CRISPR及其在原核生物防御系統(tǒng)中作用的研究進(jìn)展

1、CRISPR及其在原核生物防御系統(tǒng)中作用的研究進(jìn)展摘要近來(lái)在眾多原核生物的基因組的分析中，發(fā)現(xiàn)一類成簇的、有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）結(jié)構(gòu)家族。CRISPR由一類DNA重復(fù)單元所構(gòu)成，在功能上與DNA的重組、修復(fù)及原核生物的免疫防御系統(tǒng)關(guān)系密切。通過(guò)對(duì)于CRISPR及其相關(guān)系統(tǒng)（CASs）基因的比較性分析，CRISPR獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能引起人們的廣泛關(guān)注。實(shí)驗(yàn)表明CASs的插入序列來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的許多染色體外遺傳物質(zhì)，并且以一種類似于真核生物中RNA干擾（RNAi）系統(tǒng)

2、的機(jī)制，在原核生物抵抗入侵的噬菌體和質(zhì)粒的防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。本文綜述了CRISPR系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)、多樣性、作用機(jī)理及其區(qū)分自我與非我的機(jī)制，并對(duì)CRISPR研究和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：CRISPR；原核生物；免疫成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一類獨(dú)特的DNA直接重復(fù)序列家族，廣泛存在于眾多原核生物基因（大多數(shù)的細(xì)菌和幾乎所有的古細(xì)菌）中1。自2002年首次被人們所定義以來(lái)，CRISPR一直以其奇特的結(jié)構(gòu)與特殊的功能吸引著各國(guó)科學(xué)家們的共同關(guān)注。它的

3、結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，長(zhǎng)度約2550bp的重復(fù)序列（這里我們稱為repeats）被單一序列（這里我們稱為spacers）間隔2。根據(jù)不同的研究結(jié)果，人們對(duì)CRISPR系統(tǒng)的生物學(xué)功能曾有過(guò)種種推測(cè)，最近人們發(fā)現(xiàn)Cas系統(tǒng)（CRISPR-associated sequences system，CASs）在原核生物中表現(xiàn)出某種獲得性免疫功能，幫助細(xì)菌抵御病毒的侵犯，并和DNA的重組與修復(fù)有關(guān)3。2005年，3個(gè)研究小組分別發(fā)現(xiàn)一些CRISPR的間區(qū)序列是來(lái)自噬菌體或質(zhì)粒等染色體外的序列，據(jù)此推斷CRISPR系統(tǒng)能使宿主獲得抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外來(lái)DNA入侵的免疫能力4-6。2007年，Barrangou等7

4、通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CRISPR系統(tǒng)的這一生物學(xué)功能。1 CRISPR系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)隨著細(xì)菌基因組學(xué)的發(fā)展，CRISPR的基本結(jié)構(gòu)已逐漸被確定，由短的高度保守的repeat與長(zhǎng)度相似的非重復(fù)的spacers序列間隔排列11所組成（圖1-A）。Repeats是一組高度保守的短小序列，其長(zhǎng)度一般為25至50個(gè)堿基對(duì)。Spacers與repeats的長(zhǎng)度相近，約為26到72個(gè)堿基對(duì)。此外一組約由410個(gè)保守基因組成的序列被發(fā)現(xiàn)于CRISPRs周?chē)?，我們稱之為CASs（CRISPR-associatedsequences，CASs）11。在CAS蛋白中已鑒定出核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA

5、-結(jié)合等結(jié)構(gòu)域，因此，認(rèn)為CAS蛋白參與CRISPR的轉(zhuǎn)錄、加工和外來(lái)基因序列的降解等過(guò)程3。圖12 CRISPR統(tǒng)的廣泛分布和多樣性在已測(cè)序的約40%細(xì)菌和90%古細(xì)菌基因組中至少存在1個(gè)CRISPR座位(locus)，古細(xì)菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)中存在18個(gè)CRISPR座位，是目前已研究的原核生物中最多的8。每個(gè)CRISPR座位具有幾個(gè)到幾百個(gè)R-S重復(fù)單位(圖1-A)，平均為66個(gè)，目前記錄最高的是Chloroflexus sp。Y400fl( 4個(gè)CRISPR 座位中的1個(gè)具有374個(gè)R-S重復(fù)單位)和Verminephrobact

6、ereiseniae(249個(gè))2,8cas基因多達(dá)45個(gè)家族9，根據(jù)CAS蛋白的序列同源性、組成情況和功能，可將CRISPR系統(tǒng)分為8個(gè)亞型:Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube，各亞型通常具有26個(gè)亞型特異的cas基因，在沒(méi)有CRISPR系統(tǒng)的基因組中則不存在相關(guān)基因8。cas1cas6這6個(gè)家族廣泛存在于不同的CRISPR亞型，被認(rèn)為是核心cas基因，其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR亞型，因此，cas1和cas2家族基因也被用作鑒定CRISPR系統(tǒng)的分子標(biāo)記10。此外，間區(qū)序列(S)也具有極其豐富的多樣性，H

7、orvath等12在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的124個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)了3626個(gè)間區(qū)序列，分布在3個(gè)CRISPR座位，其中，77%、16%和7%的S序列分別與噬菌體、質(zhì)粒和嗜熱鏈球菌基因組序列具有同源性。在Bacillus thuringiensis菌YBT-1520和CT-43菌株的染色體上均沒(méi)有鑒定出CRISPR系統(tǒng)，而在YBT-1520菌株的大質(zhì)粒pBMB293和CT-43菌株的大質(zhì)粒pCT283上各存在2個(gè)CRISPR座位。pBMB293的CRISPR-1座位包含10個(gè)間區(qū)序列，其中的5個(gè)分別與已知噬菌體GIL16c和Bam35c、質(zhì)粒pGIL01和

8、pAH187、Halothermothrix orenii H168的染色體有很高的序列同源性；CRISPR-2座位包含5個(gè)間區(qū)序列，只有1個(gè)與已知的質(zhì)粒序列(pAH187)具有同源性。3 Spacer DNA 的來(lái)源CRISPR廣泛存在于原核生物（如古細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌），并在其生理和種族發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著多重功能13,14。在來(lái)源于不同基因組的CRISPR之中，repeats所表現(xiàn)出的相似性是有限的，而保守基序spacers卻是相同的，即使是在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的古細(xì)菌和細(xì)菌中也是如此4,15。此前，Mojica等將這類Spacers都描述為特有的獨(dú)一無(wú)二的序列，但最近的研究越來(lái)越傾

9、向于另一種假設(shè)：CRISPR的插入序列來(lái)源于一些已存在于細(xì)胞中的序列16。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在許多株群，CRISPR中的spacers與細(xì)胞中其它遺傳成分存在著高度的相似性。關(guān)于CRISPR插入片段的來(lái)源有如下幾種：約65與噬菌體和結(jié)合性質(zhì)粒存在相關(guān)，其余的35與染色體序列有關(guān)而與外緣DNA之間沒(méi)有關(guān)系。之后的一系列研究使我們更清晰的了解到CRISPR的spacer元件是染色體外遺傳物質(zhì)入侵細(xì)菌后的殘留體，他們很可能通過(guò)編碼一類anti-sense RNA為細(xì)胞提供了一種對(duì)抗噬菌體感染甚至是更廣泛的外源基因侵染的免疫能力17。4 CRISPR的作用機(jī)理4. 1 新間區(qū)序列的獲得在噬菌體等入侵宿主菌

10、后，CRISPR系統(tǒng)會(huì)從外來(lái)序列中選取一段序列作為新的間區(qū)序列，加工成新的R-S序列后以非同源重組的方式增加到CRISPR簇內(nèi)，從而使宿主獲得抵抗相應(yīng)噬菌體等再次入侵的免疫能力8，這一現(xiàn)象也得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)7。新的R-S序列幾乎總插入到前導(dǎo)序列和原來(lái)的第一個(gè)R區(qū)之間(圖1-B)，因此，前導(dǎo)序列中可能存在相關(guān)蛋白(可能是CAS蛋白)的識(shí)別位點(diǎn)，在增加新R-S序列過(guò)程中起定位的功能。CRISPR系統(tǒng)從噬菌體等基因組中選取新的間區(qū)序列并不是隨機(jī)的。事實(shí)上，多個(gè)研究小組已經(jīng)在噬菌體、質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了一些稱為前間區(qū)序列( protospacer)的序列，并且在其附近鑒定出一些小的前間區(qū)序列鄰近基序(protos

11、pacer adjacent motifs，PAMs)。不同CRISPR亞型識(shí)別的PAM基序具有亞型特異性18。目前，有哪些蛋白質(zhì)參與PAM基序的識(shí)別、前間區(qū)序列的選取、間區(qū)序列長(zhǎng)度如何確定等方面的具體機(jī)制尚不清楚。4. 2 CRISPR的轉(zhuǎn)錄與加工研究表明，CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄體，即前crRNA，然后逐步被加工成小的crRNA。多數(shù)情況下，只有CRISPR簇的編碼鏈被轉(zhuǎn)錄和加工10但在古細(xì)菌Sulfolobus屬19和嗜熱鏈球菌7，CRISPR簇的2條鏈都可以被轉(zhuǎn)錄。在大腸桿菌K12菌株中，CRISPR簇的前crRNA與CAS蛋白CasABCDE形成的Cascade復(fù)合物結(jié)合，其

12、中，CasE的功能是將前crRNA切割加工成crRNA。成熟的crRNA分子一般包含5'-端為89nt的R區(qū)、S區(qū)和3'-端稍長(zhǎng)且更多樣化的R區(qū)20(圖1-C)。在超嗜熱菌強(qiáng)烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)中，Cas6的功能與CasE相同，Cas6是金屬離子依賴型的核酸內(nèi)切酶，與CRISPR的重復(fù)序列5'-端特定基序結(jié)合并在重復(fù)序列的3'-端將其切開(kāi)21。CRISPR簇及cas基因的轉(zhuǎn)錄受到宿主內(nèi)多種因素的調(diào)控22。在大腸桿菌中，類組蛋白擬核構(gòu)造蛋白(histone-like nucleoid structuring protein，H-NS

13、)能降低CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的能力23，而轉(zhuǎn)錄因子LeuO能解除H-NS的抑制作用24。研究表明，H-NS能與CRISPR簇及cas基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，抑制CRISPR簇及cas基因的轉(zhuǎn)錄(圖1-C)，一方面，CRISPR簇被轉(zhuǎn)錄的前crRNA減少了，另一方面，CAS蛋白特別是CasE的減少又導(dǎo)致將半衰期短的前crRNA加工成更穩(wěn)定的crRNA的能力降低23，從而導(dǎo)致CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的能力降低。4. 3 CRISPR 系統(tǒng)介導(dǎo)的沉默嗜熱鏈球菌在受噬菌體侵染后，CRISPR簇新獲得的間區(qū)序列有的來(lái)自噬菌體DNA的編碼鏈，有的來(lái)自模板鏈7；無(wú)論用噬菌體的編碼鏈還是用模板鏈作為人工設(shè)

14、計(jì)的間區(qū)序列，都能有效地使大腸桿菌獲得抗噬菌體的能力20；表皮葡萄球菌的1個(gè)CRISPR間區(qū)序列與結(jié)合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的切口酶(nickase)具有同源性，而切口酶只在結(jié)合轉(zhuǎn)移的供體菌中發(fā)揮功能，但CRISPR系統(tǒng)能使供體菌和受體菌都失去結(jié)合轉(zhuǎn)移能力8。綜合這些研究結(jié)果，不難看出crRNA的作用機(jī)理不同于反義RNA，應(yīng)該是直接作用于DNA。同時(shí)，前間區(qū)序列鄰近基序PAM不僅是選取新間區(qū)序列的識(shí)別位點(diǎn)，也是crRNA作用于外來(lái)DNA的靶標(biāo)之一4。強(qiáng)烈熾熱球菌的Cascade復(fù)合物包括多個(gè)Cmr型的CAS蛋白，由Cas6加工成的前導(dǎo)RNA與該復(fù)合物結(jié)合后繼續(xù)被加工，即得到成熟的psiRNA(prokary

15、otic silencing RNA)25。Hale等進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，單鏈的psiRNA-Cmr復(fù)合物能位點(diǎn)特異地切割RNA而不能作用于DNA，而且切割位點(diǎn)總位于psiRNA的3'-末端往前14nt。這種作用機(jī)理與真核生物的siRNA極其相似，只是還沒(méi)有psiRNA作用于天然靶標(biāo)(來(lái)自噬菌體、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄體)的體內(nèi)證據(jù)26。因此，前crRNA加工為成熟的crRNA后，是直接作用于DNA還是RNA，至今仍處于爭(zhēng)論期，或許二者兼而有之，但誰(shuí)主誰(shuí)次尚不清楚。4. 4自我與非我的區(qū)分一般情況下，免疫系統(tǒng)能很好地區(qū)分自我與非我，從而快速產(chǎn)生針對(duì)外來(lái)成分的免疫反應(yīng)，同時(shí)避免產(chǎn)生自身免疫。Marr

16、affini等通過(guò)向敲除了CRISPR簇的表皮葡萄球菌菌株中回補(bǔ)不同的CRISPR簇的突變體，并轉(zhuǎn)入帶有前間區(qū)序列及其鄰近基序PAM(進(jìn)行了個(gè)別重要堿基的替換)的外來(lái)DNA序列，他們發(fā)現(xiàn)成熟crRNA的5'-端重復(fù)序列(R區(qū))在保護(hù)自身CRISPR簇不被切割時(shí)起主要作用，也暗示成熟crRNA5'-端的均質(zhì)性(5'-端R區(qū)為89nt，3'-端R區(qū)更長(zhǎng)且多變)對(duì)crRNA發(fā)揮功能的重要性(圖2)；同時(shí)，外來(lái)DNA中的前間區(qū)序列鄰近基序PAM在區(qū)分自我與非我的過(guò)程中也起關(guān)鍵作用。值得關(guān)注的是，Stern等最近發(fā)現(xiàn)了自靶向的間區(qū)序列(self-targeting spa

17、cers)。他們分析了來(lái)自330種含CRISPR系統(tǒng)的原核生物的23550個(gè)間區(qū)序列(S區(qū))，發(fā)現(xiàn)每250個(gè)間區(qū)序列中就有1個(gè)是自靶向的，所研究的330種原核生物中有18%存在自靶向的間區(qū)序列。由于缺乏保守性，而且在自靶向間區(qū)序列的附近存在大量已退化的重復(fù)序列，因此，他們認(rèn)為存在自靶向的間區(qū)序列不是其他調(diào)控機(jī)制而是一種自身免疫機(jī)制28。圖 2 crRNA區(qū)分自我與非我的機(jī)制5 展望綜上所述，深入研究CRISPR系統(tǒng)不僅具有重大的理論意義，而且具有廣闊的應(yīng)用前景。CRISPR系統(tǒng)間區(qū)序列的多樣性和特異性已被廣泛應(yīng)用于基因分型、流行病學(xué)研究、分析不同人體內(nèi)的細(xì)菌菌群差異、檢測(cè)環(huán)境中的噬菌體等科學(xué)研

18、究。利用其作用機(jī)制的獨(dú)特性，CRISPR系統(tǒng)也已用于構(gòu)建噬菌體抗性的工業(yè)生產(chǎn)菌株。此外，CRISPR系統(tǒng)還可能在以下幾方面得到廣泛應(yīng)用：作為遺傳操作的工具，用于靶向基因沉默；crRNA-Cascade復(fù)合物可用于體外DNA、RNA分子的位點(diǎn)特異性切割；在臨床上，通過(guò)限制質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移而控制藥物抗性基因在致病菌之間擴(kuò)散等。盡管發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)已有20多年，但直到最近36年才逐步揭開(kāi)其神秘面紗。因此，還存在許多值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題：crRNA是直接作用于DNA還是RNA；psiRNA介導(dǎo)的RNAi作用在原核生物中是否普遍存在；新間區(qū)序列的獲得機(jī)制已得到初步闡明，但間區(qū)序列的丟失機(jī)制尚不明了；形成

19、crRNA-Cascade復(fù)合物的動(dòng)態(tài)過(guò)程等。這些未知的特性有待更深入的研究加以揭示。同時(shí)也更加確信關(guān)于CRISPR 結(jié)構(gòu)與功能的研究將有助于人們對(duì)于原核生物界乃至整個(gè)生物界的進(jìn)化和特性的認(rèn)識(shí)。參考文獻(xiàn)1 Lillestol PK, Redder P, Barrett RA, et al. A putative viral defence mechanism in archaeal cellsJ. Archaea, 2006, 2（1）:5972.2 Bland C, Ramsey TL, Sabree F, et al. CRISPR recognition tool（CRT）: a too

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