臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)(五年制醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)適用)

1、緒論基礎(chǔ)免疫學(xué)理論相關(guān)內(nèi)容：抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、HLA免疫系統(tǒng)、免疫應(yīng)答臨床免疫學(xué)抗感染免疫、超敏反應(yīng)、自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫學(xué)檢驗(yàn)抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)：高度特異性_體內(nèi)：體液免疫效應(yīng)T 體外：血清學(xué)反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、補(bǔ)體參與的溶血反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、-中和試驗(yàn)、免疫標(biāo)記技術(shù) ）原理內(nèi)因：Ag、Ab能特異性結(jié)合 外因：Ag、Ab結(jié)合的動(dòng)力 靜電引力（庫(kù)侖引力） 范德華力（電子云力） 小于靜電引力 氫鍵大于范德華力 疏水作用力（作用最大） 鹽析：在高濃度電解質(zhì)（如 NaCI）存在的條件下，NaCI可先與Ab分子結(jié)合（在Ab未與 Ag相遇時(shí)），排斥H2O

2、分子，從而使 Ab蛋白質(zhì)優(yōu)先沉降特點(diǎn)：1. 特異性：交叉反應(yīng)（cross-reaction）:抗體對(duì)具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反應(yīng)。先決條件：存在共同 Ag表位意義：免疫學(xué)診斷：外斐氏反應(yīng)一一用變形桿菌0X19 0X2 OXk做抗原查血清抗體，診斷斑疹傷寒（立克次氏體感染所致） 免疫病理?yè)p害（Eg：鏈球菌感染后易導(dǎo)致腎小球腎炎，原因是鏈球菌與人體腎小球基底膜有共同Ag表位所致）2. 最適比例Ab過(guò)剩，前帶（可溶性抗原抗體復(fù)合物）Ag過(guò)剩，后帶（可溶性抗原抗體復(fù)合物）Ab Ag合適比例沉淀物等價(jià)帶（沉淀物）抗體（等價(jià)帶范圍不同）R型抗體家兔免疫血清H型抗體馬免疫血清3.可逆性：Ag+Af

3、AgAb較寬較窄大多數(shù)小動(dòng)物人和多數(shù)大動(dòng)物原因：非共價(jià)鍵結(jié)合，不是化學(xué)反應(yīng)影響因素 自身因素：Ag：理化性質(zhì)、抗原表位數(shù)目及種類 Ab：來(lái)源（R型or H型）、特異性、親和性、濃度 外界環(huán)境條件：電解質(zhì)：0.9%NaCI, if濃度過(guò)高，會(huì)鹽析 pH： 68, if小于3,酸凝集；過(guò)高，堿變性 溫度：37 C沉淀反應(yīng)及免疫電泳顆粒型抗原凝集反應(yīng)eg:細(xì)菌、RBC可溶性抗原沉淀反應(yīng)eg：血清蛋白溶液、多糖抗原沉淀反應(yīng)（precipitation reaction）:可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)存在,兩者比例恰當(dāng)時(shí)，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀現(xiàn)象Ag :沉淀原Ab沉淀素實(shí)驗(yàn)中為使抗原抗體比例（數(shù)量

4、）恰當(dāng)，應(yīng)稀釋 Ag分類 液相沉淀：絮狀沉淀、環(huán)狀沉淀、免疫比濁測(cè)定 凝膠擴(kuò)散：雙擴(kuò)、單擴(kuò) 凝膠免疫電泳：免疫電泳、對(duì)流免疫、火箭免疫絮狀沉淀試驗(yàn) 出現(xiàn)絮狀/塊狀沉淀 玻片法：檢測(cè)病毒（定性） 試管法：方陣滴定（半定量） 環(huán)狀沉淀反應(yīng) 測(cè)抗原（法醫(yī)血跡鑒定） 免疫透射濁度測(cè)定法檢測(cè) IgG、IgA、IgM、C3凝膠擴(kuò)散（agar immunodiffusion ）:可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在下，在瓊脂 基質(zhì)中擴(kuò)散，當(dāng)兩者相遇，比例恰當(dāng)時(shí)結(jié)合，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線雙擴(kuò)（double immunodiffusion）原理：可溶性抗原和抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中，兩者各自向四周凝

5、膠中擴(kuò)散，當(dāng)二者相對(duì)應(yīng)時(shí)即發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃度比例合適處形成可見(jiàn)的白色沉淀線方法： 制瓊脂板（3ml 1.5%NS瓊脂） 打孔（雙孔型/三角孔型/梅花孔型） 加樣（平孔沿加滿） 擴(kuò)散（37C, 24h觀察結(jié)果）用途： 雙孔型：已知 Ag測(cè)未知Ab, or已知Ab測(cè)未知Ag 三角孔型：抗原性質(zhì)分析 梅花孔型：測(cè)Ag有效稀釋度優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、易行、用途廣缺點(diǎn)：敏感性低、出結(jié)果慢、只定性，不能定量單擴(kuò)（single immunodiffusion）原理：將一定量抗體混澆于瓊脂內(nèi)，置于凝膠孔中的定量抗原向四周擴(kuò)散，抗原與相應(yīng)抗體在比例合適處形成白色沉淀環(huán)，其大小與抗原濃度成正比方法： 已知抗體+瓊脂制板

6、，打孔 在瓊脂板小孔中加梯度抗原 抗原向四周擴(kuò)散形成沉淀環(huán) 抗原濃度與沉淀環(huán)直徑呈線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出并計(jì)算出待測(cè)標(biāo)本含量用途：定量測(cè)定IgG、IgA、IgM、C3等含量影響電泳的因素 溶液的pH,常用89,蛋白質(zhì)帶負(fù)電 溶液的離子強(qiáng)度，越高，泳動(dòng)慢，一般0.020.2M 電場(chǎng)強(qiáng)度，越高，越快，一般46V/cm （瓊脂長(zhǎng)），約40V左右 電滲作用：電場(chǎng)中液體對(duì)于一固體的固定相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象，電滲方向與電泳方向相反原理：定向加速的免疫雙擴(kuò)（雙擴(kuò) +電場(chǎng)，使抗原、抗體相對(duì)泳動(dòng)）方法：Ag、Ab分別在瓊制板上不同孔內(nèi)，Ag在負(fù)極，Ab在正極，電泳電壓：46V/cm （瓊脂長(zhǎng)度）時(shí)間

7、：45分鐘1小時(shí)對(duì)流免疫電泳(coun ter-im muno electrophoresis)pH _: 8.6用途：檢測(cè)HBsAg AFP優(yōu)點(diǎn)：耗時(shí)短、反應(yīng)敏感性強(qiáng)免疫電泳（immuno electrophoresis ）原理：Ag區(qū)帶電泳+雙擴(kuò)結(jié)合方法：Ag電泳分出區(qū)帶Ag、Ab免疫雙擴(kuò)用途：分析復(fù)雜Ag的組分（人全血清組分的分析） 優(yōu)點(diǎn)：用樣品量小，特異性高、分辨力強(qiáng)、多發(fā)性骨髓瘤等疾病的測(cè)定凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)（Agglutination）細(xì)菌、細(xì)胞等 顆粒性抗原 懸液加入相應(yīng)抗體，在電解質(zhì)存在下, 可見(jiàn)得凝聚塊Ag：凝集原 Ab :凝集素 凝集反應(yīng)應(yīng)稀釋抗體兩者特異性結(jié)合，出現(xiàn)肉眼抗原

8、性質(zhì)可溶性Ag顆粒性Ag稀釋對(duì)象抗原抗體結(jié)果現(xiàn)象沉淀現(xiàn)象凝集現(xiàn)象敏感性低高沉淀試驗(yàn)和凝集試驗(yàn)的比較分類： 直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)玻片法試管法（正向）間接（血、膠乳）凝集試驗(yàn) 反向間接（血、膠乳）凝集試驗(yàn) 間接凝集抑制試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn) 直接凝集反應(yīng)（direct agglutination ）細(xì)菌、螺旋體、細(xì)胞等 顆粒性抗原（抗原時(shí)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)）在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，直接與相 應(yīng)抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象玻片法與試管法的區(qū)別玻片法原理已知抗體測(cè)未知抗原定性用途 ABO血型鑒定 菌種鑒定試管法已知抗原測(cè)未知抗體的效價(jià) 肥達(dá)氏反應(yīng)外斐氏反應(yīng) 間接凝集反應(yīng)（in direct agglut in

9、 ati on or passive agglut in atio n）將可溶性抗原或抗體吸附在某種載體微球上，使之成為顆粒性抗原或抗體，然后再與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，出現(xiàn)載體微球的凝集現(xiàn)象載體的要求：不干預(yù)免疫反應(yīng)、顆粒大小均勻常用載體種類：紅細(xì)胞（綿羊、家兔、人O型）聚苯乙烯膠乳顆粒（人工合成高分子材料）等 活性炭粒、硅酸鋁顆粒致敏微粒/致敏顆粒：吸附有抗原或抗體的載體顆粒 間接凝集試驗(yàn)命名（根據(jù)載體不同） 血凝試驗(yàn)（以RBC為載體） 乳膠凝集試驗(yàn)（以膠乳顆粒為載體） （正向）間接（血、膠乳）凝集試驗(yàn)原理：將已知的可溶性抗原吸附于顆粒性載體上，檢測(cè)未知抗體 反向間接（血、膠乳）凝集試驗(yàn)原理

10、：將已知抗體吸附于顆粒性載體上，檢測(cè)未知抗原 實(shí)例：檢測(cè)HBsAg AFP等間接凝集抑制試驗(yàn)原理：待測(cè)樣本（可溶性Ag?） +已知Ab + 已知致敏Ag顆粒（已成為顆粒性 Ag）觀察是否有凝集現(xiàn)象（不凝集為陽(yáng)性，凝集為陰性） 實(shí)例：飛測(cè)切、便中絨毛膜促性腺激素（HCG協(xié)同凝集試驗(yàn)（coagglutination）原理：實(shí)質(zhì)為反向間接凝集反應(yīng)實(shí)例：葡萄球菌A蛋白（SPA）能非特異性地與IgG的Fc段結(jié)合，當(dāng)與特異性抗原相遇時(shí),IgG的Fab段與抗原結(jié)合，出現(xiàn)金葡菌的凝集現(xiàn)象（屬特殊間接凝集試驗(yàn)）用途：用已知抗體檢測(cè)未知抗原，用于多種抗原的檢測(cè)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)的原理用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（

11、示蹤物質(zhì)）標(biāo)記抗原或抗體，作為試劑，與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合反應(yīng)后，測(cè)定抗原抗體復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而推斷所測(cè)抗體或抗原有無(wú)及量的多少 免疫標(biāo)記技術(shù)=免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)免疫技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)（特異性示蹤物標(biāo)記：酶、熒光素、同位素（靈敏性）特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性 分類免疫標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù) 其他標(biāo)記技術(shù)酶免疫組化技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)抑制法雙抗原夾心法r間接法雙位點(diǎn)一點(diǎn)法常用標(biāo)記物 熒光素、酶、同位素、膠體金、可發(fā)光化學(xué)物質(zhì)免疫熒光技術(shù)（IF ）免疫熒光顯微技術(shù)（定性）-免疫熒光測(cè)定技術(shù)（定量）通過(guò)檢測(cè)熒光，確定原理：用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗

12、體或抗原結(jié)合, 標(biāo)本中有無(wú)待測(cè)的抗體或抗原 常用熒光素異硫氰酸熒光黃（FITC）黃綠色四乙基羅丹明（RB2O0橘紅色四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）橙紅色 熒光顯微鏡主要組成紫外光or蘭紫光激發(fā)光譜抑制紫外光or蘭紫光，只許熒光通過(guò)A. 白熾光源（超高壓汞燈）B. 兩組濾光板 激發(fā)濾板T抑制濾板C. 顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 光路程序：白熾光源發(fā)射紫外光 or蘭紫光一一激發(fā)濾板一一紫外光一一被檢物（熒光染色標(biāo)本） 紫外光+熒光抑制濾板一一熒光（我們?nèi)庋垡?jiàn) 一般免疫熒光顯微技術(shù)均標(biāo)記抗體片子制作：切片、涂片、印片 熒光抗體染色法 直接法：待測(cè)標(biāo)本固定（ Ag?） +*Ab *AgAb用途：檢測(cè)抗原

13、優(yōu)點(diǎn)：快，直接，干擾因素少缺點(diǎn)：每檢測(cè)一種抗原要標(biāo)記一種熒光抗體，較麻煩 間接法（用得最多）Stepl :熒光素標(biāo)記抗抗體（如熒光素標(biāo)記的羊抗人IgGStep2 :已知Ag固定+待測(cè)標(biāo)本（Ab?）洗，+熒光標(biāo)記的抗抗體一一洗，熒光顯微鏡鏡 檢優(yōu)點(diǎn)：制備一種熒光標(biāo)記二抗（抗抗體）可用于多種 Ab檢測(cè)靈敏度高 補(bǔ)體法Stepl :熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體Step2 :已知Ag固定+待測(cè)標(biāo)本（Ab?） +補(bǔ)體一一洗，+熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體一一洗，熒光顯 微鏡鏡檢優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，制備一種熒光抗補(bǔ)體用于多種檢測(cè)缺點(diǎn)：干擾因素多，補(bǔ)體不穩(wěn)定，易失活，該法少用 雙標(biāo)記法用兩種熒光素（FITC、羅丹明）分別標(biāo)記針對(duì)同一A

14、g上不同抗原表位的抗體，對(duì)同一標(biāo)本染色，當(dāng)Ag有兩種相應(yīng)抗原表位存在時(shí)，可同時(shí)見(jiàn)到黃綠和橙紅兩種熒光免疫熒光顯微技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：特異性、敏感性高 快速 可定位 既可測(cè)Ag又可測(cè)Ab缺點(diǎn)：需要熒光顯微鏡 存在非特異熒光干擾（原因是自發(fā)抗體不純，交叉反應(yīng)、技術(shù)問(wèn)題） 定性測(cè)定、判斷結(jié)果不客觀 制備片子難保存（熒光猝滅）時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（液相檢測(cè)）原理：用銪（Eu）等具有較長(zhǎng)熒光壽命的稀土金屬作熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記Ab或Ag,從而檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)Ag或Ab的新技術(shù)特點(diǎn)：利用時(shí)間分辨熒光儀延緩檢測(cè)時(shí)間，排除非特異性干擾熒光 靈敏度可達(dá)0.21 ng/ml免疫酶技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：較IF、RIA更優(yōu)越，敏感、安全、

15、穩(wěn)定、易觀察結(jié)果原理：利用酶標(biāo)記Ag或Ab后不改變Ag、Ab反應(yīng)特異性，同時(shí)又不影響酶的活性，結(jié)合在AgAb上的酶催化底物，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物顏色深淺推測(cè)出待測(cè)物中相應(yīng)物質(zhì)（Ag、Ab）有無(wú)及含量多少Ag+AbEAgAbE+底物呈色反應(yīng)特點(diǎn)特異性：Ag、Ab反應(yīng)敏感性：酶的高效催化作用 分類酶免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（免疫組化）酶免疫測(cè)定法（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，ELISA）常用的酶辣根過(guò)氧化物酶 HRP鐵卟啉蛋白質(zhì)，能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，酶活性強(qiáng)，酶結(jié)合物可長(zhǎng)期保存，最適Ph為5.5左右堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶純度：RZ:反映酶含量與蛋白含量之比（最好RZ為3.0左右）活性：每1mg酶中所具有的活性單位，

16、應(yīng)大于 250u/mg底物系統(tǒng)：供氫體、受氫體 HRP的底物鄰苯二胺（OPD反應(yīng)體系中作為供氫體：DH+H2Q.D+2HO供氫體受氫體有色產(chǎn)物特點(diǎn)：有色產(chǎn)物為黃色，空白對(duì)照接近無(wú)色，敏感度高，有致癌作用 四甲基聯(lián)苯胺（_TMB_特點(diǎn)：有色產(chǎn)物為藍(lán)色，無(wú)致癌作用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理 將酶分子與Ab或Ag連接成一酶結(jié)合物（酶標(biāo)記物），當(dāng)它與固相載體中相應(yīng) Ag或Ab相遇, 形成酶標(biāo)記的AgAb復(fù)合物，加入底物，酶催化底物，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色深淺可測(cè)出 溶液中Ag或Ab的量有關(guān)術(shù)語(yǔ)及試劑包被（coat ）:將Ag或Ab吸附在固相載體上的過(guò)程，又稱固相化或吸附 包被后不能被洗脫包被緩

17、沖液：pH： 9.6CB （碳酸鹽緩沖液）洗滌（wash） : pH: 7.27.4PBS （磷酸鹽緩沖液）酶結(jié)合物：酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原終止液：2M H2SQOPD（鄰苯二胺）：酶催化后有色產(chǎn)物為黃色，HbSQ終止后橙色（棕色）TMB（四甲基聯(lián)苯胺）：酶催化后有色產(chǎn)物為藍(lán)色，H2SO4終止后黃色雙抗夾心法步驟包被已知 Ab洗滌加待測(cè)標(biāo)本（測(cè) Ag?） 洗滌加酶標(biāo) Ab洗滌加底 物加終止液觀察結(jié)果用途檢測(cè)抗原，包被的抗體與酶標(biāo)抗體屬同一種類抗體，每檢測(cè)一種抗原就需制備相應(yīng)的酶標(biāo)抗體，較麻煩間接法測(cè)抗體步驟包被已知Ag+待測(cè)標(biāo)本（測(cè)Ab?）反應(yīng)一段時(shí)間后，洗滌一一加酶標(biāo)抗抗體（酶標(biāo)羊抗人IgG）洗

18、滌一一加底物一一加終止液，觀察結(jié)果用途測(cè)抗體，每標(biāo)記一種抗抗體可以用于多種抗體的檢測(cè)雙位點(diǎn)一步法步驟包被抗體A+寺測(cè)標(biāo)本+酶標(biāo)抗體B洗滌，+底物終止液，觀察結(jié)果用途檢測(cè)Ag, Ag至少含A、B兩個(gè)抗原表位競(jìng)爭(zhēng)法步驟待測(cè)管：已知 Ab包被+待測(cè)標(biāo)本（Ag?）洗滌，+酶標(biāo)Ag洗滌，+底物一一顯色應(yīng)用親和素和生物素的ELISA親和素（avidin ）糖蛋白，一分子由四個(gè)亞基組成，每一亞基可以與一分子生物素結(jié)合生物素（biot in ）維生素H,可與蛋白質(zhì)、糖類、酶類等結(jié)合，與親和素特異結(jié)合后極穩(wěn)定 生物素生物素親和素/生物素.生物素 ELISA結(jié)果的判定肉眼判定：與陽(yáng)性、陰性對(duì)照顏色比較 若待檢孔顯

19、色淺于陰性對(duì)照則判定為陰性若待檢孔顯色深于或等于陽(yáng)性對(duì)照則判定為陽(yáng)性 若待檢孔顯色介于陰性與陽(yáng)性對(duì)照之間則判定為弱陽(yáng)性酶標(biāo)光度儀檢測(cè) A492值（吸光率）：比色法 與陽(yáng)性、陰性對(duì)照測(cè)定值比較P/N比值：大于2.0為陽(yáng)性，小于 2.0為陰性P : positive（待測(cè)吸光度值）N : n egative ELISA試驗(yàn)的影響因素（一）固相載體 常用：聚苯乙烯特點(diǎn)：吸附Ag或Ab的能力強(qiáng)，一旦吸附后，不能被洗脫形狀多一一試管、珠、微孔板（酶標(biāo)板）、分軟、硬板（最常用）一次性使用，不可回收酶標(biāo)板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高、板批間、孔間性能相近（二）抗原、抗體Ag：需純化Ab:需效價(jià)高、親

20、和力強(qiáng)、純化（三）試驗(yàn)條件1. 包被：一般用pH9.6CB, 0.05M,有利于蛋白質(zhì)吸附濃度：0.1100ug/ml，常用 10ug/ml時(shí)間、溫度：4C過(guò)夜或37C, 13h量：100ul封閉：用0.15%牛血清白蛋白緩沖液浸泡0.5小時(shí)2. Ag-Ab_反應(yīng)的條件 微堿性有利于Ag-Ab結(jié)合，故用pH7.4PBS洗滌 去污劑有利于 Ag-Ab形成，洗液中加 0.05%Tween-20 Ag、Ab反應(yīng)時(shí)間、溫度：37C、40min3. 洗滌一采用pH7.27.4PBS洗滌，規(guī)一化，每次浸泡12min,拍干，共洗滌 34次4. 酶促反應(yīng)條件_溫度：37 C時(shí)間：10mi npH: 5.5底物

21、量：一致5. _排除干擾：多設(shè)對(duì)照 ElISA應(yīng)設(shè)哪些對(duì)照, 陽(yáng)性對(duì)照：排除假陰性; 物對(duì)照：步加入，無(wú)色；why?加酶步加入陰性對(duì)照：排除假陽(yáng)性；酶結(jié)合物對(duì)照： 空白對(duì)照：只加終止液，無(wú)色 膜載體的酶免疫測(cè)定斑點(diǎn)-ELISA :特點(diǎn)，固相載體為硝酸纖維素膜，酶促反應(yīng)后在膜上形成有色沉淀物 免疫印跡法（_IBT）.應(yīng)用（所有標(biāo)記技術(shù)）病原體的診斷及研究_ 病毒、細(xì)菌等傳染病的診斷（測(cè)抗原或抗體） 病毒、細(xì)菌表面抗原的研究 某些疾病的診斷_ 某些微量物質(zhì)有關(guān)疾病的診斷 腫瘤的診斷及定位 自身抗體檢測(cè)協(xié)助自身免疫病診斷 寄生蟲(chóng)疾病的診斷等 免疫學(xué)方面的研究_T、B細(xì)胞的發(fā)生、演化、表面抗原改變等的

22、研究 微量物質(zhì)的檢測(cè)_體內(nèi)：微量蛋白質(zhì)、激素、酶等抗原；藥物、糖等半抗原 工農(nóng)業(yè)：微生物、微量物質(zhì)等化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，來(lái)檢測(cè)抗原、或抗體的方法化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定（_CLEIA）試驗(yàn)前部分與-ELISA 一樣，改變所加底物，使產(chǎn)物能發(fā)光，用儀器檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，判斷結(jié)果（如酶是用辣根過(guò)氧化物酶，常用底物是魯米諾或其衍生物）化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定（_CLIA）是用化學(xué)發(fā)光劑作為標(biāo)記物直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫測(cè)定方法金免疫技術(shù)采用膠體金作為標(biāo)記物膠體金：又稱金溶膠，是金鹽（氯金酸）被還原（還原劑：檸檬酸鈉）成原子金后的金 顆粒懸液膠體金的特性 膠

23、體性質(zhì)：顆粒穩(wěn)定均勻，分散懸浮，1100 nm 呈色性：顏色與顆粒大小有關(guān)25nm 橙黃色；1020nm,酒紅色；3080nm,紫紅色斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（ DIGFA）原理采用膠體金標(biāo)記抗體， 以硝酸纖維素膜為載體， 使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在同一滲濾膜上，反應(yīng)后根據(jù)在膜上的顏色判斷結(jié)果斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（DICA）原理以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜毛細(xì)管作用，使膜一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析用金標(biāo)記免疫法（斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)）測(cè)HCG的原理對(duì)于HCG陽(yáng)性標(biāo)本，尿中HCG與金標(biāo)記的鼠抗人 HCG單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物， 隨層析作用 向上移動(dòng)，至檢測(cè)線與鼠抗人HCG體結(jié)合而聚集顯色，在檢測(cè)線未

24、結(jié)合的金標(biāo)記鼠抗人HCG單抗（IgG）隨著尿液上行，到達(dá)質(zhì)控線與羊抗鼠IgG （二抗）結(jié)合而顯色，作為質(zhì)控對(duì)昭；八、，對(duì)于HCG陰性標(biāo)本，尿中無(wú)HCG與金標(biāo)記的鼠抗人 HCG單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨層析作 用向上移動(dòng)，至檢測(cè)線與鼠抗人 HCG抗體不結(jié)合而不顯色， 在檢測(cè)線未結(jié)合的金標(biāo)記鼠抗人 HCG單抗（IgG）隨著尿液上行，到達(dá)質(zhì)控線與羊抗鼠IgG （二抗）結(jié)合而顯色，作為質(zhì)控對(duì)昭；八、，若試紙條無(wú)效_，金標(biāo)鼠抗人IgG單抗隨層析作用向上移動(dòng)，到達(dá)質(zhì)控線，無(wú)羊抗鼠IgG （二抗）或破壞失效，不結(jié)合而不顯色，作為質(zhì)控對(duì)照免疫血清的制備概述免疫血清：含有某種抗體的血清。它是免疫化學(xué)和細(xì)胞免疫的

25、主要試劑，其質(zhì)量的好壞由Ab的效價(jià)、特異性決定來(lái)源：由Ag免疫動(dòng)物而來(lái)（Ag可以是純Ag,如白蛋白，也可以是復(fù)雜 Ag,如人全血清）免疫血清的制備主要程序：選擇免疫動(dòng)物-選擇抗原-（應(yīng)用佐劑）-進(jìn)行免疫-（間隔，多途徑）試血-放血- 純化-鑒定-保存動(dòng)物的選擇：1. 常用動(dòng)物：哺乳類較多：馬、羊、豬、猴、兔豚鼠等；禽類：雞2. 選擇原則：免疫的 Ag與動(dòng)物的種類要求越遠(yuǎn)越好（即免疫原性好）；與免疫血清的量有關(guān)：所需量大，用馬、羊、猴等大動(dòng)物；所需量小，用兔、豚鼠等小動(dòng)物；動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)：雄性、適齡、健康、無(wú)感染；其它：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特殊要求?？乖臈l件：具有良好的抗原決定簇（表位）：易被LC識(shí)別而

26、產(chǎn)生 Ab;具有可靠的純度；足夠大的分子 量及相對(duì)復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)；注射量：嚴(yán)格掌握。寧可小，一般用25呃/kg動(dòng)物；量大可出現(xiàn)免疫抑制 佐劑的應(yīng)用：佐劑（adjuvant ）:同Ag 一起或預(yù)先注入機(jī)體，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該Ag的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)（多用于可溶性_Ag,顆粒性_Ag 般不用佐劑）_使用佐劑的目的： 增加Ag的免疫原性，從而提高抗血清的效價(jià)福氏不完全佐劑（_FIA）,組成：羊毛脂+石臘油，二者比例為4： 1制備：將Ag溶液逐滴加入羊毛脂和石蠟油中，不斷研磨，使Ag均勻混于佐劑中，形成“油包水”乳劑要形成“油包水”乳劑的原因：延緩Ag在體內(nèi)的破壞和消失，并緩慢釋放Ag；刺激

27、單核-巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的處理和提呈能力；促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、分化從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答 福氏完全佐劑（_FCA_組成：羊毛脂+石臘油+卡介苗表現(xiàn)：促進(jìn)、誘發(fā) Ag產(chǎn)生強(qiáng)大、持久的細(xì)胞免疫反應(yīng)；促使機(jī)體合成新的lg種類特點(diǎn)：卡介苗同 Ag 一起加入到羊毛脂和石蠟油中，幾滴即可；免疫效果更好；注射局部易 形成肉芽腫，潰爛，但對(duì) Ab生成無(wú)危害注射途徑：常用的有：靜脈、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)、腹腔，采用一種途徑多點(diǎn)注射可溶性Ag：常選用皮內(nèi)或皮下（皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)生Ab有利）顆粒性Ag：常選用靜脈或腹腔若Ag量少，可直接注射淋巴結(jié)注射間隔及次數(shù)：?jiǎn)未巫⑸洌篈b生成慢、持續(xù)時(shí)間短、效價(jià)低，但特異

28、性好再次注射：注射兩次， Ab效價(jià)上升快，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)間隔一定時(shí)間多次注射：Ab效價(jià)高、生成時(shí)間長(zhǎng)，但特異性差，一般為715天一般采用后兩種注射方法注射量：蛋白質(zhì)Ag一般注射14mg/次，注射量過(guò)大易形成免疫耐受試血：末次Ag注射后，測(cè)定血清中 Ab的效價(jià)，若Ab達(dá)到所需效價(jià)，即刻放血，若未達(dá)到， 繼續(xù)追加免疫一次放血：直接頸動(dòng)脈放血或直接心臟穿刺抽血，然后分離出血清，即可得到AbAb效價(jià)判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的（記為 +凝集）抗體最高稀釋度為該抗體的效價(jià)（滴 度 Titer鑒定：Ab效價(jià)的鑒定：可溶性-Ag:雙擴(kuò)，梅花孔型；顆粒性 Ag:用直接凝集試驗(yàn)，試管法Ab特異性的鑒定： 雙擴(kuò)法（雙孔

29、型）方法：在瓊脂上打兩排孔，左邊一側(cè)一孔加粗Ag（ Ag粗提物），一孔加純Ag （特異性Ag）,右邊一側(cè)兩孔分別加抗血清，放37 C, 24h結(jié)果：若抗血清與粗 Ag和純Ag之間皆出現(xiàn)一條沉淀線， 且兩條線融合，則說(shuō)明動(dòng)物易產(chǎn)生 單價(jià)特異性Ab;若與純Ag出現(xiàn)一條線，與粗 Ag出現(xiàn)多條線，則說(shuō)明有雜 AbAb純度的鑒定：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 若出現(xiàn)多條電泳帶， 即提示抗血清中雜蛋白較多，需進(jìn)一步純化保存：小包裝低溫保存：-20 C,避免反復(fù)凍融，可保存 5年，效價(jià)不下降 冰凍干燥保存：用冰凍干燥器使免疫血清形成凍干粉，可保存510年4C加防腐劑保存：可保存半年免疫球蛋白的分離提純目的有

30、利標(biāo)記；減少非特異反應(yīng)；有利 Ig定量分離提純方法（原理）：一般選用23種，或同一方法反復(fù)進(jìn)行 23次鹽析法：在不同濃度的中性鹽中蛋白質(zhì)會(huì)脫水， 降低帶電電勢(shì)，親水性變?yōu)槭杷裕?分子間 相互凝聚而沉淀（鹽析作用）。不同蛋白質(zhì)鹽析所需中性鹽的濃度不同，故可分離不同蛋白質(zhì)。常用中性鹽：硫酸銨分析純?cè)噭╇x子交換層析法：利用不同的蛋白質(zhì)在緩沖溶液中所帶電荷不同，與某一載體上的具有相反電荷的離子基團(tuán)進(jìn)行吸附，然后進(jìn)行解脫，達(dá)到純化蛋白質(zhì)目的。常用載體：纖維素 DEAE帶正電，吸附帶負(fù)電的 Alb、a、B球蛋白凝膠過(guò)濾法：凝膠顆粒是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)分子大小不同的混合物通過(guò)凝膠柱時(shí)，分子大的先下來(lái)，分子小的嵌

31、入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中后下來(lái)，從而將分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，即為分子篩的作用。常用凝膠：葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠， 分離Ig多用G50 親和層析法：利用抗原抗體的結(jié)合具有特異性、可逆性，將純化抗原先.交聯(lián)到載體（瓊脂糖珠）上，制成親和層析柱，當(dāng) Ab （Ig ）通過(guò)時(shí)，與抗原特異性結(jié)合在柱上，Ab中雜質(zhì)流出。然后通過(guò)改變緩沖液 pH、離子強(qiáng)度，使 Ab解脫下來(lái)。單克隆抗體及應(yīng)用概述克?。簾o(wú)性繁殖的細(xì)胞株單克隆：由一個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖而來(lái)的一個(gè)細(xì)胞株（一團(tuán)細(xì)胞），其中所有細(xì)胞特性完全一樣 單克隆抗體（McAb or mAb）針對(duì)Ag分子表面某一抗原決定簇（又稱表位）而產(chǎn)生的抗體分子

32、，稱McAb由一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的識(shí)別單一抗原表位的同源抗體。制備McAb的方法雜交瘤技術(shù)、基因工程技術(shù)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的原理及簡(jiǎn)要步驟原理：能產(chǎn)生抗體的小鼠 B（漿）細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交能生成分泌單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞簡(jiǎn)要步驟：1.制備能產(chǎn)生單抗的雜交瘤細(xì)胞2.克隆化雜交瘤細(xì)胞 3.篩選雜交瘤細(xì)胞4.擴(kuò)大培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞5.收集單抗并鑒定6.純化單抗 B細(xì)胞（漿細(xì)胞）特點(diǎn)能產(chǎn)生抗體，但不能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)， 細(xì)胞內(nèi)含HGPR酶和TK酶，可通過(guò)旁路途徑合成 DNA 骨髓瘤細(xì)胞特點(diǎn)能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，不含 HGPR和TK酶雜交瘤細(xì)胞含兩種共性既能產(chǎn)生抗體，在體外能長(zhǎng)期培養(yǎng)；同時(shí)含有

33、HGPR和TK酶，可通過(guò)旁路途徑合成 DNA HAT培養(yǎng)液的作用（次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）氨基蝶呤是抗代謝的藥物，能阻斷內(nèi)源性合成DNA（合成DNA的主要途徑），選出雜交瘤細(xì)胞漿細(xì)胞/瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：可以生長(zhǎng)HAT培養(yǎng)液中氨基蝶呤阻止 DNA合成；但其含有 HGPRT TK酶，可通過(guò)旁路途徑合成 DNA雜交瘤技術(shù)制備 McAb制備雜交瘤細(xì)胞 制備能產(chǎn)生 McAb的小鼠B細(xì)胞：Ag免疫Ba1b/c小鼠一一測(cè)抗體一一取脾一一制備脾細(xì)胞懸液計(jì)數(shù) 細(xì)胞融合：脾細(xì)胞（B） +小鼠骨髓瘤細(xì)胞一一雜交（脾細(xì)胞15X107/ml，瘤細(xì)胞1078/ml ）融合劑：40%聚乙二醇（PEG 篩選：培養(yǎng)過(guò)程中

34、加入HAT培養(yǎng)液，培養(yǎng)14天，存活細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞鑒定：將篩選出的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定方法：檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中有無(wú)目的Ab,常用ELISA、IF間接法包被已知Ag+雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清（Ab?）洗滌，+酶標(biāo)羊抗鼠IgG洗滌，+底物一 根據(jù)顯色判斷有無(wú)特異Ab克隆化 有限稀釋法：特異性雜交瘤細(xì)胞稀釋：710個(gè)/ml ,取0.1ml/孔，反復(fù)稀釋培養(yǎng)，經(jīng)ELISA 間接法篩選、檢測(cè)特異抗體 顯微操作法：直接在顯微鏡下取單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)、測(cè)特異抗體（篩選和克隆化應(yīng)反復(fù)交叉進(jìn)行）凍存或擴(kuò)大培養(yǎng) 在液氮中凍存鑒定后的雜交瘤細(xì)胞備用，需要時(shí)復(fù)蘇 擴(kuò)大培養(yǎng)（增殖），可得到大量單克隆抗

35、體體外法：將雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，傳代體內(nèi)法：將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)，利用它具有瘤細(xì)胞的特點(diǎn)能大量繁殖，產(chǎn)生腹水， 腹水中有大量的單抗鑒定 聚丙烯酰胺凝膠鑒定單克隆抗體的純度 用ELISA、免疫電泳法鑒定抗體特異性純化鹽析法、離子交換層析法、凝膠過(guò)濾法、親和層析法（任選12種）雜交瘤技術(shù)制McAb的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：制備的單抗特異性高、效價(jià)高、產(chǎn)量高 缺點(diǎn)：需特殊條件、無(wú)菌操作、難得到穩(wěn)定細(xì)胞株；抗體為抗鼠的IgG抗體，長(zhǎng)期用于人體不利 人源單克隆抗體單克隆抗體為人IgG，用于人基因工程抗體基因工程抗體在基因水平上對(duì)編碼抗體的基因進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚至人工合成，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)

36、表達(dá)而產(chǎn)生的抗體（單克隆抗體） 嵌合抗體用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗基因的可變區(qū)（ V區(qū)）基因與產(chǎn)生人lg的恒定區(qū)（C區(qū)）基因 相連接，構(gòu)成嵌合基因，導(dǎo)入受體細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞），表達(dá)出嵌合抗體嵌合基因：紅色-鼠McAb可變區(qū)基因；綠色-人lg的恒定區(qū)基因嵌合抗體：可變區(qū)為鼠McAb部分，其它部分為人lg部分構(gòu)建成功的嵌合抗體抗乳腺癌（1986）,抗結(jié)腸癌（1987）,抗肺癌（1987）,抗CEA（癌胚抗原1989）,抗HBsAg（1990我國(guó)），抗T表面受體 BMA031-lgG（ 1991我國(guó)）嵌合抗體的優(yōu)點(diǎn)a.免疫原性低，有利于用于人體b.在人體內(nèi)半衰期較鼠單抗長(zhǎng)c.在人體內(nèi)生物學(xué)作用（如C

37、DC ADCC較鼠單抗強(qiáng)d.與人/人雜交瘤比，體外傳代更穩(wěn)定重構(gòu)抗體（Reshaped Antibody ）以人lg基因?yàn)榭蚣?，去掉高變區(qū)部分，用鼠單抗高變區(qū)基因連接上，構(gòu)成重構(gòu)基因，倒入 受體細(xì)胞表達(dá)出的抗體重構(gòu)基因：綠色為人lg基因（框架），紅色為鼠McAb基因（高變區(qū)部位基因）重構(gòu)抗體：所有綠色部分均為人源，紅色部分為鼠源（ CDR單鏈抗體（具有結(jié)合抗原活性的單鏈蛋白）是一種新的重組多肽，由一個(gè)人工設(shè)計(jì)的短多肽接頭（基因）將編碼輕鏈V區(qū)基因的C末端與編碼重鏈V區(qū)基因的N末端相連接，然后整合到大腸桿菌基因上，表達(dá)出具有結(jié)合抗原特性的融合蛋白單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn) 分子小，在血清中比 McAb或Fa

38、b段清除快 無(wú)Fc段，免疫原性低 較McAb更易進(jìn)入實(shí)體瘤細(xì)胞周圍微循環(huán)中 可將多肽接頭設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn)如：金屬螯合物、毒素、藥物，用于影像、治療 等單克隆抗體的應(yīng)用細(xì)菌學(xué)方面用于診斷、研究病毒學(xué)萬(wàn)面快速診斷、病毒學(xué)研究、病毒性疾病的治療和預(yù)防（單抗用于治療，特異性高，所需量小， 減少變態(tài)反應(yīng)發(fā)生）腫瘤方面的應(yīng)用_ 診斷、腫瘤的治療在寄生蟲(chóng)學(xué)方面及其他方面的應(yīng)用補(bǔ)體的檢測(cè)及應(yīng)用補(bǔ)體 Complement是存在于人和動(dòng)物血清中的一組具有酶活性的球蛋白，一般情況下處于未激活狀態(tài)補(bǔ)體的特性穩(wěn)定性差，各種理化因素都可使之失活：如酸、堿、紫外線照射、劇烈震蕩等實(shí)驗(yàn)室滅活補(bǔ)體的條件為： 補(bǔ)體檢測(cè)必

39、須用新鮮血清56 C 30'，室溫23天也可自然失活補(bǔ)體的組成1. 補(bǔ)體的固有成分：C1-C9,其中C1又包括C1q、C1r、C1s,共9種成分11種蛋白分子。其 中C9的分子量最小、C3的含量最高2. 補(bǔ)體的調(diào)節(jié)蛋白：如 C4調(diào)節(jié)蛋白、C1抑制物、S蛋白等3. 補(bǔ)體受體：如 C1qR C3aR等補(bǔ)體的激活：三條途徑經(jīng)典激活途徑：又稱C1途徑激活劑：IgG、IgM形成的AgAb復(fù)合物參與成分：C1C9激活過(guò)程：這是一個(gè)連鎖反應(yīng)，缺少其中任何一個(gè)組分，連鎖反應(yīng)都不能進(jìn)行下去旁路激活途徑： 又稱C3途徑激活劑：脂多糖、酵母多糖、IgG4和IgA的聚合物（提供接觸表面）參與成分：C3 C5C

40、9 B因子、D因子、P因子甘露糖結(jié)合凝集素途徑_：又稱MBL途徑在感染早期，常采用前兩個(gè)途徑，產(chǎn)生Ab后采用第一個(gè)途徑補(bǔ)體的生物學(xué)作用溶菌、溶細(xì)胞作用（MAC效應(yīng)）；調(diào)理作用（C3b、C4b和iC3b）;免疫黏附作用（C3b、C4b）; 炎癥介質(zhì)作用：趨化作用（C3a, C5a）過(guò)敏毒素作用（C3a, C4a, C5a）補(bǔ)體的檢測(cè)功能檢測(cè)：總補(bǔ)體活性的檢測(cè)、單一補(bǔ)體活性的檢測(cè)（溶血試驗(yàn)）量的檢測(cè)：?jiǎn)我谎a(bǔ)體量的檢測(cè)（免疫比濁法或單擴(kuò)法）溶血試驗(yàn)Sb（+兔抗Srbc抗體（溶血素）+新鮮血清（提供補(bǔ)體）啟動(dòng)經(jīng)典激活途徑（溶血）指示系統(tǒng)：綿羊紅細(xì)胞和溶血素補(bǔ)體來(lái)源：多只豚鼠的混合血清 總補(bǔ)體活性檢測(cè)：

41、CH5 0試驗(yàn)原理：組成和功能完整的補(bǔ)體系統(tǒng)能使致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血；羊紅細(xì)胞的溶血程度與補(bǔ)體的活性成正比概念：在50%溶血附近（30% 70%之間），稍微改變補(bǔ)體量，溶血程度變化明顯，因此以 50%溶血率來(lái)判定終點(diǎn)較 100 %更為敏感檢測(cè)結(jié)果處理：最后找到與制備好的 50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管比較，取吸光度值最接近的一管，則CH50 （U/ml ） =1/血清用量X稀釋倍數(shù)總補(bǔ)體活性參考范圍：.50 100U/ml單一補(bǔ)體活性的檢測(cè)（溶血試驗(yàn)），常用于檢測(cè) C3 C4、C1cq B因子等單一補(bǔ)體量的測(cè)定：采用免疫比濁法或單擴(kuò)法，常檢測(cè) C3 （含量12001300ug/ml ）補(bǔ)體檢測(cè)的臨床意義1.

42、 補(bǔ)體量f:多見(jiàn)于急性炎癥感染、組織損傷、癌腫2. 補(bǔ)體量見(jiàn)于補(bǔ)體消耗f:體內(nèi)有Ag、Ab反應(yīng)，如SLE RA等；補(bǔ)體合成肝臟疾患；補(bǔ)體先天性缺乏：具有遺傳性和家族史 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 原理：補(bǔ)體可與任何一組 AgAb復(fù)合物結(jié)合；一旦與某一復(fù)合物結(jié)合后，便不再與另一復(fù)合 物結(jié)合結(jié)果判斷：不溶血為陽(yáng)性，即待測(cè)物中有相應(yīng)的Ab或Ag；溶血為陰性，即待測(cè)物中無(wú)相應(yīng)的Ab或Ag評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：該試驗(yàn)既可測(cè) Ag、又可測(cè)Ab； Ag既可以是顆粒性 Ag、也可是可溶性 Ag、甚至可以 是塊狀物，因此檢測(cè) Ag的范圍廣；可以用于病毒、立克次氏體、細(xì)菌等多種病原體的檢測(cè)（實(shí)際上是測(cè) Ag）；比較敏感（0.05卩g/m

43、l）、特異；結(jié)果判斷明顯：通過(guò)有無(wú)溶血來(lái)觀察， 無(wú)需特殊儀器檢測(cè)。缺點(diǎn)：參與反應(yīng)的物質(zhì)多，影響因素也多；（反應(yīng)體系中有 Ag Ab C羊紅細(xì)胞、溶血素）；在正式試驗(yàn)前需要找出幾種物質(zhì)間最恰當(dāng)?shù)谋壤?，比較復(fù)雜機(jī)體免疫功能檢測(cè)免疫應(yīng)答的類型及組成分為非特異性免疫應(yīng)答_和特異性免疫應(yīng)答人體免疫功能的組成成分非特異性免疫應(yīng)答_ （固有性免疫應(yīng)答）_1. 皮膚黏膜的機(jī)械阻擋作用及局部分泌的抑菌、殺菌物質(zhì)2. 吞噬細(xì)胞的吞噬作用3. NK細(xì)胞對(duì)病毒感染靶細(xì)胞的殺傷作用4. 血液、體液中的抗菌分子：補(bǔ)體、溶菌酶特異性免疫應(yīng)答_ （適應(yīng)性免疫應(yīng)答）_ 細(xì)胞免疫：由TLC主導(dǎo)完成，其效應(yīng)物質(zhì)是致敏TLc（CTL

44、/Th1）體液免疫：由BLC主導(dǎo)完成，其效應(yīng)物質(zhì)是 Ab檢測(cè)人細(xì)胞免疫和體液免疫最常用的試驗(yàn)，原理及正常值T細(xì)胞的計(jì)數(shù)（T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)）特異性抗原的檢測(cè)_（T細(xì)胞表面有一些特異的 CD抗原，根據(jù)這些不同的 CD抗原可鑒定不同的 T細(xì)胞群體）CD3+成熟的總_丁淋巴細(xì)胞的數(shù)量；_CD4土 Th細(xì)胞；CD8+CTL/TS； CD4+/CD8Q 1.5免疫熒光法丁用熒光素標(biāo)記的單抗作為試劑染色淋巴細(xì)胞，計(jì)算出染上熒光的淋巴細(xì)胞百分率，另有免疫細(xì)胞化學(xué)法T細(xì)胞特異性受體（E受體）的檢測(cè)（_E花環(huán)形成試驗(yàn)）_原理：T淋巴細(xì)胞表面含有綿羊紅細(xì)胞（SRBC受體（CD2）,當(dāng)T淋巴細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞相遇時(shí)

45、，T細(xì)胞通過(guò)該受體吸附綿羊紅細(xì)胞而形成花環(huán)E花環(huán)形成試驗(yàn)分為 Et （總E花環(huán)）和Ea （活性E花環(huán)），區(qū)別如下SBcEt: 1： 50100, 4C, 2h,代表 T細(xì)胞總數(shù)，正常值_60%80%SRB（Ea： 1： 820, 4C, 10min，能形成 Ea 的 Txibao 活性強(qiáng)，正常值_20%30%T細(xì)胞功能的檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理：淋巴細(xì)胞在某些物質(zhì)刺激下，細(xì)胞增殖、分化（如細(xì)胞變大、胞漿增多、出現(xiàn)空泡）DNA合成增加（核染色質(zhì)疏松，核仁出現(xiàn)），轉(zhuǎn)化成為淋巴母細(xì)胞方法： 形態(tài)學(xué)檢測(cè)法：正常值 60% 80% 同位素?fù)饺敕ǎ╛3H-TdR摻入法）_原理:T細(xì)胞受PHA刺激后，細(xì)胞進(jìn)

46、入增殖周期發(fā)生有絲分裂合成DNA試驗(yàn)中當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)，在培養(yǎng)液中加入 3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），細(xì)胞攝入，合成 DNA據(jù)摻入細(xì)胞內(nèi) 的同位素量，可推測(cè)細(xì)胞增殖活躍程度，從而判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的程度。正常值_SI > 3.0MTT比色法（四甲基偶氮唑鹽）T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL的檢測(cè)，評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)方法： 形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例加在一起培養(yǎng)一段時(shí)間，染色后計(jì)數(shù)殘留靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）數(shù)，計(jì)算淋巴細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率 同位素法：常用51Cr釋放試驗(yàn)原理：用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞（一般為腫瘤細(xì)胞），將它與待測(cè)淋巴細(xì)胞（效應(yīng) CT

47、L細(xì)胞）一起 培養(yǎng)，效應(yīng)細(xì)胞破壞靶細(xì)胞，51Cr釋放出來(lái)，測(cè)定其51Cr數(shù)量，便可推知效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能 力。特異溶解百分率大于_ 50%為陽(yáng)性_細(xì)胞免疫功能體內(nèi)檢測(cè)法_"型超敏反應(yīng)皮試二：一W型超敏反應(yīng)的本質(zhì)是細(xì)胞免疫，所以W型超敏反應(yīng)如為陽(yáng)性，可反 映細(xì)胞免疫功能好陽(yáng)性（直徑>0.5cm）:曾感染過(guò)結(jié)核菌，細(xì)胞免疫功能好陰性（直徑< 0.5cm）:細(xì)胞免疫功能差或從未感染過(guò)結(jié)核菌強(qiáng)陽(yáng)性（直徑>2.5cm）:表明現(xiàn)處于結(jié)核的活動(dòng)期B細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)B細(xì)胞表面識(shí)別抗原受體（BCR Smlg）（更多用）B細(xì)胞表面膜免疫球蛋白，有IgM、IgD型，是B細(xì)胞表面標(biāo)志，識(shí)別抗原

48、的受體，有Smlg者為B細(xì)胞，常用免疫熒光法檢測(cè)，正常值：15%25%B細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)_B細(xì)胞表面特有的 CD抗原有：CD19 CD2Q用抗CD20的單抗（免疫熒光法、 酶免疫組化法） 檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞，約占總淋巴細(xì)胞的10%15%B細(xì)胞功能的檢測(cè)血清中g(shù)_的測(cè)定_人的體液免疫功能正常（B細(xì)胞功能正常），應(yīng)反映在血清中有正常量的免疫球蛋白 方法：?jiǎn)雾?xiàng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫比濁法正常值：IgG: 12.0 （7.616.60 ） ; IgM： 1.3 （0.402.20 ） ; IgA: 2.0 （0.703.50 ） 血型抗體效價(jià)的測(cè)定_反映體內(nèi)IgM水平，正常6月嬰兒

49、抗A >1: 8，或抗B > 1 : 4; 1歲后抗A>1:16，或抗B > 1: 8,如3歲以上抗A或抗B效價(jià)仍< 1 : 4，表示IgM缺乏，提示先天性體液免疫功能缺陷 抗原刺激機(jī)體后抗體應(yīng)答反應(yīng)（體內(nèi)試驗(yàn)）將抗原注射到體內(nèi)，一段時(shí)間后檢測(cè)相應(yīng)抗體效價(jià)，如抗體效價(jià)低，說(shuō)明機(jī)體體液免疫功能差（如用三聯(lián)傷寒菌苗 0.25ml注射，每周1次，連續(xù)3次，抗H應(yīng)為1 : 160，若低，表 示體液免疫應(yīng)答功能差）傷寒三聯(lián)菌苗：傷寒桿菌、副甲、副乙傷寒桿菌淋巴細(xì)胞分離技術(shù)原理（密度梯度離心）不同種類血細(xì)胞由于體積、形態(tài)、比重不同，如同其置于同一種離 心力作用下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間

50、離心，就會(huì)分在不同的層次中常用的分離液（Ficoll分離液）：淋巴細(xì)胞分離液，由聚蔗糖和泛影葡胺組成自身免疫性疾病及其檢測(cè)免疫復(fù)合物及檢測(cè)|免疫復(fù)合物IC當(dāng)Ag在體內(nèi)持續(xù)存在或由微生物與宿主細(xì)胞不斷釋放入細(xì)胞外液時(shí)，可引起特異性 Ab產(chǎn)生,從而形成免疫復(fù)合物，包括AgAb復(fù)合物和AgAbC復(fù)合物兩種免疫復(fù)合物致病機(jī)理中等大小的IC沉積在體內(nèi)，通過(guò)激活補(bǔ)體、血小板致病激活補(bǔ)體：激活C3a、C5a C567趨化嗜中性粒細(xì)胞釋放溶酶體酶引起組織損 你激活 C3a C5a （過(guò)敏毒素）一一作用與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞一一釋放血管活性物質(zhì)一一血管通透性增加一一引起組織水腫激活血小板：與血小板上的IgGF

51、c受體結(jié)合使血小板聚集微血栓形成局部出血 缺血、壞死常見(jiàn)病損部位：腎小球、關(guān)節(jié)、皮膚所致疾病：血清病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 IC檢測(cè)使用的標(biāo)準(zhǔn)品、出現(xiàn)的問(wèn)題及WHO!薦的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)品：HAH熱聚合人IgG （不是IC）技術(shù)問(wèn)題：到目前為止，所有檢測(cè)IC的試驗(yàn)，還沒(méi)有另人滿意的標(biāo)準(zhǔn)化措施；在體外制備的IC還很不穩(wěn)定，因此用人工合成的復(fù)合物作為定量標(biāo)準(zhǔn)不適宜WHO C1q結(jié)合試驗(yàn)、膠固素試驗(yàn)、類風(fēng)濕因子（RF）試驗(yàn)、Raji細(xì)胞試驗(yàn)自身免疫性疾病及檢測(cè)自身免疫性疾病 AID指機(jī)體針對(duì)自身組織產(chǎn)生自身抗體或致敏淋巴細(xì)胞，而導(dǎo)致自身組織器官損傷或功能障礙 AID的基本特征誘因可有可無(wú)/有一

52、定的遺傳傾向/女性患者多見(jiàn)，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加； 患者血清中可 檢出高效價(jià)的自身抗體和（或）自身致敏 T淋巴細(xì)胞。一些自身抗體在自身免疫病中呈現(xiàn) 交叉重疊現(xiàn)象：即在同一種自身免疫病患者體內(nèi)可檢測(cè)到多種自身抗體，而不同的自身免疫 病也可存在同一種自身抗體；IgG、IgA、IgM升高，尤其IgG升高明顯；病損局部可發(fā)現(xiàn)有 淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫復(fù)合物沉積；免疫抑制劑治療可取得一定療效常見(jiàn)的AID系統(tǒng)性紅斑狼瘡（_SLE）m型：好發(fā)于年輕女性，腎損害，川型超敏反應(yīng)，抗核抗體、RF類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）川型：小關(guān)節(jié)及周圍組織呈對(duì)稱性、多發(fā)性損害，川型超敏反應(yīng)，RF （IgM類）自

53、身免疫性溶血性貧血（_AIHA）n型：n型超敏反應(yīng)重癥肌無(wú)力（MG_n型：n型超敏反應(yīng) AID的自身抗體檢測(cè)意義病人血清中存在高效價(jià)自身抗體是AID的特點(diǎn)之一抗核抗體ANA的定義抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的總稱，廣義地指抗細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總 和.ANA所針對(duì)的靶抗原由細(xì)胞核擴(kuò)展到整個(gè)細(xì)胞，包括細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架及細(xì)胞 周期等抗核抗體譜（ANAS的組成抗 DNA抗體：抗 dsDNA 抗 ssDNA抗體抗組蛋白抗體（_AHA）:抗H1、H2A H2B H3 H4等抗ENA抗體：抗Sm抗核糖核蛋白（RNP、抗SS-A、抗SS-B等抗非組蛋白抗體：抗Scl-70、抗Jo-1、抗Ku、抗增殖細(xì)胞核抗原（PCN）抗PL-7、抗PL-12、 抗著絲點(diǎn)抗體等抗核仁抗體：抗 PM-Scl、抗NOR-90抗U3nRNA抗細(xì)胞其它成分抗體：抗高爾基體、抗中心體、抗線粒體、抗肌動(dòng)蛋白、抗核層蛋白等各種AID檢測(cè)時(shí)的代表性自身抗體抗雙鏈_DNA抗體（dsDNA :對(duì)SLE有較高特異性，70-90%活動(dòng)性SLE患者該抗體陽(yáng)性，是SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一抗組蛋白抗體（AHA：在藥物