濁點(diǎn)萃取高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定藥片與尿樣中異煙肼、利福平和

1、濁點(diǎn)萃取高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定藥片與尿樣中異煙肼、利福平和吡嗪酰胺【摘要】建立了以聚乙二醇(PEG)6000為萃取劑的濁點(diǎn)萃取（CPE）反相高效液相色譜同時(shí)測(cè)定異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的方法,由于異煙肼不易被濁點(diǎn)萃取方法富集，使異煙肼與對(duì)氯苯甲醛在酸性條件下反應(yīng)衍生為異煙肼腙，異煙肼腙在液相色譜上的信號(hào)與異煙肼濃度存在著線性關(guān)系。在優(yōu)化的CPE條件下，采用梯度洗脫的方式，用紫外檢測(cè)器在310 nm波長(zhǎng)下，異煙肼、吡嗪酰胺和利福平的保留時(shí)間分別為14.5、34.4和38.1 min，定量范圍分別是0.0110 mg/L、0.0825 mg/L和0.0520 mg/L。線性相關(guān)系數(shù)r0.99。3種

2、藥的平均回收率范圍為91.50%98.75%，精密度(RSD)為 0.22%1.54%。異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的檢出限分別為4103、2102和3102 mg/L。本法用于藥片和尿樣中3種藥物的檢測(cè)，結(jié)果滿意。 【關(guān)鍵詞】 濁點(diǎn)萃取,液相色譜,異煙肼,利福平,吡嗪酰胺1 引 言 異煙肼(isoniazid, IN)、利福平(rifampicin, RF)和吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZ)是臨床最有效的抗結(jié)核藥物，但是這3種藥物本身有一定的毒性，為保證使用安全，需要控制和檢測(cè)它們的含量。目前，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了多種單獨(dú)或同時(shí)測(cè)定樣品中這3種藥物的方法。其中， 高效液相色譜(HPLC)

3、是主要檢測(cè)方法13，Calleri4和Unsalan5分別采用RPHPLC法和HPLC法同時(shí)測(cè)定了藥片中的IN、RF和PZ。Hector等6運(yùn)用多元分光光度校準(zhǔn)法，測(cè)定了藥片中3種藥的含量； Nguyen等 液液萃取是提高靈敏度的常用且有效的方法， Khuhawar等11將IN與2氟萘烯甲醛反應(yīng)衍生成腙，以氯仿為萃取劑，檢測(cè)了血液中的IN、RF和PZ，其檢出限為IN 0.02 mg/L , PZ 0.04 mg/L，RF0.26 mg/L。此方法的不足之處是需要使用有機(jī)溶劑，可能造成環(huán)境污染，并且操作過程緩慢費(fèi)時(shí)。濁點(diǎn)萃?。–PE）是一種新的液液萃取技術(shù)，它具有經(jīng)濟(jì)、平安、高效、簡(jiǎn)便,不使用揮

4、發(fā)性的有機(jī)溶劑,不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，此方法作為有機(jī)和無(wú)機(jī)樣品的前處理方法已經(jīng)有很多報(bào)道。如利用濁點(diǎn)萃取富集測(cè)試樣品溶液中的金屬離子12,也被用作提取疏水性蛋白質(zhì)13,維生素藥物的CPE萃取也有報(bào)道14,15。CPE方法也富集環(huán)境污染物和農(nóng)藥1618。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CPE技術(shù)用于萃取RF和PZ是可行的，但對(duì)IN的萃取不理想。原因是IN的親水性太強(qiáng)，不易進(jìn)入表面活性劑的富集相。為此，將IN和對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)生成了極性較小的腙。用CPE方法完成了對(duì)IN、RF和PZ的同時(shí)萃取。結(jié)合HPLCUV方法，檢測(cè)了藥劑和尿液中的3種藥物,靈敏度可以達(dá)到0.1 g/L。 2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器、試劑和材料

5、 島津液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)：包括二極管陣列檢測(cè)器(SPDM20A)，雙泵(LC20AT)，色譜工作站(LC solution)和控制器(CBM20A/20Alite)；C18色譜柱(250 mm4.6 mm，5 m,江蘇漢邦公司)；UV1700紫外可見分光光度計(jì)；Anke TDL60B離心機(jī)；恒溫槽(江蘇通州試驗(yàn)儀器廠)保持濁點(diǎn)萃取溫度變化1 ；超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠)用于脫氣。 標(biāo)準(zhǔn)品異煙肼、吡嗪酰胺和利福平購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司。對(duì)氯苯甲醛(PCBA)、三氯乙酸(TCA)和PEG 6000 購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。NaCl、NH4Cl、 Na2SO4、 Na2CO3、(

6、NH4)2SO4 和NaOH購(gòu)自南京化學(xué)試劑廠。乙腈（色譜純, Merk公司）和甲醇（色譜純,TEDIA公司），其它試劑為分析純。異煙肼片(50 mg/片，山西新星制藥有限公司)； 利福平膠囊(150 mg/粒，沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司)；吡嗪酰胺片(250 mg/片，成都錦華制藥有限公司)。用二次蒸餾水配制1 mg/L的 PZ和IN的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用2%(W/V) PEG 6000的水溶液配制成1 mg/L RF的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2.2 異煙肼的衍生反應(yīng) 取2 mL 1 mg/L IN標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，加入1 mL 1.0 g/L對(duì)氯苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL甲醇、1 mL 0.1 moL/L

7、三氯乙酸，以水定容，振蕩5 min后，室溫下靜置10 min，使IN與對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)完全。 2.3 異煙肼、利福平、吡嗪酰胺的濁點(diǎn)萃取過程 一定濃度的RF、PZ和 IN的混合液按2.2步驟反應(yīng)后，加入適量20%(W/V)PEG6000溶液和(NH4)2SO4，加水稀釋至10 mL，使PEG 6000和(NH4)2SO4的最終濃度分別為4%(W/V)和20%(W/V)。待鹽完全溶解后置于25 的恒溫槽中10 min，然后以4000 r/min離心10 min。此時(shí)溶液分離為水相和表面活性劑富集相。用注射針移去水相,富集相用流動(dòng)相稀釋至0.5 mL后進(jìn)行色譜分析。此時(shí)富集因子為20。 2.4 樣品

8、的制備3 結(jié)果和討論 3.1 異煙肼的衍生反應(yīng)和檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 CIH在堿性條件下易水解，所以IN和PcBA的衍生反應(yīng)是在酸性環(huán)境下進(jìn)行的。衍生反應(yīng)如下： 在pH 1.55.5范圍內(nèi)，考察了酸度對(duì)反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=3時(shí)CIH峰值最大。在pH=3.0時(shí)考察了PCBA的濃度對(duì)CIH吸收值的影響。結(jié)果顯示，CIH峰高隨PCBA濃度的增大而增加，當(dāng)PCBA濃度0.02 g/L時(shí)，CIH的吸光度保持穩(wěn)定。在此條件下RF和PZ沒有與對(duì)氯苯甲醛發(fā)生類似的衍生反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCBA、IN和CIH的最大吸收波長(zhǎng)分別為257、268和305 nm。而PZ在 268和 314 nm處均有較大吸收，R

9、F在330和470 nm均有較大吸收。綜合考慮，選擇310 nm為同時(shí)測(cè)定CIH、PZ和RF的檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，按3.1條件CIH的吸光度和IN的濃度呈線性關(guān)系。 3.2 濁點(diǎn)萃取條件的優(yōu)化 Fig.1 Effect of surfactant concentration on extraction efficiency Fig.2 Effect of pH on extraction efficiency Fig.3 Effect of temperature on extraction efficiency 3.3 HPLCUV的測(cè)定 3.4 方法檢驗(yàn) 不同濃度的CIH、PZ和RF的系列

10、標(biāo)準(zhǔn)溶液用HPLCUV系統(tǒng)分析。將峰面積（Y）作為與樣品的質(zhì)量濃度(，mg/L )進(jìn)行線性回歸，得到3種藥物的校準(zhǔn)曲線分別為：異煙肼，Y=2995891046.1；吡嗪酰胺，Y=13154+2606.4；利福平，Y=1067713545.3。線性范圍分別為0.0110 mg/L(IN)，0.0520 mg/L(RF)和0.0825 mg/L(PZ)。相關(guān)系數(shù)0.99。按信噪比為3的條件計(jì)算得到的檢出限分別為0.004 mg/L(IN)、0.02 mg/L(PZ)和0.03 mg/L（RF）。精密度測(cè)定：重復(fù)測(cè)定3種不同濃度的混合溶液5次，3種藥物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表1所示。

11、 3.5 樣品分析 用CPEHPLCUV方法同時(shí)測(cè)定藥片中的IN、PZ和RF的含量。表2所示為藥片中原有3種藥物的含量和通過本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的含量的比較。結(jié)果見表2。表1 3種藥物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)綜上所述，采用CPEHPLCUV方法同時(shí)測(cè)定IN、PZ和 RF的含量，本方法的檢出限優(yōu)于文獻(xiàn)5報(bào)道的結(jié)果。與有機(jī)溶劑萃取HPLC法11檢測(cè)3種藥的檢出限相比，雖然沒有明顯改進(jìn)，但CPE處理樣品不使用有機(jī)溶劑，避免了環(huán)境污染，簡(jiǎn)化了操作方法。由于異煙肼的水溶性強(qiáng)，CPE方法不能有效富集樣本異煙肼。采用衍生是使異煙肼衍生物易于用CPE方法富集，從而使3種藥物能同時(shí)被CPE方法富集。本方法用于IN

12、、PZ和 RF在藥物和尿液中的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。【參考文獻(xiàn)】 1 Safavi A, Karimi M A, Hormozi N M R, Kamali R, Saghir N. Spectrochim. Acta A, 2004, 60: 7657692 Lapa A S, Lima L F C, Santos L M. Anal. Chim. Acta, 2000, 419: 17233 Shrutidevi A, Inderjit S, Kanwal J K, Shantaram R B, Chaman L K, Ramesh P. Int. J. Pharm., 2004, 276:

13、 41494 Calleri E, Lorenzi E D, Furlanetto S, Massolini G, Caccialanza G. J. Pharm. Biomed. Anal., 2002, 29: 108910965 Unsalan S, Sancar M, Bekce B, Clark P M, Karagoz T, Izzettin F V, Rollas S. Chromatographia, 2005, 61: 5955986 Goicoechea H C, Olivieri A C. J. Pharm. Biomed. Anal., 1999, 20: 681686

14、7 Nguyen D T T, Guillarme D, Rudaz S, Veutheyl J L. J. Sep. Sci., 2008, 31: 105010568 Argekar A P, Kunjir S S, Purandare K S. J. Pharm. Biomed. Anal., 1999, 14: 164516509 Song S H, Jun S H, Park K U, Yoon Y, Lee J H, Kim J H, Song J. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2007, 21: 1331133810 Ng K Y, Zhou H

15、Y, Zhang Y L, Hybertson B, Randolph T, Christians U. J. Chromatogr. B, 2007, 847(2): 18819811 Khuhawar M Y, Rind F M A. J. Chromatogr. B, 2002, 766: 35736312 Lu JuSheng(盧菊生), Tian JiuYing(田久英), Wu Hong(吳 宏) Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)), 2009, 37(1): 9910213 Jin Gu(金 谷), Li JiFeng(李吉峰), Yang Jian(楊 鍵

16、). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)), 2004, 32(6): 79179314 Long WenQing(龍文清). Journal of Instrumental Analysis(分析測(cè)試學(xué)報(bào)), 2006, 27(1): 778015 Meng QingYu(孟慶玉), Li uanQian(黎源倩), Zou XiaoLi（鄒曉莉），Zheng Bo(鄭 波) Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)), 2008, 36(6): 76076416 Pang QingYun(龐青云), Lu Yan(陸 巖), Yu Li(余 立), Dai Hong(代 紅), Tian HongZhao(田洪昭). Chin. J. Pharm. Anal.(藥物