酶的分離純化方法

1、精選文檔酶的分別純化方法摘要 酶的分別純化工作，是酶學(xué)爭(zhēng)辯的基礎(chǔ)。一個(gè)特定酶的提純往往需要通過(guò)很多次小試驗(yàn)進(jìn)行摸索，很少有通用的規(guī)律可循。本文從酶原料選擇、酶的分別與純化、酶純度的評(píng)價(jià)三個(gè)方面進(jìn)行總結(jié)，列舉了一些常用的分別純化方法。關(guān)鍵詞 酶、分別純化、方法、純度中圖分類(lèi)號(hào) O6 酶的分別純化工作，是酶學(xué)爭(zhēng)辯的基礎(chǔ)。一個(gè)特定酶的提純往往需要通過(guò)很多次小試驗(yàn)進(jìn)行摸索，很少有通用的規(guī)律可循。酶的純化過(guò)程與一般的蛋白質(zhì)純化過(guò)程相比，又有其本身獨(dú)有的特點(diǎn)：一是酶一般取自生物細(xì)胞，而特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少；二是酶可以通過(guò)測(cè)定活力的方法加以跟蹤，前者給純化帶來(lái)了困難，而后者卻能使我們快速找出純化過(guò)

2、程的關(guān)鍵所在。1 酶原料選擇 提取某一種酶時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)依據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。但是由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多接受培育微生物的方法來(lái)獲得大量的酶制劑。從微生物中來(lái)生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有很多，既不受氣候地理?xiàng)l件限制，而且動(dòng)植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過(guò)選育菌種來(lái)提高產(chǎn)量，用廉價(jià)原料可以大量生產(chǎn)。2 酶的分別純化由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有很多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時(shí)，必需

3、經(jīng)過(guò)分純化的手續(xù)。酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很簡(jiǎn)潔變性，所以在酶的提純過(guò)程中應(yīng)避開(kāi)用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過(guò)程中通過(guò)測(cè)定酶的催化活性可以比較簡(jiǎn)潔跟蹤酶在分別提純過(guò)程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分別純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個(gè)酶的分別純化過(guò)程中的每一步驟，始終要測(cè)定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過(guò)某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而打算著一步驟的取舍。酶的分別純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不行避開(kāi)地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分別出來(lái)，或者從今溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成

4、純化的酶制劑。下面就酶的分別純化的常用方法作一綜合介紹。2.1 預(yù)處理及固液分別 2.1.1 細(xì)胞裂開(kāi)（cell disruption）高壓均質(zhì)器法：此法可用于裂開(kāi)酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個(gè)孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就簡(jiǎn)潔裂開(kāi)。菌懸液一次通過(guò)均質(zhì)器的細(xì)胞裂開(kāi)率12%-67%。細(xì)胞裂開(kāi)率與細(xì)胞的種類(lèi)有關(guān)。要達(dá)到90%以上的細(xì)胞裂開(kāi)率，起碼要將菌懸液通過(guò)均質(zhì)器兩次。最好是提高操作壓力，削減操作次數(shù)。但有人報(bào)道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175Mpa時(shí)，裂開(kāi)率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過(guò)70Mpa時(shí)，細(xì)胞裂開(kāi)率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門(mén)是影

5、響細(xì)胞裂開(kāi)率的重要因素。絲狀菌會(huì)堵塞均質(zhì)器的閥門(mén)，尤其高濃度菌體時(shí)更是如此。在豐富培育基上比在合成培育基上生長(zhǎng)的大腸菌更難裂開(kāi)。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價(jià)格廉價(jià)，常用來(lái)裂解細(xì)胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過(guò)氧化氫酶1500g。2.1.2 離心離心分別過(guò)程可分為離心過(guò)濾、離心沉淀、離心分別3種

6、類(lèi)型，所使用的設(shè)備有過(guò)濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。過(guò)濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開(kāi)有小孔，壁上有過(guò)濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場(chǎng)合。沉降式離心機(jī)用于分別固體濃度較低的固液分別，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過(guò)的蛋白質(zhì)等。分別機(jī)用于分別兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域接受的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境?，F(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個(gè)步驟，并進(jìn)行程序把握：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸

7、向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動(dòng)環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤(rùn)滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過(guò)程中排出的廢物對(duì)環(huán)境的污染。該離心機(jī)又如一個(gè)密閉的壓力容器，可在121溫度下進(jìn)行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機(jī)轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對(duì)懸浮液和濃縮的固體都能進(jìn)行充分的冷卻，并能有效地把握溫度，這對(duì)于生物制品是格外重要的。如BTPX205型離心機(jī)可用于細(xì)胞收集、培育液的凈化和細(xì)胞碎片的分別，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機(jī)的其他幫助系統(tǒng)及把握系統(tǒng)也較為完善，如設(shè)有壓力指示器、力氣計(jì)、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?.1.3 膜分別技術(shù)在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中主要用到的膜分別技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下

8、降溶液通過(guò)孔徑格外小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過(guò)薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層格外薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜打算了膜的孔徑，而支撐膜供應(yīng)機(jī)械強(qiáng)度以抵制靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫存，無(wú)相變化，對(duì)生物活性物質(zhì)沒(méi)有破壞。超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過(guò)液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當(dāng)料液濃縮至肯定的倍數(shù)后即可作為進(jìn)一步處理的濃縮料液。超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的濃縮和脫鹽過(guò)程中時(shí)應(yīng)留意以下問(wèn)題：第一，在超濾循環(huán)過(guò)程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的

9、溫度會(huì)漸漸上升，會(huì)造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動(dòng)測(cè)溫及把握系統(tǒng)。其次，某些酶的幫助因子散失為問(wèn)題：一些酶含有幫助因子，其分子量小，超濾時(shí)易從透過(guò)液中排解掉，因而在超濾前或超濾后要添加肯定濃度的的幫助因子。還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分別純度。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分別的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過(guò)超濾膜的孔隙時(shí)，假如在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會(huì)與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過(guò)孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，洗脫液用于進(jìn)一步的分別純化。2.1.4 泡沫分別原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活

10、性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類(lèi)及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分別。 蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分別過(guò)程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中集中到氣液界面，該過(guò)程可能是可逆的也可能是不行逆的；分子發(fā)生重排，一般認(rèn)為在空氣-水界面會(huì)形成兩種類(lèi)型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會(huì)發(fā)生由多個(gè)分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類(lèi)型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和濃度。泡沫分別的目的，一方面提高酶蛋白的富

11、集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/最初溶液中蛋白質(zhì)濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/最初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的安排系數(shù)最大。2.2 抽提沉淀 2.2.1 鹽析常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價(jià)格廉價(jià)。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的力量很強(qiáng)，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。對(duì)酶沒(méi)有破壞作用。pH的把握：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個(gè)方面考慮，在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)整好酶液的pH值，要盡量避

12、開(kāi)溶液pH值的波動(dòng)以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)要留意攪拌，并留意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。溫度的把握：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對(duì)于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時(shí)間，使酶蛋白完全沉淀下來(lái)，酶靜置后，就不要再加以攪拌。2.2.2 有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類(lèi)物質(zhì)等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。有機(jī)溶劑沉淀操作：有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當(dāng)溫度較高時(shí)變性蛋白質(zhì)分子就會(huì)變成永久失活。因此

13、用有機(jī)溶劑處理時(shí)最好在0以下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過(guò)久，要盡快加水溶解。2.2.3 聚合物絮凝劑沉淀聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭(zhēng)奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中，其濃度可達(dá)到50%，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來(lái)。這種試劑不需要低溫操作，而且對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有肯定的愛(ài)護(hù)作用。聚乙二醇不會(huì)被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。2.2.4 用金屬離子和絡(luò)合物沉淀酶和其他蛋白質(zhì)都會(huì)形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點(diǎn)是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的金屬離子會(huì)催化酶變性而失

14、活。2.2.5 用特殊試劑沉淀法用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來(lái)。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對(duì)于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。2.2.6 親和沉淀將親和反應(yīng)的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機(jī)結(jié)合形成了親和沉淀技術(shù)。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物，該復(fù)合物與生物分子結(jié)合后在肯定條件下可以沉淀出來(lái)。配基-載體復(fù)合物可以選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液中的pH值、離子強(qiáng)度及蛋白質(zhì)濃度等條件對(duì)親和結(jié)合的影響力并不大，只有競(jìng)爭(zhēng)性的配基會(huì)降低產(chǎn)物與原配基的親和結(jié)合力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交

15、聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團(tuán)；轉(zhuǎn)變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀；溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。親和結(jié)合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質(zhì)的溶液中，調(diào)整好有關(guān)沉淀的條件，使之有利于親和結(jié)合。洗滌：為經(jīng)過(guò)處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應(yīng)將使其他蛋白質(zhì)共同沉淀，因此在分別目的物之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當(dāng)?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋恚俪恋?；或在?zhuān)一性洗脫之前，徹底清洗沉淀。在上述過(guò)程中要始終保持目的蛋白質(zhì)與配基處于親和結(jié)合狀態(tài)。配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分別：分別結(jié)束之后，要確?；厥漳康牡鞍踪|(zhì)和配基-載體復(fù)合物，目的蛋白質(zhì)要達(dá)到肯

16、定的純度，回收率要高。3 酶純度的評(píng)價(jià)酶純化的目標(biāo)是使酶制劑具有最大的催化活性和最高純度，檢驗(yàn)這些指標(biāo)的方法主要有電泳法、活性染色法、等電聚集法、超速離心法、抗原-抗體免疫法等。檢測(cè)純化酶的催化活性時(shí)，要使測(cè)定條件下在最適狀態(tài)。如測(cè)定體系中有足夠的激活劑和輔因子，無(wú)抑制劑等，還需搞清酶在什么條件下保存較為穩(wěn)定。在有些狀況下需要加入一些還原劑，如二硫蘇糖醇、羥基乙醇，以保證半胱氨酸側(cè)鏈巰基處于還原態(tài)。在低溫貯存酶時(shí)，可將酶在50%的甘油保存，以削減酶失活。假如酶制劑用前面介紹的方法分析達(dá)到均一，仍有可能其中有部分酶已經(jīng)失活，一般可用“活性部位滴定”技術(shù)測(cè)定活性酶的含量。參考文獻(xiàn)1袁勤生.現(xiàn)代酶學(xué)

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