藍白斑實驗匯總

1、什么是藍/白斑篩選，怎么進行藍/白斑篩選載體pGEMZ在-半乳糖苷酶（lacZ）的-肽編碼區(qū)內(nèi)具有多克隆區(qū)域。在重組質(zhì)粒中插入片段使-肽失活，可在指示平板上通過顏色篩選鑒別。不帶有插入片段的載體，表達有功能的-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色體或附加體上缺失掉lacZM15基因，導(dǎo)致內(nèi)源-肽失活。載體pGEMZ或其它含lacZ基因的-肽互補細菌，具有-半乳糖苷酶的片段，所得功能-半乳糖苷酶（-肽加片段）將底物X-Gal轉(zhuǎn)化為有顏色的產(chǎn)物，得到藍色菌落。在載體pGEMZ的多克隆區(qū)域，克隆上插入片段導(dǎo)致-肽編碼區(qū)的破壞，使-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。-肽編碼區(qū)讀碼框內(nèi)小的插入片段產(chǎn)生淺蘭色菌落，

2、因-半乳糖苷酶只是部分失活。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到合適的菌株中（JM109， DH5），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上?？蓪?0ul的X-Gal和100 ulIPTG貯液直接加入到平板中，擴散到整個平板中，在37oC保溫30分鐘使液體擴散。IPTG溶于水中，貯液濃度為100mM，X- Gal溶于DMF，貯液濃度為50mg/ml。IPTG和X- Gal需分裝后保存在-20 oC，可保存2-4個月。藍白斑選擇原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）是一種人工工合成的、無色的乳糖類似物； b-半乳糖苷酶與X

3、gal顯色反應(yīng)是通過b-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍； lacZ的a肽互補：a-肽（ lacZ ）是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸），lacZ只有在a-肽形成4聚體的狀態(tài)下才有功能。若受體菌lacZ突變（lacZ?M15），b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解Xgal 。如受體菌株JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a等。而pUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼a肽與這個缺失突變的b-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚

4、體的a-肽，故能分解Xgal。產(chǎn)生藍色物質(zhì)。 a互補的插入失活：pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ的合成。不能互補。 IPTG的誘導(dǎo)作用：IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZa肽都表達。從而互補。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生a肽。 IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：MCS無插入時，互補，藍菌斑，MCS有插入時，不互補，白菌斑（見下圖）。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物；

5、 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物 X-gal 還可充作生色劑，被 -半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色你的空載提轉(zhuǎn)進去的話，IPTG誘導(dǎo)lacZ 表達肽，互補體內(nèi)缺陷的酶，然后可降解底物X-gal，產(chǎn)生藍斑；如果你則載體的多克隆位點插入了片段，導(dǎo)致編碼的肽錯誤，或者不能編碼肽，也就不能產(chǎn)生正常功能的酶，無法分解X-gal，所以長白斑。互補人們發(fā)現(xiàn)lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒（缺失氨基酸殘基11到41）是沒有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入-半乳糖苷

6、酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段（肽）則能恢復(fù)M15分解X-gal，而顯示藍色的能力。這樣一種基因內(nèi)互補現(xiàn)象稱做互補（-complementation）。 -互補是指 lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。-互補是基于在兩個不同的缺陷 -半乳糖苷酶之間可實現(xiàn)功能互補而建立的。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶

7、中第 11-41 個氨基酸的 lacZ 基因，無酶學(xué)活性。對于只編碼 N-端 140 個氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ） ，其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。但這兩個無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時，可恢復(fù) -半乳糖苷酶的活性，實現(xiàn)基因內(nèi)互補。 在 lacZ 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個堿基對的多克隆位點），不影響 -半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無-互補能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZM15 放在 F 質(zhì)粒上, 隨宿主傳代； lacZ 放在載體上, 作為篩選標(biāo)記。相應(yīng)的受體菌有 JM 系列、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均帶有 D （lac - proAB）F proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 為 lac 阻抑物的編碼基因，lacIq 突變使阻抑物產(chǎn)量增加，防止 lacZ 基因滲漏表達。 lacZ 基因是乳糖 lac 操縱子中編碼 -半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達。 乳糖既是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作