蛋白質(zhì)組學(xué)答案終稿VIP

1、1， 基因組：一個(gè)細(xì)胞或病毒所包含的全部基因。2， 蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出。定義：蛋白質(zhì)組是由一個(gè)細(xì)胞，一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)。是一個(gè)整體概念。 3， 蛋白質(zhì)組學(xué)：是一門(mén)以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究(如表達(dá)水平、轉(zhuǎn)錄修飾、相互作用等)為基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)水平對(duì)疾病機(jī)理、細(xì)胞模式、功能聯(lián)系等方面進(jìn)行探索的科學(xué)，包括表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，細(xì)胞譜蛋白質(zhì)組學(xué)以3， 等電聚焦：分離兩性分子，特別是分離蛋白質(zhì)的一種技術(shù)。根據(jù)在一個(gè)電場(chǎng)的影響下這些兩性分子在ph梯度上的分布情況進(jìn)行分離等電聚焦技術(shù)：在一個(gè)pH梯度和外加電場(chǎng)下，蛋白質(zhì)有移向pH梯度中使

2、其凈電荷為零的點(diǎn)的傾向。（帶正電荷移向陰極，帶負(fù)電荷移向陽(yáng)極）。IEF可以基于極微小的電荷差異而分離蛋白，具有高分辨率。4， 負(fù)染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒(méi)有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果（圖2-15），分辨力可達(dá)1.5nm左右5， 質(zhì)譜（又叫質(zhì)譜法）是一種與光譜并列的譜學(xué)方法，通常意義上是指廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中通過(guò)制備、分離、檢測(cè)氣相離子來(lái)鑒定化合物的一種專門(mén)技術(shù)。質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶

3、正電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。n 7，分子離子峰：子受電子束轟擊后失去一個(gè)電子而生成的離子M+成為分子離子。在質(zhì)譜圖中，由M+所形成的峰稱為分子離子峰。7.碎片離子峰 當(dāng)電子轟擊的能量超過(guò)分子離子電離所需要的能量（5070eV）時(shí)，可能使分子離子的化學(xué)鍵進(jìn)一步斷裂，產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)較低的碎片，稱為碎片離子。在質(zhì)譜圖上出現(xiàn)相應(yīng)的峰，稱為碎片離子峰。碎片離子峰在質(zhì)譜圖上位于分子離子峰的左側(cè)。研究最大豐度的離子斷裂過(guò)程，能提供被分析化合物的結(jié)構(gòu)信息。8.軟電離技術(shù) 在質(zhì)譜分析中，

4、離子源是將分子離解成離子或解離成碎片，在這里分子失去電子，生成帶正電荷的分子離子。分子離子可進(jìn)一步裂解，生成質(zhì)量更小的碎片離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對(duì)于不同的分子應(yīng)選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法，后一種方法適用于易破裂或易電離的樣品。9.源內(nèi)衰變技術(shù)（insource-decay，ISD）源內(nèi)衰變發(fā)生在離子源區(qū)域內(nèi)，時(shí)間為激光撞擊之后幾百納秒之內(nèi)，是離子的“即可片段化”。這些片段離子通過(guò)衰減離子取出，能在線性飛行時(shí)間質(zhì)譜中被發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質(zhì)和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的離子源區(qū)域內(nèi)變成

5、肽離子片段。主要產(chǎn)生含N端的b型和含C端的y型片段離子，通過(guò)分析這些片段離子譜可鑒定蛋白質(zhì)。10.肽質(zhì)量指紋圖譜 是指蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列都不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)據(jù)也具特征性，這種特征就像指紋一樣，所以稱為指紋譜。肽質(zhì)量指紋圖譜可用于蛋白質(zhì)的鑒定，用實(shí)驗(yàn)測(cè)得的PMF與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)理論P(yáng)MF比對(duì)，就可以鑒定該蛋白質(zhì)肽序列標(biāo)簽是由一個(gè)多肽的部分氨基酸序列和該肽的質(zhì)量以及該肽未測(cè)序部分的質(zhì)量等組成。11.生物質(zhì)譜就是運(yùn)用現(xiàn)代質(zhì)譜儀器解決生物學(xué)問(wèn)題，如蛋白質(zhì)測(cè)序，生物大分子分子量檢測(cè)，磷

6、酸化位點(diǎn)檢測(cè)等生物質(zhì)譜：主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍。12. 基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）在波長(zhǎng)為7751250 nm 的真空紫外光輻射下產(chǎn)生光致電離和解吸作用，從而獲得分子離子和含有結(jié)構(gòu)信息的碎片，同時(shí)引入基質(zhì)減少過(guò)分碎裂。基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)適于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易汽化的大分子。一般采用固體基質(zhì)，基質(zhì)與樣品比為10000：1。根據(jù)分析物不同而使用不同的基質(zhì)和波長(zhǎng)電噴霧電離（Electrospray Ionizsation,ESI ） 利用強(qiáng)靜電場(chǎng)從溶液直接產(chǎn)生

7、氣態(tài)離子化分子的一種方法采用強(qiáng)靜電場(chǎng)（35kV），以噴霧形式使液體樣品形成高度荷電的霧狀小液滴，小液滴經(jīng)過(guò)反復(fù)的溶劑揮發(fā)-液滴分裂后，產(chǎn)生單個(gè)帶多電荷的離子，即在電離過(guò)程中，產(chǎn)生多種質(zhì)子化離子。13. 蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，甚至DNA蛋白質(zhì)、RNA蛋白質(zhì)的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點(diǎn)等。15.亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)內(nèi)涵 針對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域結(jié)構(gòu)功能單位的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。細(xì)胞內(nèi)成分根據(jù)空間結(jié)構(gòu)、分布及功能不同，分成不同細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)域，如細(xì)胞膜、胞漿、線粒體、溶酶體、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞核等。另外，細(xì)胞器內(nèi)一些

8、功能單位多是大分子結(jié)構(gòu)體或多蛋白復(fù)合體，如核基質(zhì)、剪接體、紡錘體、核孔結(jié)構(gòu)以及核糖體等。16.2D雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS-PAGE（按照分子大?。?，經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。二，簡(jiǎn)答題 1. 質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)由7部分組成：進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源室、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)。其中離子源室、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器必須處于高真空狀態(tài)，離子源要求10-410-5Pa, 質(zhì)量分析器要求10-6Pa，以降低背景以及減少離子間或離子與分

9、子的碰撞。進(jìn)樣系統(tǒng)：把樣品從室內(nèi)常壓轉(zhuǎn)移到離子源。離子源室：把品分子轉(zhuǎn)換成樣品離子。（品離子是帶有電荷的樣品分子。最簡(jiǎn)單的形成樣品離子的方法就是從中行分子里移除一個(gè)電子，這樣就形成了正離子。樣品分子必須變成樣品離子才能被質(zhì)譜所分析。）   在質(zhì)量分析器里，電場(chǎng)或者磁場(chǎng)，或者兩者都有的分析器，被用來(lái)控制樣品離子的運(yùn)動(dòng)，這樣便可根據(jù)其質(zhì)量不同而將其分離。雖然有很多不同的質(zhì)量分析器，但是都執(zhí)行相同的功能：根據(jù)質(zhì)量分離不同的離子。   檢測(cè)器可以感知已經(jīng)被分離的離子的到達(dá)，放大極其微小的離子的電流以便進(jìn)一步的電子處理。雖有很不不同類型的檢測(cè)器，但作用都一樣，就是

10、檢測(cè)離子并將其轉(zhuǎn)換成較強(qiáng)的電信號(hào)。   記錄儀接受檢測(cè)器的信號(hào)，將其放大并記錄，這樣就得到了質(zhì)譜圖。質(zhì)譜要在真空系統(tǒng)運(yùn)行。減少空氣中成分的干擾。常真空度的范圍是室內(nèi)常壓的百萬(wàn)分之一或者十億分之一。離子源，質(zhì)量分析器和檢測(cè)器在真空系統(tǒng)里。2.質(zhì)譜肽譜分析通過(guò)測(cè)定肽和蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，加上已知蛋白和DNA序列的信息，來(lái)試探性的確認(rèn)給定組織或體液中存在的肽和蛋白質(zhì)。質(zhì)譜肽譜分析分4步：（1）從生物組織提取多肽和蛋白質(zhì)并分餾提取液（2）測(cè)定提取液中各組分的分子質(zhì)量（3）從肽或蛋白質(zhì)的計(jì)算機(jī)庫(kù)中搜索被測(cè)的分子質(zhì)量是否符合特定的肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)量；（4）再確認(rèn)分析，如部分N端或C端的測(cè)序

11、分析、氨基酸分析或串聯(lián)質(zhì)譜分析，這些再確認(rèn)分析的對(duì)象應(yīng)是那些在（1）（3）步中仍不能十分確認(rèn)的特定肽或蛋白質(zhì)3.ESI特點(diǎn)是產(chǎn)生多電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。目前可檢測(cè)分子質(zhì)量100 000Da以下的蛋白質(zhì)，最高可達(dá)150 000Da。優(yōu)勢(shì)就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液一質(zhì)聯(lián)用（LCMS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測(cè)大分子物質(zhì)的目MALDLI 特點(diǎn)1.MALDAI 源使用的激光是脈沖式，每一脈沖激光產(chǎn)生的離子都先經(jīng)過(guò)一加速電場(chǎng)而獲得動(dòng)能，然

12、后再進(jìn)入一個(gè)高真空無(wú)電場(chǎng)飛行管道，離子在此無(wú)電場(chǎng)飛行管道內(nèi)以在加速電場(chǎng)獲得的速度勻速飛行。離子越小，飛行速度越快。每一脈沖激光產(chǎn)生一批離子得到一張質(zhì)譜圖，一般使用的是多次脈沖激光掃描質(zhì)譜峰結(jié)果的累加。2.所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的譜峰與樣品各組分的質(zhì)量數(shù)有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。最適于分析多肽和蛋白質(zhì)混合物，蛋白質(zhì)序列分析，制作太指紋圖譜，測(cè)量化合物分子量等，在基因領(lǐng)域的研究也可以應(yīng)用于DNA序列測(cè)定、DNA點(diǎn)突變、遺傳病診斷等。3.MALDAI 源的離子化程度非常高，是靈敏度最高的質(zhì)譜儀，能對(duì)極微量的樣品（fmol-amol)進(jìn)行分析的。4.基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸

13、中及其同系物）并形成晶體，當(dāng)用激光（337nm 氮激光）照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收激光能量，又以熱的形式將能量釋放，樣品解吸附，同時(shí)基質(zhì)晶體升華，基質(zhì)和樣品分子氣化進(jìn)入質(zhì)譜儀的氣相。基質(zhì)-樣品間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。 5. 基本原理 主要利用物質(zhì)在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。 6.1.雙向磷酸多肽圖譜 2.高分辨率凝膠電泳 3.固相金屬親和色譜4.反相高效液相色譜 5.毛細(xì)管電泳6.免疫沉淀7.化學(xué)修飾法 8.另外一種修飾手段，不僅可以用來(lái)研究磷酸化絲氨酸肽段和磷酸化蘇氨酸肽段，還可以研究磷酸化酪氨酸肽段。這方法的顯著特點(diǎn)是：通過(guò)碳化二乙胺的催化作用將胱氨酸加到磷酸基團(tuán)上，

14、再通過(guò)巰基乙胺與碘乙酰樹(shù)脂柱的共價(jià)結(jié)合使磷酸化肽得以純化。但肽的N端首先用叔丁氧羰基保護(hù)；C端進(jìn)行酰胺化保護(hù)，以免復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)生。磷酸肽的洗脫是通過(guò)三氟乙酸切割氨基磷酸鍵完成的。碳化二乙胺方法在質(zhì)譜分析前，需要多步化學(xué)反應(yīng)和柱純化過(guò)程，所以可能會(huì)有大量的樣品丟失，而且這種方法只適用于磷酸肽的富集，目前還沒(méi)有應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)的富集 7.原理:質(zhì)譜是很好的蛋白質(zhì)鑒定工具，但不同的蛋白質(zhì)或多肽在質(zhì)譜中有不同的離子化效率，所以不能從質(zhì)譜圖中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。以穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo)，將物理化學(xué)性質(zhì)相同、質(zhì)量不同的同位素?fù)饺雰煞N樣品，混合后不同狀態(tài)的相同蛋白質(zhì)因質(zhì)量差異在質(zhì)譜圖中表現(xiàn)為一對(duì)峰，通過(guò)比較質(zhì)譜

15、峰強(qiáng)弱，精確定位出蛋白質(zhì)不同狀態(tài)下表達(dá)量的變化。這就是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)簽和液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量和鑒定蛋白質(zhì)的理論依據(jù)。 8.線粒體的分離純化基本原則：先制備組織或細(xì)胞勻漿，然后進(jìn)行差速離心，低速去除細(xì)胞核及細(xì)胞碎片；高速離心分離線粒體，有必要還可進(jìn)行密度梯度離心。組織細(xì)胞的特異性及所要線粒體的實(shí)驗(yàn)用途決定了方法的細(xì)節(jié)。這些細(xì)節(jié)包括：勻漿器的選擇、緩沖液的成分、許可混雜其他細(xì)胞器的程度等。通常用Ficoll、Percoll、碘化介質(zhì)（OptiPrep, Nycodenz, metrizamide）和蔗糖來(lái)形成密度梯度進(jìn)一步純化線粒體v 純度鑒定：分離線粒體時(shí)可能混雜其他細(xì)胞器，線粒體的

16、相對(duì)純度可以通過(guò)檢測(cè)線粒體或其他可能存在的細(xì)胞器的標(biāo)志酶來(lái)確定。線粒體純度最好的方法之一是測(cè)定幾種標(biāo)志酶的活性。一方面可檢測(cè)所分離的線粒體是否保留了其生物學(xué)功能，另方面檢測(cè)其他細(xì)胞器污染程度如微粒體、溶酶體等。線粒體組分還可以通過(guò)電子顯微鏡檢查。v 9.1. 富集低豐度蛋白質(zhì)，完善全細(xì)胞蛋白質(zhì)組2. 提供蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息3. 加深對(duì)亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)功能理解4. 加深對(duì)細(xì)胞生理分子機(jī)制的理解5. 亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)譜v 10.1. 細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組學(xué)研究2. 大分子結(jié)構(gòu)體和多蛋白復(fù)合物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究3. 酵母的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究4.核蛋白質(zhì)組的研究11， 蛋白質(zhì)組學(xué)研究任務(wù)研究目

17、的􀂙分離蛋白，顯示差異，將表現(xiàn)型與功能聯(lián)系起來(lái)；􀂙尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用，動(dòng)態(tài)地反映生物體所處的狀態(tài)。12，相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究技術(shù)等樣品"樣品制備"樣品分離"蛋白質(zhì)點(diǎn)提取鑒定"功能確定"生物信息學(xué)"圖像分析13，1）蛋白質(zhì)組樣品制備基本原則􀂙盡可能提高樣品溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失􀂙解除蛋白質(zhì)之間以及與其它生物大分子的相互作用，使蛋白質(zhì)完全處于變性狀態(tài)和還原狀態(tài)􀂙減少對(duì)蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組的人為修飾（假點(diǎn)）􀂙總

18、之：盡可能簡(jiǎn)單，減少步驟v 14.一、樣品制備的前控制v 1. 染色方法的選擇v 采用雙向電泳等方法純化蛋白質(zhì)，往往需要染色后才能準(zhǔn)確獲得用于分析鑒定的樣品。染色方法與蛋白質(zhì)分析的靈敏度高度相關(guān)，染色效果十分重要。v 2. 污染的控制(角蛋白)在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，常見(jiàn)a-角蛋白的污染，主要來(lái)自實(shí)驗(yàn)人員的皮膚屑和頭皮屑。也有b-角蛋白的污染，來(lái)自實(shí)驗(yàn)人員穿著的毛衣。v 2）鹽分和去污劑v 在進(jìn)行質(zhì)譜分析前，應(yīng)特別注意樣品中鹽分和去污劑等含量對(duì)質(zhì)譜分析的影響。MALDI-MS分析技術(shù)可以耐受一定量的小分子雜質(zhì)和鹽類物質(zhì)，但樣品中含有表面活性劑或其他難溶鹽分，則很難產(chǎn)生好的結(jié)晶。v 二.樣品的制備v

19、 操作步驟及注意事項(xiàng)：v （1）切膠和脫色v 切膠前用ddH2O洗膠2次，每次15min.v 用干凈的刀片從膠上切取蛋白點(diǎn)，將膠塊切成1mm3大小，放入200ml Eppendorf管內(nèi)。切膠時(shí)盡量不要超出蛋白點(diǎn)的范圍，膠塊的大小要適當(dāng)。膠塊太小在以后的抽取步驟中可能被吸掉, 太大不利于脫色、酶切、抽取等步驟。v 1）考馬斯亮藍(lán)染色凝膠的脫色v 用50% 乙腈/25mM NH4HCO3 脫至背景無(wú)色（也有用50%甲醇）v 2）銀染凝膠的脫色v 30 mM 鐵氰化鉀與100mM 硫代硫酸鈉用前1：1混合。脫至無(wú)淡黃色溶液產(chǎn)生，吸去溶液，加ddH2O 沖洗。v 脫色后的膠塊用100%乙腈脫水后，真

20、空離心干燥2030min15，一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱,即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 ? (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)

21、酸。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。二、雙縮脲法（Biuret法）蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物，此紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為110ug蛋白質(zhì)。,三Folin酚試劑法（Lowry法）這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑配制較為困難，近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的

22、，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。四、紫外吸收法由于蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用作定量測(cè)定。五、考馬斯亮蘭法（Bradford法）考馬斯亮藍(lán)G250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌５鞍踪|(zhì)含量在01000g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一色素結(jié)合物在 595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測(cè)定。16，二維凝膠電泳基本原理􀂙第一向是等電聚焦，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)不同的分離𙦨

23、9;第二向是SDS-PAGE，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同的分離。􀂙一般采用垂直電泳或水平電泳，兩者差別不大，均適于分子量10-150kd的蛋白質(zhì)。17，二維凝膠電泳圖像分析主要步驟包括圖像掃描、斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建。18，作用原理 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開(kāi)。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分

24、子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。20SWISS-PROT是經(jīng)過(guò)注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，由歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)維護(hù)。數(shù)據(jù)庫(kù)由蛋白質(zhì)序列條目構(gòu)成，每個(gè)條目包含蛋白質(zhì)序列、引用文獻(xiàn)信息、分類學(xué)信息、注釋等，注釋中包括蛋白質(zhì)的功能、轉(zhuǎn)錄后修飾、特殊位點(diǎn)和區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)、與其它序列的相似性、序列殘缺與疾病的關(guān)系、序列變異體和沖

25、突等信息。SWISS-PROT中盡可能減少了冗余序列，并與其它30多個(gè)數(shù)據(jù)建立了交叉引用，其中包括核酸序列庫(kù)、蛋白質(zhì)序列庫(kù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫(kù)等。利用序列提取系統(tǒng)(SRS)可以方便地檢索SWISS-PROT和其它EBI的數(shù)據(jù)庫(kù)。SWISS-PROT只接受直接測(cè)序獲得的蛋白質(zhì)序列，序列提交可以在其Web頁(yè)面上完成。 完整的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)包括序列文件，索引文件以及其它有關(guān)文件。索引文件是根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中作者、參考文獻(xiàn)等建立的，用于數(shù)據(jù)庫(kù)查詢。GenPept是由GenBank中的核酸序列翻譯而得到的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，其數(shù)據(jù)格式為FastA。GenBank中最常用的是序列文件。序列文件的基本單位

26、是序列條目，包括核苷酸堿基排列順序和注釋兩部分。三，論述題1，(1) 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，DNA-AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)⑺鼈兎珠_(kāi)時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近

27、時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)。當(dāng)上述兩種載體

28、所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái)，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。酵母雙雜交的優(yōu)點(diǎn)§ 快速獲得相互作用蛋白的基因§ 只需單一步驟的質(zhì)粒構(gòu)建§ 在體內(nèi)鑒定蛋白的相互作用§ 弱小的，暫時(shí)的相互作用也能鑒定§ 能在整個(gè)時(shí)間段積聚弱小的相互作用信號(hào)缺點(diǎn)§ 假陽(yáng)性是酵母雙雜交系統(tǒng)的最大問(wèn)題§ 假陽(yáng)性通常由以下原因造成:1. prey蛋

29、白的非特異性結(jié)合2. 無(wú)需與誘餌蛋白結(jié)合就能誘導(dǎo)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄（這是大多數(shù)假陽(yáng)性的誘因）（2）噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是在深刻理解噬菌體遺傳學(xué)和生理學(xué)特性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。 其原理是將蛋白質(zhì)文庫(kù)整合到一個(gè)簡(jiǎn)單的噬菌體顆粒中，利用目的蛋白質(zhì)與特異配基的親和力，篩選和配基特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。噬菌體展示技術(shù)一般要經(jīng)過(guò)多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫(kù)中含量很低的與配基特異作用的蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)v 1. 高度選擇性v 2. 可以構(gòu)建大的噬菌體文庫(kù)（1091010），親和純化可在高濃度下進(jìn)行（大于103噬菌體/ml）v 3. 通過(guò)改變洗脫步驟的嚴(yán)格性，來(lái)評(píng)價(jià)融合蛋白結(jié)合的特異性。v 缺點(diǎn)：1. 多價(jià)展示對(duì)于肽

30、段大小的限制2. 蛋白質(zhì)能被細(xì)菌分泌3. 體外實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)在細(xì)菌內(nèi)無(wú)法正確折疊4.融合蛋白會(huì)影響蛋白本身的活性 (3)蛋白質(zhì)親和層析（Pull-down)在一定的條件下，某種蛋白質(zhì)共價(jià)連接在基質(zhì)如瓊脂糖上，用以結(jié)合抽提物中能與該蛋白結(jié)合的配體蛋白。先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用高鹽溶液或SDS洗脫下結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)需要純化，通常簡(jiǎn)單方法是構(gòu)建融合蛋白，常用的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST)，可用谷胱甘肽-瓊脂糖柱純化；Staphylococcus 蛋白A在IgG柱上純化；含His6-Tag的肽段在鎳柱上純化；麥芽糖結(jié)合蛋白可在含直鏈淀粉的柱子上純化。優(yōu)點(diǎn):(1)靈敏度高，在高濃度

31、固定蛋白質(zhì)條件下可檢測(cè)微弱的相互作用（結(jié)合常數(shù)：10-5mol/L, 生理上相關(guān)的最微弱的相互作用在10-3mol/L)(2) 可以同時(shí)檢測(cè)抽提物中所有的蛋白，它們結(jié)合機(jī)會(huì)均等(3) 通過(guò)構(gòu)建突變體，可以檢測(cè)與特異性相互作用有關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基(4) 檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)間的相互作用假陽(yáng)性：（1）電荷間的相互作用使蛋白質(zhì)與檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)合，可以利用帶相同電荷的對(duì)照柱來(lái)消除（2）通過(guò)B蛋白，A蛋白與檢測(cè)蛋白間接結(jié)合（3）兩種蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位不同，但在認(rèn)為條件下，卻能高特異性結(jié)合。(4)免疫共沉淀原理: 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性

32、作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。優(yōu)點(diǎn)（1）檢測(cè)細(xì)胞裂解原液中所有蛋白質(zhì)與檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用（2）抗原、抗體相互作用是在生理濃度下被檢測(cè)的，可排除過(guò)量表達(dá)帶來(lái)的假陽(yáng)性。（3）可檢測(cè)到體內(nèi)形成的天然復(fù)合體（4）天然蛋白質(zhì)如果經(jīng)過(guò)翻譯后修飾，可以檢測(cè)到依賴于或不依賴于修飾

33、的蛋白質(zhì)相互作用缺點(diǎn)：（1）有時(shí)免疫共沉淀的蛋白質(zhì)并非直接相互作用（2）靈敏度不高：抗原濃度低(5)化學(xué)交聯(lián)法如果兩種或兩種以上蛋白彼此間存在特異性的親和性并在生物體內(nèi)可以形成復(fù)合物，可以用該法研究這種相互作用，尤其是瞬時(shí)相互作用。使用一種交聯(lián)試劑，并且在交聯(lián)試劑的光激活部分帶有標(biāo)記，將該試劑共價(jià)耦聯(lián)到一蛋白質(zhì)上，耦聯(lián)物與抽提物一起溫育。若抽提物中的A 蛋白能與耦聯(lián)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，光激活后交聯(lián)劑的一部分就結(jié)合到A 蛋白上。加入還原劑，切割交聯(lián)試劑，使A 蛋白帶有交聯(lián)劑上有標(biāo)記的部分，然后通過(guò)凝膠電泳等方法分析該蛋白。優(yōu)點(diǎn)：（1）能檢測(cè)微弱的相互作用（2）能檢測(cè)到動(dòng)態(tài)過(guò)程不同發(fā)育階段與不同蛋

34、白質(zhì)的瞬時(shí)相互作用（3）通過(guò)能穿膜的交聯(lián)劑。交聯(lián)可在體內(nèi)進(jìn)行缺點(diǎn)：沒(méi)有選擇性2，熒光雙向差異凝膠電泳 一般將能在可見(jiàn)光范圍內(nèi)強(qiáng)烈吸收和輻射出熒光的染料稱為熒光染料。熒光染料實(shí)質(zhì)上是顆粒很細(xì)的熒光染料的樹(shù)脂固體溶液，這些染料有特定的電子共軌體系。熒光雙向差異凝膠電泳是在雙向電泳的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的技術(shù)，將待比較的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)不同的熒光染料標(biāo)記后，等量混合進(jìn)行雙向電泳。 因熒光染料靈敏度高，所需樣品量非常少，每次只需50ug.一張膠可同時(shí)分析3個(gè)樣品，省去了不同膠圖之間的匹配問(wèn)題，節(jié)約時(shí)間，重復(fù)性提高。 還可以對(duì)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，需在每張膠中加入由所有樣品等量混合而成的內(nèi)標(biāo)，以確保各張膠之間對(duì)比的準(zhǔn)

35、確性，以最大限度反映生物學(xué)改變而不是系統(tǒng)改變。由于所需的膠數(shù)減少，分析通量得到了提高。（2）細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)（stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC）培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)，是通過(guò)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝，把穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸引入到蛋白質(zhì)組成中，質(zhì)譜分析質(zhì)量相差6u。這可以大大簡(jiǎn)化質(zhì)譜定量分析前人工處理的復(fù)雜度。目前，可用在培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)上的穩(wěn)定同位素主要包括：2H、13C、15N等。除了在定量比較蛋白質(zhì)組研究方面發(fā)揮作用外，在生化代謝、信號(hào)通路以及蛋白質(zhì)間相互作用動(dòng)力學(xué)研究

36、等方面也有巨大的潛力。缺點(diǎn)：只能用在基于培養(yǎng)的細(xì)胞體系以及單細(xì)胞生物上。1.同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)的原理 同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽試劑由3部分組成：試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)的基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)特異結(jié)合肽鏈中半胱氨酸殘基的巰基；中間的連接子，可以結(jié)合穩(wěn)定的同位素；親和標(biāo)簽-生物素，可以和卵白素結(jié)合，選擇分離同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽標(biāo)記的多肽。由8個(gè)氘原子與8個(gè)氫原子分別ICAT質(zhì)量正好相差8u。（1）優(yōu)點(diǎn) 兼容任何生長(zhǎng)條件下的組織中的蛋白質(zhì)，比較兩種或更多種來(lái)源密切相關(guān)的蛋白質(zhì)樣品，可以得到不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化比例。烷基化反應(yīng)高度特異。只分離含有半胱氨酸的肽段，降低了體系的復(fù)雜性。因?yàn)榉蛛x是在肽段水平上進(jìn)行的，

37、所以膜蛋白溶解性的問(wèn)題得到解決，可以對(duì)膜蛋白進(jìn)行鑒定和定量。因?yàn)橥凰貥?biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)建立在色譜分離的基礎(chǔ)上，任何促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的試劑均可使用。能夠直接鑒定和測(cè)量低豐度蛋白質(zhì)。 （2）缺點(diǎn) 這一方法無(wú)法分析不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)；同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽標(biāo)記（-500u）在整個(gè)質(zhì)譜分析過(guò)程中保留在每個(gè)肽上，會(huì)影響肽段的檢測(cè)和增加數(shù)據(jù)庫(kù)搜索算法的復(fù)雜性，對(duì)一些小的片段（小于7個(gè)氨基酸殘基）更是如此，而對(duì)其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子解析增加了難度；被標(biāo)記的2個(gè)多肽質(zhì)量相差8u、含有2個(gè)半胱氨酸的多肽質(zhì)量相差16u時(shí)與氧化很難區(qū)分，對(duì)定量和鑒定都帶來(lái)困難；一般同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽定量的誤差在20%以內(nèi)，但如果樣品成分復(fù)雜，定量誤差會(huì)增大，并往往需要手工檢測(cè)結(jié)果；這種方法要獲得完整的信息，最重要的是標(biāo)記必