成2.0 cm左右的片段并剔除血管（1條臍靜脈，2條臍動(dòng)脈）， 取出其中的凝膠狀組織，將其剪成大小約 1 mm3的組織塊，然后置于培養(yǎng)瓶中。6 h后，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素 的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置在37C、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后 半量換液，1周后再次換液，此后每隔3 d換液1次。觀察貼壁組織周圍的細(xì) 胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合度時(shí)，用胰酶消化傳代，并將組織轉(zhuǎn)移 到一個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)，獲得第二次組織塊貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞（李艷琪等，20

44、14）。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法：在無(wú)菌條件下取出的臍帶組織，用含有青霉素和鏈霉素的 無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌去除殘存血，去除外包膜與臍動(dòng)靜脈血管，將剩 余組織剪碎至1mm3大小，轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37C、5%CO2飽和濕度條件 下細(xì)胞培養(yǎng)箱中直接貼壁培養(yǎng)。5-7d首次換液，貼壁細(xì)胞融合接近80%時(shí)，0.25% 胰蛋白酶消化傳代（管英華等，2011）。酶消化培養(yǎng)法：將以上方法處理的去除 外包膜與動(dòng)靜脈后的臍帶組織，經(jīng) 0.1%膠原酶和0.25%胰酶消化，無(wú)血清 DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌，以1.0*106/cm2接種到T2瓶（管英華等，2011）。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：臍帶采集后在 6

45、h內(nèi)進(jìn)行處理，切除雙側(cè)帶夾 痕及淤血的部分，用含雙抗的 PBS緩沖液充分沖洗臍帶外周以及臍靜脈內(nèi)腔， 用以下3種方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，3種方法均于培養(yǎng)的第14天計(jì)數(shù)集落數(shù)，超過 50個(gè)細(xì)胞計(jì)為集落。當(dāng)細(xì)胞達(dá) 70%80%融合時(shí)，以含1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L 乙二胺四乙酸的消化液消化后，以（2.55.0） W3/cm2密度接種傳代培養(yǎng)，計(jì)為第 1代（P1）細(xì)胞。植塊法：沿臍靜脈內(nèi)腔縱向剪開血管，剝離臍靜脈內(nèi)膜，將剩 余組織切成3.05.0 mm3小塊，貼于預(yù)先用1 mL完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為2% 胎牛血清、40% MCDB201、10 ©/L血小板衍生生長(zhǎng)因子、10 ；g/L

46、堿性成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10 g/L表皮生長(zhǎng)因子的DF12培養(yǎng)基）潤(rùn)濕的T25培養(yǎng)瓶底 壁，底壁朝上，置于37C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱中，過夜后翻轉(zhuǎn)。 每24 h加入1 m 述培養(yǎng)基，72 h全量換液，以后每周換液2次。觀察貼塊 周圍貼壁細(xì)胞爬出情況。2周后去貼塊。膠原酶消化法：夾閉臍靜脈一端，灌入 1 g/L膠原酶U 3.05.0 mL，置于含雙抗的PBS中，37 C孵育0.5 h,收集酶液， 并用PBS反復(fù)灌洗，收集灌洗液，與酶液同時(shí)離心洗滌棄上清后，以完全培養(yǎng) 基重懸，1X106/cm2接種于T25培養(yǎng)瓶中，3 d后全量換液，以后每周換液2次。觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)。膠原酶與胰

47、酶聯(lián)合消化法：將臍帶組織切成1.02.0 mm3小 塊，直接加入1 g/L膠原酶U于37C孵育16 h，以PBS洗滌后加入25 g/L胰 酶于37T孵育0.5 h;加入含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的培養(yǎng)基中和胰酶，以100 呵的濾器過濾細(xì)胞，收集濾液；PBS洗滌棄上清后，以完全培養(yǎng)基重懸，按 Ixi06/cm2接種于T25培養(yǎng)瓶中，3 d后全量換液，以后每周換液 2次。觀察貼 壁細(xì)胞生長(zhǎng)（徐燕等，2009）。羊膜羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：選取剖宮產(chǎn)足月胎兒的胎盤，機(jī)械剝離胎盤 羊膜組織，PBS反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細(xì)碎小塊，0.25%胰酶37 C消化10 min,100目篩網(wǎng)過濾。PBS充分

48、清洗后收集經(jīng)胰酶消化后的組織塊， 繼續(xù)經(jīng)0.1% W型膠原酶37r消化15 min。含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的L-DMEM終止反應(yīng) 后反復(fù)吹打，過100目篩網(wǎng)獲得細(xì)胞液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。收 集羊膜來源的細(xì)胞按以下培養(yǎng)條件進(jìn)行體外培養(yǎng)：添加有 5卩g/L堿性成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子和10卩g/L表皮生長(zhǎng)因子的L-DMEM完全培養(yǎng)基， 置于37 C、體 積分?jǐn)?shù)為5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 d全量換液1次，12-14 d后細(xì)胞按常規(guī)方 法傳代（徐彪等，2013）。hAD-MSCs的分離和培養(yǎng)： 無(wú)菌條件下，采用機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上 剝離，用D-PBS液反復(fù)沖洗

49、以清除殘留血跡。剪碎羊膜，加入 0.5 g/L胰蛋白酶 -0.02% EDTA-2Na消化液，37 C 旋轉(zhuǎn)（200 r/min）消化10 min，棄上清，再加入 消化液，37 r旋轉(zhuǎn)消化30 min，棄上清，按同樣的程序再重復(fù)消化 2次。經(jīng) 胰酶消化后剩余的組織用 D-PBS液沖洗，加入0.75 g/L U型膠原酶-0.075 g/L DNase I消化液，37 r、200 r/min消化2.03.0 h,直至組織完全消化，經(jīng) 300 目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，1 500 r/min,離心10 min,棄 上清，細(xì)胞沉淀懸浮于 LG-DMEM 培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、2 m

50、mol/L L-谷氨酰胺、10 g/L非必需氨基酸、55卩mol/L 巰基乙醇、1 mmol/L 丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素）2%錐蟲藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，以 2.2 X08 L-1濃度接種于培養(yǎng)瓶，于37 r、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2 環(huán)境下培養(yǎng)，3 d更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞連生面積達(dá) 80%90%后行傳代培養(yǎng)（宮黎明等，2011）。絨毛膜在產(chǎn)房無(wú)菌條件下獲取胎盤，立即浸入胎盤儲(chǔ)存袋含99%低糖DMEM , 1% 抗生素（雙抗即青鏈霉素）的組織保護(hù)液，在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室（洪艷等， 2014）。剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL,置于直徑10 cm培養(yǎng)皿，平

51、皿中 裝有2/3體積的含有抗生素的（1%的青鏈霉素）PBS。用手術(shù)剪剪開大的組織 塊，一邊將大的組織塊剪成小塊，一邊用手術(shù)鑷夾持進(jìn)行漂洗，避免溢出，如此 重復(fù)3遍，至漂洗液清亮，棄漂洗液。轉(zhuǎn)移絨毛膜層組織至50 mL體積的離心管中，做好標(biāo)記，用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm3大小的碎塊。向各離心管中加入U(xiǎn)型膠原酶消化液， 各加入U(xiǎn)型膠原酶10 mL （酶消化終濃 度0.1%）,置于搖床內(nèi)37C、250 r/min振蕩，約90 min后終止消化。加PBS 至 50 mL，300r/min，5 min;收集上清，20 mL 一管，力卩 PBS 至 50 mL，2 000 r/min ,1

52、0 min棄上清。用10 mL PBS,重懸細(xì)胞混勻并一管，加PBS至50 mL， 2 000 r/min, 10 min。棄上清，加入10 mL完全培養(yǎng)基，取20 L細(xì)胞懸液加 入80 yL的紅細(xì)胞裂解液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照計(jì)數(shù)結(jié)果3X106/皿，接種若干？100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 C體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)。48 h換液，以后每3 d換液1 次，直至細(xì)胞可以進(jìn)行傳代（洪艷等，2014）。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，每皿加入1.0-2.0 mL的0. 25%胰酶（含EDTA）進(jìn)行消化傳代。傳代時(shí)，消化三至四分鐘，加含 有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并補(bǔ)加PBS 至5

53、0 mL , 1 200 r/min ,離心5 min,棄含消化液的上清，加入細(xì)胞完全培養(yǎng)液 吹打混勻，計(jì)數(shù)，按照約1.5為06/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿（100 mm）中，置于37C, 體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（洪艷等，2014）。蛻膜層將胎盤組織用無(wú)菌鹽水沖洗后，小心分離胎盤底蛻膜組織用無(wú)菌組織剪剪成 小組織塊，使用膠原酶和胰酶消化，消化后的混合液體經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，接 種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DF12培養(yǎng)液于37C, 5%CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，按1: 3傳代培養(yǎng)（韓之波等，2013）。胎盤胎盤標(biāo)本處理：無(wú)菌條件下將娩出胎盤剝除羊膜

54、，剪除胎盤母體面2.03.0mm組織后，剪下35個(gè)胎盤小葉，稱質(zhì)量約50 g，浸泡于含肝素的無(wú)菌PBS 中。將剪下的胎盤小葉用手術(shù)剪剪碎，用生理鹽水反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無(wú)色。實(shí)驗(yàn)共采集5例標(biāo)本。組織消化：使用pH 7.4、含25 mmol/L HEPES 的D-Hank'作為消化緩沖液，加入終濃度為2.5 g/L胰酶和300 U/mL DNase I組 成消化液，每個(gè)標(biāo)本需消化液 330 mL0沖洗后的胎盤組織分階段消化，每個(gè)階 段在恒溫氣浴搖床中37 C、180 r/min消化20 min。每次消化完畢后，小心將消 化上清吸出，用新生牛血清終止反應(yīng)。然后將消化上清液，在25C

55、 1 000 g離心15 min，使從組織中離解出的細(xì)胞充分沉淀，再用L-DMEM重懸。所得細(xì)胞懸液中含有較多消化后的組織碎片， 用200目的不銹鋼濾網(wǎng)濾除。過濾后再次離 心，調(diào)整細(xì)胞懸液體積到5 mL （沙文瓊等，2010）o人胎盤標(biāo)本的留取：無(wú)菌條件下取足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤，剝除羊膜，剪取胎兒側(cè)胎盤組織，PBS反復(fù)沖洗至液體較清亮，用眼科剪剪碎（陸琰等，2009） o分組及干預(yù)：剪碎的胎盤組織稱取質(zhì)量，平均分為4組，每組5份標(biāo)本：膠原酶W +羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶U +羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶U +淋巴 細(xì)胞分層液分離組、膠原酶U +氯化銨裂解紅細(xì)胞組。將第1組置于1 g/L膠原 酶W中

56、，37 C消化45 min ;另外3組置于1 g/L膠原酶U中，37 C消化45 min。然后過細(xì)胞篩網(wǎng)，收集各組細(xì)胞懸液，分別按以下方法進(jìn)行對(duì)應(yīng)分離（陸 琰等，2009） o羥乙基淀粉沉淀法：將收集到的膠原酶W +羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶U + 羥乙基淀粉沉淀組細(xì)胞懸液，分別于室溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清。用PBS重懸細(xì)胞，加入60 g/L羥乙基淀粉（體積比為4:1）充分混勻，室溫靜 置45 min，小心吸取上清，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次。 以完全培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。按1.5 X09L- 1 密度接種于T-25塑料培養(yǎng)瓶中，置于37 C、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2飽和濕度 環(huán)境下，用含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM/F12進(jìn)行培養(yǎng)。7 d后首次全量 換液，棄去未貼壁細(xì)胞，每三四天換液 1次。細(xì)胞達(dá)80%匯合后，用2.5 g/L胰 酶消化，按1 : 2的比例傳代，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)（陸琰等，2009）。淋巴細(xì)胞分層液分離法：將膠原酶U +淋巴細(xì)胞